Method Article

تعريف العصبية المستندة إلى شبكة الاتصال من بويضات شجيرة الماوس تنمويا المختصة أو غير كفء

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، على بروتوكول لتقييم غير الغازية لاختصاص البويضيه التنموية التي يتم إجراؤها أثناء بهم في المختبر النضج من حويصلة جيرمنال إلى المرحلة الثانية الطورية. يجمع هذا الأسلوب بين الوقت الفاصل بين التصوير الجسيمات الصورة فيلوسيميتري (PIV) وتحليل الشبكات العصبية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عيادات العقم ستستفيد من القدرة على تحديد تنمويا المختصة مقابل بويضات غير كفء باستخدام إجراءات غير الغازية، وبالتالي تحسين نتائج الحمل الشاملة. ونحن مؤخرا بوضع طريقة تصنيف استناداً إلى الملاحظات حية مجهرية من بويضات الماوس أثناء بهم في المختبر النضج من حويصلة جيرمنال (GV) إلى المرحلة الثانية الطورية، يليها تحليل تحركات هيولى وتحدث خلال هذه الفترة الزمني الفاصل. نقدم هنا، بروتوكولات مفصلة من هذا الإجراء. بويضات معزولة عن المسام antral شجيرة ومثقف ح 15 داخل مجهر مجهزة لتحليل الوقت الفاصل بين شركة 37 درجة مئوية و 5%2. التقاط الصور في فواصل زمنية 8 دقيقة. ويتم تحليل الصور باستخدام الأسلوب فيلوسيميتري صورة الجسيمات (PIV) يحسب لكل البويضات، التشكيل الجانبي من "هيولى حركة السرعات" (متجهات) التي تحدث طوال فترة الثقافة. وأخيراً، يتم تغذية متجهات البويضات كل واحد من خلال أداة تصنيف رياضي (شبكات عصبونية اصطناعية تغذية إلى الأمام، والفن) التي تتوقع احتمال مشيج تنمويا مختصة أو غير مختصة بدقة 91.03%. يمكن اختبار هذا البروتوكول، تم إعدادها للماوس، الآن على بويضات أنواع الأخرى، بما فيها البشر.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العقم الإناث هو أمراض التي تؤثر على عدد متزايد من النساء. ووفقا "منظمة الصحة العالمية"، حوالي 20% أزواج المصابين بالعقم، مع 40% بسبب العقم الإناث. وبالإضافة إلى ذلك، أكثر من ثلث النساء تمر علاجات السرطان (300,000 في السنة والسنة 30,000 في الولايات المتحدة الأمريكية أو إيطاليا، على التوالي) وضع سابق لأوانه فشل المبيض.

استراتيجية لمنع العقم لدى مرضى السرطان هو عزلة ونعد جريبات المبيض قبل علاج الأورام، تليها في المختبر النضج (ناقلات) من بويضات غف إلى مرحلة صناعة المعلومات (مرحلة انتقالية غف للوزارة). أن تحسين توافر علامات غير الغازية الكفاءة الإنمائية البويضيه التسميد والعمليات الإنمائية ونجاح الحمل الشاملة1،2.

استناداً إلى التكوين الخاص بها الكروماتين ولاحظ بعد تلطيخ مع فلوروتشرومي سوبرافيتال هويشت 33342، بويضات الثدييات شجيرة تصنف أما محاطة نوية (SN) أو لا تحيط نوية (تسويق)3. بالإضافة إلى منظمتهم الكروماتين مختلفة، عرض هذين النوعين من بويضات العديد من الاختلافات المورفولوجية والوظيفية3،،من45،،من67،8 ،9، بما في ذلك اختصاصها هو والإنمائية. عندما عزل من المبيض ونضجت في المختبر، كل نوع من بويضات الوصول إلى مرحلة صناعة المعلومات، وبعد التلقيح الحيوانات المنوية، تطوير إلى مرحلة 2-الخلية، ولكن فقط تلك مع منظمة الكروماتين SN قد وضع لمدة9. على الرغم من أن جيدة كطريقة تصنيف لاختيار المختصة مقابل بويضات غير كفء، العيب الرئيسي هو تأثير مطفرة فلوروتشرومي نفسها، وقبل كل شيء، الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة للكشف عنها قد يكون على الخلايا.

