مقالة منهجية

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

DOI:

10.3791/56688

⸱

ديسمبر 14, 2017

 , 
1Laboratory of Brain and Neurological Disorders, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Laboratory of Neuropathology and Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الدراسة توضح طريقة بسيطة للكشف عن مستويات الذاتية من الفسفرة Rab10 بالغنية لوسين تكرار كيناز 2.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطفرات في الغنية لوسين تكرار كيناز 2 (LRRK2) تبين أن تكون مرتبطة بمرض باركنسون الأسرية (FPD). منذ التنشيط غير طبيعي لنشاط كيناز LRRK2 قد تورط في الآلية المرضية لشعبة المشتريات، من الضروري وضع طريقة تقييم مستويات الفسيولوجية للنشاط كيناز من LRRK2. وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن LRRK2 فوسفوريلاتيس أفراد الأسرة Rab جتباسي، بما في ذلك Rab10، في ظل الظروف الفسيولوجية. على الرغم من الفسفرة Rab10 الذاتية التي LRRK2 في الخلايا المستزرعة يمكن الكشف عنها بواسطة الكتلي، كان من الصعب أن الكشف عن ذلك إيمونوبلوتينج وبسبب حساسية أجسام محددة الفسفرة المتاحة حاليا للفقراء Rab10. وهنا، يمكننا وصف بسيط الأسلوب للكشف عن مستويات الفسفرة Rab10 من LRRK2 الذاتية استناداً إلى إيمونوبلوتينج استخدام الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) جنبا إلى جنب مع علامة ربط الفوسفات (P--علامة)، التي ن-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N،ن '،ن'-تريس (بيريدين-2-يل-الميثيل) ديامينوبروبان-1، 3--2-الرتب الأخرى. هذا البروتوكول لا يشكل مثالاً للمنهجية التي تستخدم علامة ف فحسب بل يمكن أيضا تقييم كيف يغير الطفرات، فضلا عن العلاج المانع والإدارة أو أي عوامل أخرى مما يشير إلى المصب من LRRK2 في الخلايا والأنسجة .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PD واحدة من الأمراض الأكثر شيوعاً التي الأعصاب، يغلب التي تؤثر على الخلايا العصبية تتميز في midbrain، أسفر عن الخلل في أنظمة المحركات في كبار السن1. بينما يطور معظم المرضى PD بطريقة متقطعة، وهناك أسر وراثة المرض. الطفرات في الجينات عدة وجدت لتكون مرتبطة مع FPD2. من الجينات المسببة ل FPD، LRRK2، التي كانت ثمانية مغلطه الطفرات (N1437H و R1441C/G/H/S، Y1699C، G2019S و I2020T) ترتبط FPD المهيمن موروثة التي تسمى PARK8 حتى الآن عن3،،من45. أيضا حددت العديد من الدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جواس) متفرقة PD المرضى الاختلافات الجينية في محور LRRK2 كعامل خطر لشعبة المشتريات، مما يوحي بأن الشذوذ في وظيفة LRRK2 سبب شائع نيوروديجينيريشن في كل متفرقة و PARK8 FPD6،،من78.

LRRK2 بروتين كبير (الأحماض الأمينية 2,527) تتكون من مجال تكرار الغنية leucine، Ras غتب-ملزم للبروتينات المعقدة (ROC) المجال، ج-محطة ROC (COR) المجال والمجال كيناز البروتين سيرين/ثريونين، و مجال تكرار WD409. قم بتحديد موقع الطفرات FPD الثمانية في هذه المجالات الوظيفية؛ N1437H و R1441C/G/H/S في المجال ROC، Y1699C في المجال COR، G2019S و I2020T في مجال كيناز. منذ الطفرة G2019S، الذي يوجد أغلب الأحيان طفرة في PD المرضى10،،من1112، يزيد من نشاط كيناز LRRK2 من 2-3 إضعاف في المختبر13، هو الافتراض بأنه أن الزيادة غير طبيعية في الفسفرة LRRK2 substrate(s) سامة للخلايا العصبية. ومع ذلك، كان من المستحيل لدراسة ما إذا كان يتم تبديل الفسفرة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة LRRK2 ركائز في الأسرية/متفرقة PD المرضى بسبب عدم وجود أساليب تقييم ذلك في عينات المرضى المشتقة.

عموما الكشف عن الفسفرة البروتين بواسطة immunoblotting أو المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) استخدام الأجسام المضادة على وجه الخصوص الاعتراف بدولة فوسفوريلاتيد للبروتينات أو بواسطة التحليل الشامل والمطيافيه. ومع ذلك، الاستراتيجية السابقة في بعض الأحيان لا يمكن تطبيق بسبب الصعوبات في إيجاد الأجسام المضادة الفسفرة محددة. وسم الأيضية للخلايا مع الفوسفات المشعة خيار آخر فحص مستويات الفيزيولوجية من الفسفرة عندما لا تكون الأجسام المضادة الفسفرة محددة متاحة بسهولة. بيد أنه يتطلب كمية كبيرة من المواد المشعة، وذلك ينطوي على بعض المعدات المتخصصة للإشعاع14. التحليل الشامل والمطيافيه هي أكثر حساسية بالمقارنة مع هذه الأساليب عن وأصبحت شعبية في تحليل البروتين الفسفرة. بيد أن إعداد عينة مضيعة للوقت ومكلفة الصكوك مطلوبة من أجل التحليل.

مجموعة فرعية من جتباسي رب الأسرة بما في ذلك Rab10 و Rab8 أفيد مؤخرا كركائز الفسيولوجية المباشرة ل LRRK2 استناداً إلى نتيجة ل تحليل واسع النطاق فوسفوبروتيوميك15. ثم أثبتنا أن الفسفرة Rab10 زيد ب FPD الطفرات في الخلايا الليفية الجنينية الماوس وفي رئات الفئران16knockin. وفي هذا التقرير، اخترنا أن توظف صوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)-على أساس الأسلوب الذي جزيء فعلامه مبلمرة اشتركت في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية (فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) للكشف عن مستويات الذاتية الفسفرة Rab10، لأنه كان لا يزال يفتقر إلى جسم حساسة للغاية محددة ل Rab10 فوسفوريلاتيد. ونحن قد أخفقت في الكشف عن الفسفرة Rab8 الذاتية بسبب الانتقائية الفقراء من الأجسام المضادة المتاحة حاليا لمجموع Rab8. ولذلك، قررنا أن نركز على الفسفرة Rab10. LRRK2 فوسفوريلاتيس Rab10 في Thr73 مكان في منتصف المنطقة المصانة عاليا "التبديل الثاني". الحفظ عالية من مواقع الفسفرة بين البروتينات Rab قد يكون واحداً من الأسباب التي تجعل الأجسام المضادة فوسفوسبيسيفيك الاعتراف بالبروتينات Rab متميزة صعبة لجعل.

