Method Article

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

DOI:

10.3791/56498

⸱

December 8th, 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظهرت الزرد كنموذج قوي من مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان وأداة مفيدة لمجموعة متزايدة من الدراسات التجريبية، التي تغطي الأساسية علم الأحياء التنموي من خلال شاشات الجينية والكيميائية على نطاق واسع. ومع ذلك، العديد من التجارب، لا سيما تلك المتعلقة بالعدوى ونماذج إكسينوجرافت، وتعتمد على microinjection وتصوير الأجنة واليرقات، وهي تقنيات الشاقة التي تتطلب مهارة وخبرة. لتحسين الدقة والإنتاجية الحالية microinjection التقنيات، قمنا بتطوير سلسلة من الأجهزة ميكروستروكتوريد لتوجيه واستقرار الأجنة الزرد في 2 يوما بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) في اتجاه البطني أو الظهرية الجانبية قبل الإجراء. للمساعدة في تصوير الأجنة، صممنا أيضا جهاز بسيط مع القنوات التي توجه الزرد 4 أفقياً جنبا إلى جنب ضد زلة غطاء زجاج. معا، والأدوات التي نحن الحاضرين هنا تبين فعالية النهج فوتوليثوغرفيك لإنشاء الأجهزة مفيدة لتعظيم الاستفادة تقنيات الزرد.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد ظهرت كنموذج قوي للعديد من المجالات، من الدراسات الأساسية البيولوجيا التنموية على نطاق واسع الوراثية والكيميائية شاشات1،2. التلاعبات الجينية الروتينية، مثل ترانسجينيسيس والطفرات كريسبر/Cas9، overexpression الجينات وضربه قاضية تعتمد على microinjection المواد الوراثية في اقحه خلية واحدة، مما أدى إلى وضع بسيطة وسهلة الاستخدام، تجارياً الأدوات المتاحة لتوجيه واستقرار البيض لحقن3. الطرق الأخرى، مثل زرع الأعضاء، والعدوى، غالباً ما تتطلب microinjection في وقت لاحق مرحلة الأجنة واليرقات باستخدام الإبر الشعرية قياس أكبر4. ومع ذلك، استخدام إبر قياس أكبر تحديات كبيرة ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأقر microinjection يرقات "ماساشوستس العام مستشفى اللجنة الفرعية" المعنية "أبحاث رعاية الحيوان" تحت بروتوكول 2011N000127.

1. تصنيع الجهاز

ملاحظة: جميع بمساعدة الكمبيوتر (CAD) ملفات الرسم المستخدمة لتصميم الأقنعة التصويرية الموصوفة هنا (الشكل 1) متوفرة للتحميل. انظر "الجدول للمواد" للروابط.

  1. اختﻻق يفر العفن الرئيسي في غرفة نظيفة 1,000 فئة باستخدام التقنيات القياسية فوتوليثوغرفيك7. للمصفوفات المجهرية وقنوات، نمط مقاوم الضوء السلبية على أساس الإيبوكسي التتابع في 3 طبقات باستخدام أقنعة منفصلة 3، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة: 100 ميكرومتر للميزات الضحلة و ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النهج المذكور هنا يدل على التصميم (الشكل 1) وتصنيع الأجهزة للاستخدام مع 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد، استخدام تقنيات (الشكل 3) لينة معدني وفوتوليثوغرفيك (الشكل 2). يسمح هذا الأسلوب لاختبار السريع العديد من التكرارات التصميم والتعديلات، والتعديلات والأمثل للأبعاد المجهرية للاستخدام مع الزرد في مراحل أخرى من التنمية، ويمكن توسيع نطاق تطبيقها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف الاستخدام الأجهزة وضعنا مؤخرا تيسير إدارة الشرطة الاتحادية 2 الزرد microinjection5، وإدخال جهاز بسيط تركيب مجاناً [اغروس] لتصوير مريحة للأجنة. وتبرز هذه الأدوات الأداة المساعدة فوتوليثوغرفيك تقنيات تصنيع الأجهزة مفيدة لتقنيات الزرد.

أننا وجدنا الأجهزة بدل مفيدة بشكل خاص لحقن الخلايا أو الجزيئات المعرضة للتجميع داخل الإبرة microinjection، مثل كونيديا الفطرية أو الخلايا السرطانية البشرية، التي تتطلب استخدام إبرة تحمل أكبر للتسليم. حقن في حويصلة عتيق (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يود أن يشكر لانجينو ديفيد لسخاء توفير مساحة الحوض؛ إريك ستون، جون مور جيم وتشين تانغ للمساعدة في صيانة الزرد والكواشف، وروبرتسون أن واليوت Hagedorn من مختبر ليونارد زون لشراء سلالة الزرد المستخدمة هنا. كما أنها يود أن يشكر هورتادو أوكتافيو لتقديم المشورة بشأن التقنيات فوتوليثوغرفيك. مولت FE زمالات من مستشفى شرينير للأطفال و "الرابطة الأسترالية الأمريكية". تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة منح GM92804.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
داو كورنينج سيلجارد 184 بولي دي ميثيل سيلوكسان (PDMS)إلسورث أدسيفز184 سيل إيلاست كيت 0.5 كجملصب الأجهزة. تشتمل المجموعة على مونومر PDMS والبادئ درجة
حرارة التبلور المنخفضة الاغاروزSigma AldrichA9414-10Gلصب أجهزة الاغاروز
PFDTS silaneSigma Aldrich448931-10Gلصب قوالب PDMS السلبية
Tricaine (MS-222)Sigma AldrichE10521-10Gلتخدير أسماك الزرد
Rhodamine Dextrann 70،000 DaThermoFisherD1818لتتبع الحقن المجهري
Leukotriene B4 (LTB4)Cayman Chemicals20110الجاذب الكيميائي للعدلات
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)Sigma AldrichF3506-50MGNeutrophil chemoatant
15 سم طبق بتريFisher Scientific08-757-148للصب من الرقاقة الرئيسية
ألواح زجاجية ذات 6 آبارMatTekP06G-0-20-Fلأجهزة التصوير
الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية البورسليكاتالأدوات العلمية العالميةTW-100-4لإبر الحقن المجهري
الماصاتسيجما ألدريتشZ350796لنقل أجنة الزرد
نصائح اللودر الدقيقةE5242956003 فيشر العلميةلتحميل إبر الحقن
لكمة هاريس أحادي النواة 1.5 ممشركة تيد بيلا15111-15لكمة المنافذ في أجهزة التصوير PDMS
رقم 11العلوم الدقيقة10011-00لقطع PDMS
Dumont رقم 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11252-10لإزالة الأجنة وكسر أطراف إبرة الحقن المجهري
Marzhauser MicromanipulatorASIMM33-Rلمعالجة إبرة الحقن المجهري
حاملمغناطيسيMSCSPI - 87242624لتركيب جهاز التحكم في المعالجة الدقيقة
MPPI-3 PicopumpASIMPPI-3للتحكم في حجم الحقن الدقيق وتوقيته المجهر
الفلوري المقلوبEVOS ThermoFisherEVOSFL لتصوير الأجنة المحقونة تشريح
المجهرنيكونSMZ745لتصور برنامج AutoCAD microinjecion
Autodeskقم بتنزيل ملفات AutoCAD من: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 وعلى صفحة wiki الخاصة ببروتوكولات مجتمع ZFIN: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki  
نقل الدقيقة أدوات للمشرط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish MicroinjectionMicrostructured DevicesEmbryo OrientationImaging ChannelsPDMS BlockHair Loop ManipulationPICO PumpFluorescent MicroscopyOtic VesicleNeutrophil Recruitment

Related Articles