ولجميع هذه الأسباب، بحثنا عن علامات أخرى غير الغازية المرتبطة بتكيف الكروماتين التعطيل أو تسويق التي يمكنها أن تحل محل استخدام هويشت مع المحافظة على دقة عالية التصنيف نفسه. ملاحظة الوقت الفاصل بين "سرعات الحركة هيولى" (متجهات) تبرز كسمة مميزة لحالة خلية. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات الأخيرة سجلت الرابطة بين متجهات وقت الإخصاب وقدرة الماوس و zygotes البشري الجيني الكامل والتنمية الكاملة ومدتها10،11.

وبناء على هذه الدراسات السابقة، يصف لنا هنا منبرا للاعتراف بالماوس تنمويا المختصة أو غير كفء بويضات شجيرة5،6،،من78. يقوم المنهاج على ثلاث خطوات رئيسية: 1) تصنف بويضات معزولة عن المسام antral أولاً استناداً إلى تكوين الكروماتين أما نوية محاطة (SN) أو نوية يحيط عدم (تسويق)؛ 2) تؤخذ صور الوقت الفاصل بين متجهات التي تحدث أثناء فترة الانتقال غف للوزارة لكل واحدة من البويضات وتحليلها مع الجسيمات الصورة فيلوسيميتري (PIV)؛ و 3) يتم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها مع PIV مع تغذية إلى الأمام مصطنعة العصبية شبكة (الفن) لتصنيف أعمى12،13. يمكننا إعطاء تفاصيل عن الخطوات الأكثر أهمية من الإجراءات المصممة للماوس لجعلها جاهزة متوفرة يمكن اختبارها واستخدامها لأنواع الثدييات الأخرى (مثل الأبقار، والقرد والبشر).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافق جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام واللجان الأخلاقية في جامعة بافيا. وأبقى على الحيوانات تحت ظروف من 22 درجة مئوية، والرطوبة الجوية 60% ودورة الضوء/الظلام من 12:12 ح.

1. عزل المبيض

  1. حقن إينترابيريتونيلي 2 أربع إلى عشر أسبوع CD1 الإناث الفئران مع 10 يو من المسام تنشيط هرمون مع حقنه الأنسولين معقمة 1 مل.
  2. انتظر ح 46-48.
  3. وزن الماوس وتخدير مع حقن العضل 50 مغ/كغ من زوليتيل (كلوريدراتي تيليتامينا وزولازيبان). Euthanize بخلع عنق الرحم.
  4. فهم الجلد الذي يغطي جدار البطن باستخدام زوج من ملقط تشريح. قطع الجلد وفتح جدار الجسم مع زوج من مقص وسحب الشق بالملقط.
  5. استخدام زوج من ملاقط، نقل الشجاعة جانبا، تحديد قرون الرحم وتعريب المبايض في أقصى ما.
  6. بلطف عقد المبيض باستخدام الملقط الساعاتي واستخدام مقص لقطع في أربطة الرحم. كرر مع المبيض الأخرى.
  7. نقل المبيض التي جمعت في طبق بتري ثقافة خلية 35 ملم يحتوي على 1 مل متوسطة العزلة M2 استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 في الهواء.
  8. إزالة الدهون وقناة استخدام مقص جيد تحت ستيريوميكروسكوبي.