الفسفرة Rab8A حسب LRRK2 يحول دون ربط Rabin8، عامل تبادل النوكليوتيدات جوانين (مرفق البيئة العالمية) الذي ينشط Rab8A عن طريق تبادل منضم الناتج المحلي الإجمالي مع أنشئ15. كما يمنع الفسفرة Rab10 و Rab8A ب LRRK2 ربط مثبطات الانفصال من الناتج المحلي الإجمالي (جديس)، التي تعتبر أساسية لتفعيل Rab البروتينات عن طريق استخراج البروتينات Rab الناتج المحلي الإجمالي زمنياً من الأغشية15. مجتمعة، هو الافتراض بأن الفسفرة Rab البروتينات التي LRRK2 يمنعهم من التنشيط على الرغم من أن الآلية الجزيئية الدقيقة والآثار الفسيولوجية الفسفرة ما زالت غير واضحة.

فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة اخترعها كينوشيتا et al. في عام 2006: في هذا الأسلوب، اقترن الاكريلاميد تساهمي مع فالعلامه، والهلام جزيء التقاط الفوسفات مع تقارب عالية، الذي كوبوليميريزيد في صحيفة بيانات السلامة-الصفحة17. لأن الجزيئات فالعلامه في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تؤخر بشكل انتقائي التنقل الغرواني الكهربي للبروتينات فوسفوريلاتيد، فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يمكن فصل البروتينات فوسفوريلاتيد من غير فوسفوريلاتيد منها (الشكل 1). إذا كان هو فوسفوريلاتيد البروتين من الفائدة على بقايا متعددة، سيجري الاحتفال بسلم للفرق المقابلة لأشكال خلطات فوسفوريلاتيد. وفي حالة Rab10، نلاحظ الفرقة تحول واحد فقط، مما يشير إلى أن Rab10 هو فوسفوريلاتيد فقط في Thr73. الميزة الرئيسية للعلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة على مدى إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة الفسفرة محددة أن Rab10 فوسفوريلاتيد ويمكن الكشف عنها بواسطة إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة غير الفسفرة محددة (أيالاعتراف مجموع Rab10) بعد نقله في الأغشية، وهو عموما أكثر تحديداً، وحساسة، والمتاحة من المصادر التجارية/الأكاديمية. وهناك ميزة أخرى لاستخدام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أنه يمكنك الحصول على تقدير تقريبي ستويتشيوميتري الفسفرة، التي من المستحيل إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة الفسفرة محددة أو بوصفها الأيضية للخلايا مع المشعة الفوسفات.

وبصرف النظر عن الاستخدام غير مكلفة فالعلامه الاكريلاميد وبعض التعديلات الطفيفة المتعلقة به، يتبع الأسلوب الحالي للكشف عن الفسفرة Rab10 من LRRK2 عامة بروتوكول إيمونوبلوتينج.ولذلك، ينبغي واضحة وقابلة للتنفيذ بسهولة في أي المختبرات حيث إيمونوبلوتينج ممارسة معتادة، مع أي من أنواع العينات بما في ذلك البروتينات المنقاة، ليساتيس الخلية والأنسجة هوموجيناتيس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد عينة لمخزونات النشر الاستراتيجي – الصفحة P-العلامة

  1. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام من 10 سم الأطباق التي تزرع الخلايا باستخدام شفط غسل الخلايا مع 5 مل دولبيكو مخزنة الفوسفات المالحة (دببس) بأول دببس إضافة إلى جانب الأطباق لتجنب الإخلال بطبقة الخلايا وصخرة الأطباق مرة أخرى يدوياً وعليها عدة مرات.
  2. إزالة وتجاهل دببس استخدام شفط إضافة 2 مل التربسين 0.25% (w/v) المخفف في دببس وروك بلطف الأطباق لتغطية طبقة الخلية. وضعت الأطباق شركة حاضنة2 (37 درجة مئوية، والجو هوميديفيد، 5% CO2) لمدة 5 دقائق.
  3. وبعد بيبيتينج صعودا وهبوطاً باستخدام ماصة المتاح لتفريق الخلايا المنفصلة، جمع تعليق خلية في أنبوب 15 مل وقياس كثافة الخلية باستخدام هيماتوسيتوميتير تحت مجهر18.
  4. تمييع الخلايا إلى5 2.5 × 10 خلايا/مل مع تعديل النسر المتوسطة دولبيكو (دميم) تستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين. إضافة 2 مل (5 × 105 خلايا) من تعليق خلية المخفف لكل بئر من لوحات 6-جيدا.
  5. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO (37 درجة مئوية، والجو هوميديفيد، 5% CO2).
  6. تعداء إلى خلايا HEK293
    ملاحظة: إذا كان الفسفرة Rab10 الذاتية لفحصها، انتقل إلى الخطوة 1، 7. يمكن الحصول على البلازميدات المستخدمة في هذا البروتوكول من المؤلفين عند الطلب. انظر تسلسل الجدول للمواد للحصول على معلومات موجزة و الشكل S1 لعينات من الحمض النووي.
    1. اليكووت 200 ميليلتر من دميم في أنابيب 1.5 مل.
    2. لكل أنبوبة، إضافة كلا ميكروغرام 0.266 (تركيز النهائي 1.33 ميكروغرام/مل) من بلازميد ترميز Rab10 هكتار و 1.066 ميكروغرام (تركيز النهائي 5.33 ميكروغرام/مل) بلازميد الترميز 3 × LRRK2 العلم من 500 ميكروغرام/مل بلازميد الأرصدة. ثم قم بإضافة 4 ميليلتر من الحل 1 ملغ/مل من بولييثيلينيميني (حله في 20 مم هيبيس-هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.0) ومزيج الحل فورا قبل فورتيكسينج ل 5 ق.
    3. واسمحوا أنابيب الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وإضافة محتوى أنبوب واحد دروبويسي لواحد أيضا استخدام ميكروبيبيتي. روك بلطف ويدويًا لوحات الثقافة ذهابا وإيابا عدة مرات للسماح الخليط تعداء منتشر بالتساوي في جميع أنحاء البئر.
  7. السماح للخلايا تنمو لآخر 24-36 ساعة في حاضنة2 CO (37 درجة مئوية، والجو هوميديفيد، 5% CO2).
  8. إذا كان الفسفرة Rab10 الذاتية لفحصها، يعامل الخلايا مع أو بدون LRRK2 مثبطات ح 1 قبل ليسينج الخلايا.
    1. إعداد حلول الأسهم من مثبطات LRRK2 بتذويب مثبطات في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في 10 ملم. ونحن نوصي باستخدام 2 معهد الطب العدلي و GSK2578215A، وهما مثبطات LRRK2 محددة للغاية وقوية. حلول تخزين المخزون في-80 درجة مئوية.
    2. إعداد مخزون العامل مثبطات بتمييع حلول الأسهم مع [دمس]: لمعهد الطب العدلي-2، إعداد 10 ميكرون و 30 ميكرومتر على LRRK2 الذاتية وأوفيريكسبريسيد، على التوالي. ل GSK2578215A، إعداد 1 و 3 ملم على LRRK2 الذاتية وأوفيريكسبريسيد، على التوالي.
    3. إضافة 2 ميليلتر على أرصدة العامل في معهد الطب العدلي-2 أو GSK2578215A إلى منتصف أحد جيدا باستخدام ميكروبيبيتي ولطف الصخور اللوحة يدوياً ذهابا وإيابا عدة مرات للسماح لمثبطات منتشر بالتساوي في جميع أنحاء البئر.
    4. إضافة 2 ميليلتر من [دمس] إلى بئر مختلفة كعنصر سلبي بطريقة مشابهة لمثبطات في خطوة 1.8.3.
    5. وضع اللوحات العودة إلى الحاضنة والثقافة الخلايا ح 1.
  9. الخلايا.
    1. وضع لوحات الثقافة على الجليد. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام. غسل الخلايا بأول مل 2 إضافة دببس إلى جانب الأطباق لتجنب الإخلال الخلية طبقة والصخور يدوياً الأطباق ذهابا وإيابا عدة مرات.
    2. إزالة وتجاهل في دببس، وإضافة إلى ميليلتر خلايا 100 من المخزن المؤقت تحلل (50 مم تريس-HCl pH 7-5، 1% (v/v) polyoxyethylene(10) أوكتيلفينيل الاثير، 1 مم عطا (جليكول-bis(2-aminoethylether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic)، أورثوفاناداتي الصوديوم 1 ملم، 50 ملم فلوريد الصوديوم، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، بيروفوسفات صوديوم 5 مم، 0.1 ميكروغرام/مل ميكروسيتين LR، السكروز 270 مم، ومثبطات البروتياز كوكتيل).
    3. إمالة، لوحات على الجليد وتتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة خلية جمع قدر خلية قدر الإمكان. جمع ليساتيس استخدام ميكروبيبيتي في أنابيب 1.5 مل (مبردة مسبقاً على الجليد).
      تنبيه: LR ميكروسيتين يمكن أن تكون قاتلة إذا ابتلع أو على اتصال بالجلد.
  10. تسمح هذه الأنابيب الوقوف على الجليد لمدة 10 دقائق لتحلل كامل. توضيح ليساتيس خلية بالطرد المركزي (20,000 ز ×، 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية) ونقل supernatants الجديدة 1.5 مل أنابيب مبردة مسبقاً على الجليد.
  11. قياس تركيز البروتين ليساتيس المطهرة (ميكروغرام/ميليلتر) بفحص برادفورد.
    1. ألبومين المصل البقري بإعداد معايير (BSA) (0.2 و 0.4، 0.6، 0.8 و 1 ملغ/مل) بتمييع الحل الأسهم مع الماء المقطر. تمييع ليساتيس الخلية الممسوحة بفحص مع الماء المقطر.
    2. وضع 5 ميليلتر/جيدا للمعايير جيش صرب البوسنة، فارغة (الماء المقطر)، وكل خلية المخفف ليساتي في لوحة 96-جيدا في ثلاث نسخ.
    3. إضافة من الكاشف المقايسة برادفورد باستخدام 12-قناة ميكروبيبيتي 150 ميليلتر/جيدا والسماح للوحة تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. قياس امتصاص في 595 نانومتر على قارئ لوحة ومقارنة بالمعايير جيش صرب البوسنة.
  12. إعداد 100 ميليلتر من عينات للحزب الديمقراطي الصربي صفحة. هو تركيز البروتين العينات 1 ميكروغرام/ميليلتر أوفيريكسبريسيد ها-Rab10 و 2 ميكروغرام/ميليلتر ل Rab10 الذاتية.
    1. استخدام تركيزات محددة كمياً من الخطوة 1.11.4، حساب الحجم (ميليلتر) ليساتيس الخلية يساوي 100 ميكروغرام (أوفيريكسبريسيد ها-Rab10) أو 200 ميكروغرام (Rab10 الذاتية) بتقسيم كمية البروتين (ميكروغرام 100 أو 200 ميكروغرام) بتركيز البروتين ليساتيس (μ ز/ميليلتر).
    2. إضافة 25 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت 4 × لايمملي (مم 62.5 تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 8% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 40% (v/v)، والأزرق bromophenol 0.02% (w/v)، 4% (v/v) β-ميركابتوثانول) إلى أنابيب 1.5 مل جديدة تحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة حجم المحسوبة الخلية ليساتيس لكل أنبوب ومزيج من فورتيكسينج ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    4. إحضار الحجم الإجمالي إلى 100 ميليلتر مع المخزن المؤقت لتحلل ومزيج من فورتيكسينج ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  13. الملحق مع 10 مم2 من الحركة إخماد عامل شيلاتينغ. أضف 1 ميليلتر من الحركة 500 ملم2. مزيج من فورتيكسينج ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد لا تكون العينات التي تحتوي على الحركة2 مناسبة للحزب الديمقراطي الصربي-صفحة عادية.
هذه الخطوة غير مطلوبة بسبب وجود عامل شيلاتينغ (مثل حمض الإيثيلين (يدتا)، عطا، إلخ) في المخزن المؤقت لتحلل. خلاف ذلك، سوف يمكن فصلها Mn2 + الأيونات بالإضافة إلى الاكريلاميد فالعلامه عملاء شيلاتينغ، والعلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لن تعمل بشكل صحيح.
  • تغلي جميع العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتخزين العينات أدناه-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. ويمكن تخزين العينات مغلي ما يصل إلى 6 أشهر على الأقل.