2-عزل مجمعات البويضيه Cumulus

  1. ثقب سطح المبيض باستخدام ملاقط معقمة وابرة الأنسولين معقمة ز 1 حتى يتم تحرير مجمعات البويضيه cumulus أنترال (COCs) سلبية.
  2. جمع COCs مع أكثر من ثلاث طبقات من الخلايا الركام باستخدام يسيطر عليها الفم سحبت يد باستور ميكروبيبيتي (200 ميكرومتر في القطر) وتحويلها إلى قطره 300 ميليلتر من جديد M2 المتوسطة.
  3. إزالة الركام الخلايا المحيطة ببويضات استخدام سحب اليد على باستور ميكروبيبيتي (80 ميكرومتر في القطر) بلطف بيبيتينج والخروج لبضع ثوان،
  4. مرارا وتكرارا نقل بويضات من قطره 20 ميليلتر المتوسطة M2 إلى واحد آخر، حتى يتم القضاء تماما على خلايا الركام.

3-الكروماتين البويضيه المستندة إلى منظمة التصنيف

  1. إعداد الحل هويشت 33342 المصبوغة بتركيز 0.05 ميكروغرام/مل في M2 المتوسطة بدءاً من حل أم 5 ملغ/مل مخففة في برنامج تلفزيوني 1 x نهائي.
  2. ضع 3.5 قطرات مايكرو ميليلتر من هويشت تلطيخ الحل في الجزء السفلي من غطاء صحن بتري 35 ملم.
  3. نقل كل البويضات واحدة في هويشت تلطيخ قطره، ضع الطبق على لوحة تدفئة حرارة مسبقاً (37 درجة مئوية) وتغطية ذلك مع غطاء الظلام لتجنب المعرض الضوء.
  4. بعد 10 دقائق من حضانة في درجة حرارة الغرفة، التقيد بويضات مع مجهر الأسفار في 10 X التكبير تحت الأشعة فوق البنفسجية (330-385 nm)، لا يزيد عن 1-2 s.
  5. تصنيف بويضات نوية محاطة (SN) (الشكل 1A)، إذا فإنها تعرض حلقة من الكروماتين هويشت الإيجابية المحيطة نوية.
  6. تصنيف بويضات نوية لا محاطة (تسويق)، إذا لا محاط بهم نوية هويشت إيجابية الكروماتين ويظهر تفريق البقع heterochromatic داخل النواة (الشكل 1B).