    • 2-صب المواد الهلامية لمخزونات النشر الاستراتيجي – صفحة فعلامه

    ملاحظة: ينبغي الجل في اليوم نفسه كتشغيل المواد الهلامية. ويمكن إجراء الجل تحت ظروف الإضاءة المحيطة.

    1. إعداد 5 مم فالعلامه الاكريلاميد الأسهم الحل بأول حل 10 ملغ من مسحوق/خالص فالعلامه الاكريلاميد تماما مع 100 ميليلتر من الميثانول وثم يصل إلى 3.3 مل بإضافة الماء المقطر مزدوجة.
      ملاحظة: اكريلاميد فالعلامه حساسة للضوء. يجب تخزين الحل المعدة في الظلام في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    2. لوحات نظيفة عادي وحقق برش الإيثانول 70% والمسح بمنشفة ورقية. تجميع لوحات هلام. أبعاد لوحات جل المستخدمة في هذا البروتوكول خاصة هي 80 أو 100 ملم طويلة من 100 مم. يتم وضع السليكون تنظيف الفواصل بين عادي وهي فرضت مسنن لوحات ولوحات تجميعها مع مقاطع الموثق.
      ملاحظة: يمكن استخدام أي نوع من لوحات جل هذا العمل للحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية.
    3. وضع مشط لاستخدامها (المشط البلاستيك 17-جيدا) في لوحات جل تجميعها وعلامة على لوحة جل موضع الجزء السفلي من الآبار مع علامة دائمة.
    4. إعداد 10 مل مخلوط هلام الاكريلاميد 10% (الاكريلاميد 10% (w/v) (acrylamide:bis-اكريلاميد = فيها)، 375 مم تريس-HCl (pH 8.8)، 0.1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي) في أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: قد تختلف عن تركيز الاكريلاميد الأمثل والكواشف المستخدمة. فوق كبريتات الأمونيوم وتيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) (الجزائرية) لا ينبغي أن يضاف في هذه المرحلة.
    5. إضافة 100 ميليلتر من الاكريلاميد علامة الرتبة ف-5 مم و 10 ميليلتر م 1 الحركة2 الحلول النهائية تركيزات 50 ميكرون و 100 ميكرومتر، على التوالي.
      ملاحظة: قد أيضا تختلف التركيزات المثلى من الاكريلاميد فالعلامه والحركة2 حسب والكواشف المستخدمة.
    6. إضافة 15 ميليلتر من تيميد إلى خليط جل بتركيز 0.15% (v/v) نهائياً وثم 50 ميليلتر من 10% (w/v) وكالة الأنباء الجزائرية بتركيز 0.05% (w/v) نهائي. مزيج جيد من قبل بلطف يحوم الأنبوب 5 s وصب في لوحات تجميعها فورا حتى ارتفاع أدناه 2 مم هو الموقف ملحوظ في الخطوة 2، 3.
    7. الطبقة 2-بروبانول على حل جل لشد الجزء العلوي من فصل المواد الهلامية بلطف.
    8. واسمحوا المواد الهلامية الوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فإنه ليس من الضروري لحماية المواد الهلامية من الضوء.
      ملاحظة: قد يستغرق وقتاً أطول للمواد الهلامية لتعيين تحت درجة حرارة الغرفة الباردة. ولﻵﻻت هلام الخليط قبل إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية يساعد على الإسراع بهذه الخطوة. ولهذا الغرض، يمكن إعداد خليط جل في قارورة Erlenmeyer 100-200 مل متصلاً شفط. ديغا الحل لمدة 10 دقائق.
    9. إزالة الطبقات 2-بروبانول بامتصاص مع منشفة ورقية.
    10. أغسل المساحة أعلى من المواد الهلامية بملء المساحة بماء مقطر من زجاجة غسيل وتجاهل المياه التي تتدفق خارج حوض. تكرار الغسيل 3 مرات.
    11. إزالة بقايا المياه المتبقية في مساحة أكبر من المواد الهلامية بامتصاص مع منشفة ورقية.
    12. إعداد 3 مل مزيج هلام الاكريلاميد 4% (الاكريلاميد 4% (w/v) (ج: crylamide:bis-اكريلاميد = فيها)، 125 ملم تريس-HCl (6.8 درجة الحموضة)، 0.1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي) في أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: لا إضافة الاكريلاميد فالعلامه أو الحركة2 الحل إلى خليط جل التراص.
    13. إضافة 7.5 ميليلتر من تيميد وميليلتر 24 10% (w/v) وكالة الأنباء الجزائرية بتركيزات نهائية من 0.25% (v/v) و 0.08 في المائة (w/v)، على التوالي. مزيج جيد من قبل بلطف يحوم الأنبوبة s وصب الخليط على رأس جل فصل 5. فورا كومز المناسبة (17-جيدا امشاط من البلاستيك التي تستوعب ما يصل إلى 25 ميليلتر من العينات، على سبيل المثال).
    14. واسمحوا المواد الهلامية الوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فإنه ليس من الضروري لحماية المواد الهلامية من الضوء. بعد تعيين المواد الهلامية التراص، تشغيلها دون مزيد من التخزين.

    3-الحزب الديمقراطي الصربي – صفحة و Immunoblotting

    1. إزالة الامشاط من المواد الهلامية. قم بإزالة الفواصل السيليكون ومن ثم مقاطع من المواد الهلامية.
    2. وضع المواد الهلامية مسبوك في جل الدبابات وإصلاحها الهلام للدبابة لقط مع مقاطع الموثق.
    3. من أجل تشغيل المخزن المؤقت (25 مم تريس، 192 مم جليكاين، 0.1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي) في السفلي والعلوي من المواد الهلامية. تنظيف الآبار بمسح المخزن المؤقت قيد التشغيل باستخدام 5 مل حقنه وابرة ز 21 لإزالة قطعة هلام.
    4. إزالة فقاعات الهواء من المساحة أسفل من الجل استخدام إبرة بنت تعلق على حقنه. جعل إبرة بنت، يدوياً ثني إبرة ز 21 في منتصف الإبرة حتى تصبح الزاوية بين الطرف وقاعدة الإبرة 30-45 درجة مئوية.
    5. تدور أسفل رواسب تسبب بإضافة الحركة2 في 20,000 × ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحصول على عينات واضحة.
    6. تحميل 10 ميكروغرام البروتينات للكشف عن الفسفرة Rab10 أوفيريكسبريسيد و 30 ميكروغرام البروتينات ل Rab10 الذاتية.
      ملاحظة: من المهم لتحميل تساوي حجم العينات في جميع الآبار. يجب أن يتم تحميل حارات فارغة مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت لايمملي × 1 ل. إذا كانت العينات تحتوي على الحركة2، إضافة نفس تركيز الحركة2 لعينات وهمية.
    7. تحميل جيدا مع علامة وزن الجزيئي (MWM) ينبغي أيضا استكمال مع المخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة-الصفحة 1 × لايمملي حتى حجم العينات تحميل هو نفسه في جميع الآبار.
      ملاحظة: مرة أخرى، إذا كانت العينات تحتوي على الحركة2، إضافة نفس تركيز الحركة2 إلى MWM. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تستخدم MWM يدتا خالية.
    8. تشغيل المواد الهلامية في 50 الخامس التراص (حوالي 30 دقيقة) حتى الجبهة صبغ يعبر في جل الانفصال.
    9. بعد كومة العينات، تغيير الجهد إلى 120 الخامس للانفصال حتى تصل إلى الجبهة صبغ الجزء السفلي من المواد الهلامية (حوالي 50 و 80 دقيقة على 80 و 100 ملم طويلة الجل، على التوالي).
      ملاحظة: نمط الهجرة MWM يتوقع أن يكون مختلفاً عن ذلك في المواد الهلامية الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية. لا ينبغي أن تستخدم لتقدير الوزن الجزيئي للبروتينات في الهلام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ولكن يمكن استخدامها للتحقق من إمكانية تكرار نتائج الجل فالعلامه. الرجوع إلى مناقشة للتفاصيل.
    10. غسل المواد الهلامية لإزالة الحركة2 من المواد الهلامية.
      1. من أجل النقل المخزن المؤقت (48 مم تريس، 39 مم جليكاين، الميثانول 20% (v/v)) التي تحتوي على 10 مم يدتا و 0.05% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي في حاوية (مثلاً، كبيرة تزن قوارب).
    حجم المخزن المؤقت يجب أن تكون كافية لتغطية جل.
  • إزالة المواد الهلامية الانفصال من لوحات جل ووضع جل واحد في حاوية واحدة. تجاهل هلام التراص.
  • اترك المواد الهلامية في شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  • كرر الخطوات الغسيل في المجموع 3 مرات.
    ملاحظة: استخدام المخزن المؤقت الطازجة لكل غسل.
  • غسل الهلام مرة واحدة لمدة 10 دقيقة مع نقل المخزن المؤقت التي تحتوي على 0.05% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي لإزالة يدتا. حجم المخزن المؤقت يجب أن تكون كافية لتغطية جل.
  • الكهربائية والنقل للأغشية ثنائي الفلوريد (PVDF) النيتروسليلوز أو الفينيليدن باستخدام الدبابات الرطب.
    1. ضع ورقة تصفية (10 × 7 سم) على وسادة الأسفنج لنقل. وضع الجل على ورق الترشيح. تأكد من أن هناك لا فقاعات الهواء بين ورق الترشيح والهلام.
    2. وضع غشاء (10 × 7 سم) على الجل والتأكد من عدم وجود لا فقاعات الهواء بين الجل والغشاء.
    3. وضع ورقة تصفية أخرى (10 × 7 سم) على الغشاء، ومرة أخرى، تأكد من هناك لا فقاعات الهواء بين الغشاء وورق الترشيح.
    4. وضع آخر الأسفنج لوحة على ورق الترشيح. وضع كومة أوراق غشاء/عامل تصفية في كاسيت لنقل.
    5. وضع الكاسيت في خزان نقل، والتأكد من أن الغشاء يقع بين الجل والانود مشحونة بشكل إيجابي.
    6. الاتصال الدبابات لإمدادات طاقة ووضع الخزان في مربع رغوة ستيرين مليء بالماء المثلج. بدء نقل 100 الخامس لمدة 180 دقيقة.
      ملاحظة: النقل المطول من الضروري نقل البروتينات من الجل فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ليست فعالة مثل ذلك من المواد الهلامية الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية. كفاءة التبريد ضروري لتجنب ذوبان المواد الهلامية أثناء النقل.
  • التحقق من نقل