4. تصنيف العصبية البويضيه المستندة إلى شبكة الاتصال

  1. إعداد أربعة 2 ميليلتر قطرات من المتوسطة α-الفنزويلية تستكمل مع إبطال الحرارة 5% الجنين المصل البقري، 2 مم L-الجلوتامين، توراين 5 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين، 75 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وبيروفات 23.5 ميكروغرام/ميليلتر الصوديوم في كوب 35 ملم أسفل طبق بيتري وغطاء لهم مع المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) والزيوت المعدنية قبل متوازن لتجنب التبخر متوسطة.
    ملاحظة: إذا كان استخدام نظام فحص الخلايا حية، تبقى القطرات على مسافة معينة باستخدام شبكة تعادل 7 مم × 7 ملم كمبدأ توجيهي.
  2. نقل 3-4 بويضات لكل قطره.
  3. ضع أسفل الزجاج طبق بيتري في نظام فحص الخلية حية، مجهزة بتسجيل الوقت الفاصل بين البرامج (انظر الجدول للمواد)، والذي يسمح مراقبة نضوج البويضات في بيئة ذات درجة حرارة ثابتة (37 درجة مئوية) وشركة2 تركيز (5%).
  4. فتح تسجيل الوقت الفاصل بين البرامج. على الشاشة تظهر نافذة برصاصة حية البويضيه على الجانب الأيسر وجميع الأزرار الإعداد على الجانب الأيسر.
  5. حدد مركز البويضيه لوضعه في مركز الشاشة. ضبط التركيز إذا لزم الأمر.
  6. حدد الزر الأس الهيدروجيني وتعيين ضياء المصباح إلى 192؛ زمن التعرض إلى 1/125 s؛ الحصول إلى 1.99؛ و القرار 1600 ×1200.
  7. حدد FL2 وتعيين ضياء المصباح إلى 5؛ زمن التعرض إلى 3 ق؛ الحصول على 2.37؛ و القرار 1600 ×1200.
  8. حدد الزر نقطة جديدة من أجل تسجيل موقف البويضات داخل قطره الثقافة. كرر نفس الروتينية لكل البويضات داخل قطره الثقافة.
  9. حدد الوقت وتعيين دورة اقتناء 8 دقيقة و الوقت الإجمالي الذي ح 15.
  10. حدد تاريخ بدء الوقت الفاصل بين لبدء دورة تسجيل.
  11. فتح برنامج MATLAB وكتابة >>cell_piv؛ ثم قم بتحديد أداة PIV.
  12. اختر المجلد الذي يحتوي فيلم مسجل وقم بتحديد أي من ملفات.jpeg لتحميل تسلسل الصورة بأكملها. لكل البويضات، حدد المنطقة التي تهم (ROI) بواسطة النقر فوق حدد أداة المساحة.
  13. حدد PIV العملية في القائمة ملف. حدد الزر أداة عارض .
    ملاحظة: البرنامج سيقوم بحساب متجهات السرعة في العائد على الاستثمار وينتج تلقائياً ملف بيانات، يتم حفظها كملف.mat.
  14. حدد الملف.mat لفتح. حدد الزر أداة "تحديد العائد على الاستثمار" ، ورسم دائرة حول الخطوط العريضة للبويضات. انقر فوق حفظ ضمن القائمة ملف.
    ملاحظة: يتم الآن عرض ناقلات المرض في هذه المنطقة، وتحديث البيانات حجم متوسط في نافذة الرسم البياني لهذا العائد على الاستثمار الجديد.
  15. فتح البيانات المجمعة متوسط حجم الإطارات الوقت الفاصل بين كل سجلت في جدول بيانات، مع، في الصفوف، تسلسل الإطار، وعلى الأعمدة، كل البويضات واحدة تحليل.
  16. تنظيم بيانات بويضات الزلزالين والتعطيل إلى 10 مجموعات فرعية.
  17. استخدام 9 مجموعات فرعية لتدريب الشبكة العصبية الاصطناعية تغذية إلى الأمام تكراري (الفن) والفرعي 1 لاختبار أعمى.
    1. تكرار آخر 9 مرات، تغيير نموذج اختبار أعمى (إذ الصليب-التحقق من الصحة).
  18. MATLAB بفتح وتشغيل برنامج نصي مخصص الصنع الرئيسية ، وبناء على طلبها، بإدراج اسم الملف مع البيانات التدريب (train.txt)، عدد بويضات الزلزالين والتعطيل التي تستخدم للتدريب والفاصل الزمني للوقت الفاصل لتحليل (عادة، من الإطار رقم 1-2 الإطار # 112-113).
  19. اضغط إدخال لأداء التدريب.
  20. إدراج اسم الملف الذي يحتوي بيانات الاختبار (test.txt).
  21. فتح متجه test_outputs_cyt في MATLAB مساحة العمل.
    ملاحظة: تظهر نافذة على شاشة عرض، في الصف الأول، أن احتمال الحصول على إيجابيات حقيقية (TP أو تسويق الحقيقية) والمغلوطة (FP أو تسويق كاذبة) لبويضات الزلزالين والتعطيل، على التوالي؛ بدلاً من ذلك، في الصف الثاني، أن احتمال الحصول على سلبيات كاذبة (FN أو التعطيل كاذبة) والسلبيات الحقيقية (TN أو التعطيل الحقيقي) لبويضات الزلزالين والتعطيل، على التوالي.
  22. باستخدام الصيغة: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN)، حساب دقة الفن، معبراً عنه بنسبة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 2 البويضيه تنمويا المختصة وغير كفء ممثل، على التوالي في البداية (GV) وفي نهاية الإجراء ناقلات الأمراض (الوزارة). ناقلات الأمراض بويضات الماوس شجيرة يحدث خلال الثقافة ح 15. ملاحظة الوقت الفاصل بين سجلات تقدم الانقسام والكشف عن الأحداث هو الرئيسية، بما في ذلك جفبد وقذف الجسم القطبي الأول.