    1. إزالة الأغشية من المواد الهلامية استخدام الملقط ونقع في الأغشية في حل ق بونسو (0.1% (w/v) S بونسو، حامض الخليك 5% (v/v)) لوصمة عار البروتينات المنقولة على الأغشية في وعاء من بلاستيك. حجم الحل ينبغي أن يكون كافياً لتغطية غشاء.
    2. احتضان الأغشية لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بالهز يدوياً.
      ملاحظة: ينبغي أن تصبح مرئية في كل حارة سلما عصابات.
    3. التقاط الغشاء خارج الحل المصبوغة بملاقط وانظر إذا كان قد سلم العصابات نمط موحد وكثافة في كل حارة فيها العينات التي تم تحميلها.
    4. بعد التحقق من تلطيخ، إزالة الحل المصبوغة وإضافة تبسة المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، مونولوراتي بوليوكسيثيلينيسوربيتان 0.1% (v/v)). حجم المخزن المؤقت يجب أن تكون كافية لتغطية غشاء.
      ملاحظة: الحل ق بونسو يمكن جمعها وإعادة استخدامه عدة مرات.
    5. صخرة في الأغشية في تبسة على شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة حتى تبقى لا أشرطة مرئية في الأغشية.
    6. كرر الخطوة الغسيل مع تبسة الطازجة لمدة 5 دقائق.
  • إزالة وتجاهل في تبسة. كتلة بإضافة اللبن المقشود 5% (w/v) المذابة في تبسة والتأرجح في شاكر (~ 60 لفة في الدقيقة) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. حجم الحل الحظر ينبغي أن تكون كافية لتغطية غشاء.
  • إعداد حلول جسم الأولية بتمييع الابتدائي الأجسام المضادة (الأجسام المضادة Rab10 المضادة ل Rab10 الذاتية) وجسم ها المضادة أوفيريكسبريسيد ها-Rab10 في 10 مل في الغشاء الحل حظر (انظر الجدول للمواد لتركيزات).
  • إزالة وتجاهل حل حظر وإضافة جسم الأولية. احتضان الأغشية في شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  • إزالة الحل جسم الابتدائي وإضافة تبسة لغسل الأغشية. حجم المخزن المؤقت يجب أن تكون كافية لتغطية غشاء.
  • احتضان الأغشية لمدة 5 دقائق على شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة. تكرار الغسيل (الخطوة 3.16) في المجموع 3 مرات استخدام تبست جديدة في كل مرة.
  • إعداد حلول جسم الثانوية بتمييع جسم الثانوي المسمى مع الفجل البيروكسيديز (HRP) في 10 مل في غشاء من عرقلة الحل. استخدم الأرنب المضادة مفتش الأضداد المسمى ببرنامج الصحة الإنجابية للأغشية سبر مع الأجسام المضادة Rab10، والماوس المضادة مفتش الأضداد المسمى ببرنامج الصحة الإنجابية لسبر مع مكافحة-ها جسم (انظر الجدول للمواد لتركيز).
  • إزالة وتجاهل تبست بعد الغسيل الثالث وإضافة حل جسم الثانوية. احتضان الأغشية في شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  • غسل الأغشية في تبست لمدة 10 دقيقة تكرار الغسيل خطوة في المجموع 3 مرات، مماثلة للخطوة 3.17.
  • تطوير الأغشية استخدام تشيميلومينيسسينسي المحسنة (القامة).
    ملاحظة: قد تختلف وقت التعرض في الحل القامة والنظام المستخدم للكشف عن تشيميلومينيسسينسي.
    1. قم بتشغيل تصوير مزودة بكاميرا جهاز اقتران (CCD) وكمبيوتر متصل جهاز التصوير. بدء تشغيل برنامج السيطرة للتصوير. انتظر حتى وصلت درجة حرارة الكاميرا CCD-25 درجة مئوية.
    2. وضع 1 مل الحل مسافنة لغشاء واحد على التفاف بلاستيك تنتشر على مقاعد البدلاء.
    3. وضع غشاء هلام-جانب-متابعة لحل القامة وثم بسرعة اقلب أنه حيث أن كلا الجانبين في الأغشية المغلفة مع الحل.
    4. التقاط الغشاء واستنزاف بالسماح لجانب واحد من لمس الغشاء منشفة ورقية ل 5 s.
    5. وضع الغشاء بين الأفلام واضحة (مثلاً، جيوب ورقة واضحة).
      ملاحظة: لا ينصح غلاف بلاستيكي للالتفاف على الأغشية. الأفلام واضحة تستخدم لتغليف الغشاء يجب أن تكون مسطحة قدر الإمكان دون تجاعيد مرئية لتجنب تفاوت الخلفية.
    6. وضع الغشاء في علبة سوداء. وضع العلبة التصوير وإغلاق الباب.
    7. انقر فوق الزر "التركيز" في إطار البرنامج عنصر التحكم. تحقق من أن يتم وضع الغشاء بشكل صحيح. انقر فوق الزر "إرجاع".
    8. حدد "الدقة" من أجل "نوع التعرض". حدد "دليل" ل "وقت التعرض" وتعيين وقت التعرض إلى 1 ثانية.
    9. حدد "عالية" من أجل "حساسية/القرار". ترك "إضافة صورة الرقمنة" غير محدد. انقر فوق الزر "ابدأ" لالتقاط صورة.
    10. حفظ الصورة التي ظهرت على الشاشة في الكمبيوتر كملف TIFF.
    11. تكرار التقاط الصور مع وقت التعرض من 1، 3، 10، 30، 60، 90، 120، 150 ق وتصل إلى 180 s. عند التقاط الصورة الأخيرة، راجع "إضافة الصورة رقمنة" حتى يمكن أن تؤخذ الصورة الرقمية، ولا تشيميلومينيسسينسي، للغشاء في نفس الوقت.
    12. حدد أفضل صورة مع مجموعة ديناميكية أكبر ودون أي كسل تشبع (يظهر باللون الأحمر) في النطاقات الفائدة.
      ملاحظة: يمكن أن تستخدم أفلام الأشعة السينية التقليدية أيضا للكشف عن19.

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    نظام أوفيريكسبريشن: الفسفرة من ها Rab10 3 × العلم-LRRK2 في HEK293 الخلايا:

    تم transfected الخلايا HEK293 مع 0.266 ميكروغرام من Rab10 هكتار البرية من نوع و 1.066 ميكروغرام من 3 × العلم-LRRK2 (المسخ كيناز نشط، والبرية من نوع (K1906M)، أو طفرات FPD). بحثت الفسفرة Rab10 فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها immunoblotting استخدام مضاد-ها جسم (الشكل 2). تم تشغيل 10 ميكروغرام من البروتينات على 10% هلام (...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وهنا يصف لنا طريقة سهلة وقوية للكشف عن الفسفرة Rab10 من LRRK2 على المستويات المحلية استناداً إلى منهجية العلامة ف. لأن جسم المتوفرة حاليا ضد Rab10 فوسفوريلاتيد يعمل فقط مع البروتينات overexpressed15، هذا الأسلوب استخدام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هو السبيل الوحيد لتقييم مستويات الفسفرة Rab10 الذاتية. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا الأسلوب تقدير stoichiometry الفسفرة Rab10 في الخلايا. نظراً لأن المنهجية فالعلامه التي تنطبق عموما على بروتينات والرمات، يمكن أن يكون هذا البروتوكول "نموذج" لإنشاء...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ونحن نشكر الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو، اليابان) يرجى تقديم والبلازميدات ترميز WT 3xFLAG-LRRK2، وطفرات. كما نشكر الدكتور داريو اليسي (جامعة داندي، المملكة المتحدة) لتوفير يرجى MLi-2 وبلازميد ترميز Rab10 هكتار. وأيد هذا العمل "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) كاكينهي المنحة رقم JP17K08265 (غي).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    <قوي > كواشف < / قوي> دولبيكو
    الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS) محليالصنع150 ملي كلوريد الصوديوم ، 8 ملي مولار Na 2< / sub>HPO4< / sub>-12H2< / sub>O ، 2.7 ملي مولار KCl ، 1.5 ملي مولار KH2< / sub>PO4 < / sub>in ماء MilliQ وتعقيم عن طريق التعقيم
    بكلوريد الصوديومNacalai Tesque31320-34
    هيدروجين فوسفات ثنائي الصوديوم الصوديوم 12-WaterWako196-02835
    كلوريد البوتاسيومواكو163-03545
    فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيومواكو169-04245
    2.5٪ تريبسين (10X)Sigma-AldrichT4549تمييع 10 أضعاف مع DPBS معقم لإعداد محلول العمل
    Dulbecco's النسر المتوسط المعدل
    (DMEM) Wako    		044-29765
    مصل الأبقار الجنينيBioWestS1560معطل بالحرارة عند 56 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة
    البنسلين الستربتومايسين (100X)واكو168-23191
    هيبسواكو342-01375
    هيدروكسيد الصوديومواكو198-13765
    بولي إيثيلينيمين هيدروكلوريك ماكس ، خطي ، ميغاواط 40،000 (PEI MAX 40000) PolySciences، Inc.24765-1تم تحضير محلول المخزون في 20 ملي مولار HEPES-NaOH ، ودرجة الحموضة 7.0 عند 1 مجم / مل ، ثم تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم
    ثنائي ميثيل سلفوكسيدواكو045-28335
    تريسستارRSP-THA500G
    حمض الهيدروكلوريكواكو080-01066
    بولي أوكسي إيثيلين (10) أوكتيل فينيل إيثرواكو160-24751ما يعادل تريتون X-100
    الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) - N ، N ، N '، N '، N'- حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) واكو346-01312
    أورثوفانادات الصوديوم (V)واكو198-09752
    فلوريد الصوديومكانتو الكيميائية37174-20
    & بيتا ؛ - حمض الجليسيروفوسفوريك ملح ثنائي الصوديوم خماسي هيدراتناكالاي تسك17103-82
    الصوديوم بيروفوسفات ديكاهيدراتكوكوسان كيميكال2113899
    ميكروسيستين-LRواكو136-12241
    السكروزواكو196-00015
    كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTARoche11873580001قم بإذابة قرص واحد في 1 مل من الماء ، والذي يمكن تخزينه عند -20 درجة ؛ ج لمدة شهر. استخدمه عند التخفيف 1:50 لتحلل الخلايا
    بيرس كوماس (برادفورد) مجموعة فحص البروتينThermo Fisher Scientific23200
    كبريتات دوديسيل الصوديومNacalai Tesque31607-65
    GlycerolWako075-00616
    Bromophenol blueWako021-02911
    & beta & -mercaptoethanolKanto Chemical25099-00
    الإيثانولواكو056-06967
    الميثانولواكو136-01837
    علامة ربط الفوسفات أكريلاميدواكوAAL-107P-tag أكريلاميد
    40٪ (وزن / حجم) محلول أكريلاميدNacalai Tesque06119-45أكريلاميد: مكرر = 29: 1
    رباعي ميثيل إيثيلين ثنائي الأمين (TEMED)Nacalai Tesque33401-72
    بيرسلفات الأمونيوم (APS)Wako016-08021تم تحضير محلول 10٪ (وزن / حجم) عن طريق إذابة مسحوق بيرسلفات الأمونيوم في ماء MilliQ
    2-propanolواكو166-04831
    كلوريد المنغنيز رباعي الهيدراتSigma-AldrichM3634
    Precision Plus Protein Prestained StandardBio-Rad1610374 ، 1610373 ، 1610377علامة الوزن الجزيئي المستخدمة في البروتوكول
    WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker IIIWako230-02461
    GlycineNacalai Tesque17109-64
    Amersham Protran NC 0.45GE Healthcare10600007غشاء النيتروسليلوز
    غشاء DuraporeEMD MilliporeGVHP00010PVDF
    غشاء أوراق الترشيح رقم 1Advantec00013600
    Ponceau SNacalai Tesque28322-72
    حمض الخليكواكو017-00251
    Tween-20Sigma-AldrichP1379بولي أوكسي إيثيلين أوربيتان أحادي لورات
    حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)واكو345-01865
    مسحوق الحليب الخالي من الدسممختبرات Difco232100
    ImmunostarWako291-55203محلول ECL (حساسية عادية)
    Immunostar LDWako290-69904محلول ECL (حساسية عالية)
    محلول تلطيخ CBBمحلي الصنع1 جم CBB R-250 ، 50٪ (حجم / حجم) ميثانول ، 10٪ (v / v) حمض الأسيتيك في 1 لتر من ماء MilliQ
    CBB R-250واكو031-17922
    CBB محلولمحلي الصنع12٪ (حجم / حجم) ميثانول ، 7٪ (حجم / حجم) حمض الأسيتيك في 1 لتر ماء
    <قوي>الاسم<قوي>الشركة<قوي>رقم الكتالوج<قوي>تعليقات
    <قوي>الأجسام المضادة
    الأجسام المضادة المضادة لحمض الهيدروكلورونيكسيجما-ألدريتش11583816001تستخدم في 0.2 & جم / مل للنشاف المناعي.
    إشارات الخلاياللأجسام المضادة للأجسام المضادة ل Rab10# 8127تستخدم في الساعة 1: 1000 للنشاف المناعي.
    تم تأكيد الخصوصية بواسطة CRISPR KO في Ito et al. ، Biochem J ، 2016.
    الأجسام المضادة المضادة ل pSer935Abcamab133450المستخدمة في 1 & mu ؛ جم / مل للنشاف المناعي.
    الأجسام المضادة المضادة ل LRRK2Abcamab133518المستخدمة في 1 & mu ؛ جم / مل للنشاف المناعي.
    الأجسام المضادة المضادة لألفا توبولينSigma-AldrichT9026المستخدمة في 1 & mu ؛ جم / مل للنشاف المناعي.
    الأجسام المضادة المضادة ل GAPDHSanta-Cruzsc-32233المستخدمة في 0.02 & mu ؛ جم / مل للنشاف المناعي.
    بيروكسيداز أفينيبيور للأغنام المضادة للفأر IgG (H + L) JacksonImmunoResearch515-035-003تستخدم في 0.16 & mu ؛ جم / مل للنشاف المناعي.
    بيروكسيداز أفينيبيور الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) JacksonImmunoResearch111-035-003المستخدم في 0.16 & mu ؛ جم / مل للنشاف المناعي.