وأظهر تحليل ومقارنة تنمويا المختصة مقابل أكثر من 200-بويضات غير كفء فروق التوقيت في التقدم لل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك عدة خطوات حاسمة واحدة يجب العناية أثناء تنفيذ هذا البروتوكول مع بويضات الماوس وكذلك مع تلك الأنواع الأخرى. مرة واحدة معزولة عن تلك المسام، بويضات ينبغي نقلها فورا إلى قطرات التسجيل، كما الفصل من الركام رفيق الخلايا المشغلات بداية الانتقال غف لوزارة صناعة المعلومات. إمكانية إدخال تعديل على هذا البروتوكول يمكن إضافة 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (إيبمكس) M2 الوسيلة المستخدمة لعزل COCs. إيبمكس يمنع تحريك فوري الانتقال غف لصناعة المعلومات ويسمح لمزامنة مجموعة تجريبية كاملة من بويضات.

نظام فحص الخلية ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقدم هذا العمل ممكناً بفضل دعم من: جامعة بافيا الغواتيمالية عام 2016؛ جامعة بارما سن الفيل عام 2014، عام 2016؛ و Kinesis لتوفير بلاستيكواري اللازمة للاضطلاع بهذه الدراسة. ونحن نشكر الدكتور شين وندسور (كلية الهندسة، جامعة بريستول، المملكة المتحدة) لتوفير البرمجيات Cell_PIV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FolligonIntervetA201A02العلاج الهرموني
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261لتلوين البويضات غير المتجانسة الكروماتين
ثقافة الخلايا طبق بيتري 35 مم × 10 مم & nbsp ؛كورنينج 430165لعزل COCs
EmbryoMax M2 Medium (1X) ، سائل ، مع الفينول الأحمرMerck-MilliporeMR-015-Dلعزل COCs
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax & nbsp ؛Sigma-AldrichM4526للبويضة في النضج في المختبر
زراعة الخلايا Petri-Dish 35 مم قاع زجاجي   ؛WillCo GWSt-3522لتجارب التصوير BioStation
IM-LM & nbsp ؛نيكونMFA91001نظام فحص الخلايا الحية 
ماصة باستورDelchimica الأواني الزجاجية العلمية6709230للتلاعب بالبصيلات
الزيوت المعدنيةSigma-AldrichM8410لمنع التلوث والتبخر المتوسط
البنسلين / StreptomycinLife Technologies15070063لمنع التلوث المتوسط   ؛
مصل الأبقار الجنينية (FBS)سيجما ألدريتشML16141079للمكياج & ألفا; MEM متوسط 
L-الجلوتامين لايف تكنولوجيز25030للمكياج α MEM متوسط 
التورينسيجما ألدريتشT0625للمكياج & MEM متوسط 
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتشA3310للمكياج & MEM وسائل الإعلام
بيروفات الصوديوم  سيجما ألدريتش  P4562للمكياج & MEM media
Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)Virbac SrlQN01AX9للفئران التخدير
Cell_PIV sofware تفضل بتقديم الدكتور شين وندسور ، جامعة بريستول ، المملكة المتحدة  ؛                            -                             -
MATLABThe MathWorks ، Natick ، MA                              -للحوسبة العددية متعددة النماذج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
  3. Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
  4. Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380(2013).
  5. Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
  6. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
  7. Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
  8. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  9. Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
  10. Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417(2011).
  11. Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
  12. Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
  13. Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse OocytesCytoplasmic Movement VelocitiesTime Lapse ImagingParticle Image VelocimetryFeed Forward Neural NetworkGerminal VesicleMetaphase IIOocyte IsolationHoechst StainingDevelopmental Competence

Related Articles