    <قوي>الاسمCompanyCatalog NumberComments
    Inhibitors
    GSK2578215A MedChemExpressHY-13237تم إعداد محلول المخزون في DMSO عند 10 ملي مولار وتخزينه عند -80 درجة. C
    MLi-2مقدمة من الدكتور داريو أليسي (جامعة دندي)إعداد محلول المخزون في DMSO عند 10 ملي مولار وتخزينه عند -80 درجة ؛ C
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Plasmids
    Rab10 / pcDNA5 FRT TO HAمقدمة من الدكتور داريو أليسي
    (جامعة دندي)    		يعبر هذا البلازميد عن Rab10 البشري الموسوم بعلامة HA الأمينية.
    LRRK2 WT / p3xFLAG-CMV-10مقدمة من الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو) إيتووآخرون ، الكيمياء الحيوية ، 46: 1380 & ndash ؛ 1388 (2007). يعبر هذا البلازميد عن LRRK2 بشري من النوع البري 3xFLAG الموسومة بشكل أميني.
    LRRK2 K1906M / p3xFLAG-CMV-10مقدمة من الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو) إيتووآخرون ، الكيمياء الحيوية ، 46: 1380 & ndash ؛ 1388 (2007). يعبر هذا البلازميد عن طفرة كيناز غير نشطة K1906M 3xFLAG الموسومة بالأمينية من LRRK2 البشري.
    LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10هذه الورقة. يعبر هذا البلازميد عن 3xFLAG-tagged N1437H FPD المتحولة من LRRK2 البشري.
    LRRK2 R1441C / p3xFLAG-CMV-10مقدمة من الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو)وآخرون ، الكيمياء الحيوية ، 48: 10963 & ndash ؛ 10975 (2013). يعبر هذا البلازميد عن 3xFLAG المتحور R1441C FPD لLRRK2 البشري.
    LRRK2 R1441G / p3xFLAG-CMV-10مقدمة من الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو)وآخرون ، الكيمياء الحيوية ، 48: 10963 & ndash ؛ 10975 (2013). يعبر هذا البلازميد عن تحور R1441G FPD الموسوم بعلامة 3xFLAG من LRRK2 البشري.
    LRRK2 R1441H / p3xFLAG-CMV-10مقدمة من الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو)وآخرون ، الكيمياء الحيوية ، 48: 10963 & ndash ؛ 10975 (2013). يعبر هذا البلازميد عن 3xFLAG-tagged R1441H FPD المتحولة من LRRK2 البشري.
    LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10هذه الورقة. يعبر هذا البلازميد عن 3xFLAG الموسوم ب R1441S FPD المتحولة ل LRRK2 البشري.
    LRRK2 Y1699C / p3xFLAG-CMV-10مقدمة من الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو)وآخرون ، الكيمياء الحيوية ، 48: 10963 & ndash ؛ 10975 (2013). يعبر هذا البلازميد عن تحور Y1699C FPD الموسوم بعلامة 3xFLAG من LRRK2 البشري.
    LRRK2 G2019S / p3xFLAG-CMV-10مقدمة من الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو)وآخرون ، الكيمياء الحيوية ، 48: 10963 & ndash ؛ 10975 (2013). يعبر هذا البلازميد عن تحور G2019S FPD الموسوم بعلامة 3xFLAG من LRRK2 البشري.
    LRRK2 I2020T / p3xFLAG-CMV-10مقدمة من الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو)وآخرون ، الكيمياء الحيوية ، 48: 10963 & - - 10975 (2013). يعبر هذا البلازميد عن تحور I2020T FPD الذي يحمل علامة 3xFLAG من LRRK2 البشري.
    <قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
    Equipments
    CO2 حاضنةThermo Fisher ScientificForma Series II 3110
    Pipet-Aid PA-400
    Micropipette P10Nichiryo00-NPX2-100.5 & ndash ؛ 10 و مو ؛ L
    ماصة دقيقة P200Nichiryo00-NPX2-20020 & ndash ؛ 200 مو ؛ L
    ماصة دقيقة P1000Nichiryo00-NPX2-1000100 & ndash ؛ 1000 مو ؛
    L نصائح للماصة الدقيقة P10STARRST-481LCRSTمعقمة
    للماصة الدقيقة P200FUKAEKASEI1201-705YSمعقمة
    للماصة الدقيقة P1000STARRST-4810BRSTماصة معقمة
    5 مل قابلة للتفكيكGreiner606180معقمة
    10 مل ماصة قابلة للتفكيكGreiner607180
    25 مل قابلة للتفريغFalcon357535مقياس الدم المعقم
    زجاج SunleadGlass A126مجهر Neubeuer محسن
    أوليمبوسCKX53
    أطباق 10 سمFalcon353003لزراعة الأنسجة
    لوحات 6 آبار AGCTechno Glass3810-006لزراعة
    الأنسجةخلاط دوامةصناعات علميةVortex-Genie 2
    كاشطات خليةSumitomo BakeliteMS-93100
    أنابيب 1.5 ملSTARRSV-MTT1.5
    أنابيب 15 ملAGC Techno Glass2323-015
    أنابيب 50 ملAGC Techno Glass2343-050
    أجهزة الطرد المركزيTOMYMX-307
    96 بئر لوحاتGreiner655061ليس لثقافة الأنسجة
    قارئ لوحةالأجهزة الجزيئيةSpectraMax M2e
    SDS & ndash ؛ دبابات PAGE NihonEidoNA-1010
    دبابات نقلNihon EidoNA-1510B
    لوحات جل (مسننة)Nihon EidoNA-1000-1
    ألواح جل (عادي)Nihon EidoNA-1000-2
    فواصل السيليكونNihon EidoNA-1000-16
    أمشاط 17 بئرNihon Eidoحسب الطلب
    مقاطع الموثقNihon EidoNA-1000-15
    5 مل حقنةTerumoSS-05SZ
    21GTerumoNN-2138R
    محطة توليد الكهرباء 1000 VCATTOAE-8450امدادات الطاقة ل SDS & ndash ؛ PAGE ونقل
    قوارب الوزن الكبيرةIna OptikaAS-DL
    حاويات بلاستيكيةكحالة PSواحدة رقم 410 × 80 × 50 مم
    هزاز شاكرTitechNR-10
    صندوق رغوة ستايرينعاميجب أن تناسب الأبعاد الداخلية خزان نقل واحد (200 × 250 × 250 مم).
    ImageQuant LAS-4000GE Healthcareجهاز تصوير مزود بكاميرا CCD مبردة للكشف عن ECL
    مرشح إزالة تقنية تم كاميكاواجي كاميكاواجي كاميكاواجي كاميكاواجي كاميكاواجي كاميكاواجي ماصة أوتوماتيكية مغلفة بالماء أطراف أطراف ماصة معقمة

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
    2. Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
    3. Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
    4. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
    5. Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
    6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
    7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
    8. Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
    9. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
    10. Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
    11. Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
    12. Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
    13. West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
    14. Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
    15. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
    16. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
    17. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
    18. Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
    19. Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
    20. Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
    21. Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
    22. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
    23. Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519(2011).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    SDS PAGE HEK293 P tag Rab10

    مقالات ذات صلة