مقالة منهجية

تعبير عابر "للجينات الأجنبية" في "خلايا الحشرات" (sf9) "البروتين المقايسة الوظيفية"

DOI:

10.3791/56693

⸱

فبراير 22, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول نظام تعبير بروتين الصدمة الناجمة عن حرارة (بدهسب/V5-صاحب/sf9 خلية النظام)، التي يمكن استخدامها للتعبير عن البروتينات الخارجية أو تقييم apoptotic مكافحة نشاط البروتينات الخارجية المحتملة وما مبتوراً الأمينية الأحماض في خلايا الحشرات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام التعبير الجيني عابر واحد من أهم التقنيات لإجراء تحليل وظيفي البروتين في منظومة الثقافة في المختبر باكولوفيروس الخلية. تم تطوير هذا النظام للجينات صريح الأجنبية الخاضعة لسيطرة المروج باكولوفيرال في التعبير عابر والبلازميدات. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا النظام على مقايسة وظيفية للبروتينات الخارجية أو باكولوفيروس نفسها. تطوير نظام التعبير الجيني عابر المتاحة تجارياً وعلى نطاق واسع أكثر استناداً إلى مروج فوري مطلع الجينات (IE) بسيودوتسوجاتا أورجييا مولتيكابسيد نوكليوبوليهيدروفيروس (أوبمنبف). ومع ذلك، لوحظ وجود مستوى تعبير منخفضة من الجينات الأجنبية في خلايا الحشرات. ولذلك، شيد نظام تعبير الجيني عابرة لتحسين التعبير البروتين. في هذا النظام، وشيدت والبلازميدات المؤتلف تحتوي على تسلسل الهدف تحت مراقبة الحرارة المورفولوجية المروج (Dhsp70) صدمة 70. ويقدم هذا البروتوكول تطبيق هذه الحرارة المستندة إلى صدمة بدهسب/V5-صاحب (حانمه V5 مع الحامض الأميني 6)/فروجيبيردا سبودوبتيرا خلية النظام (الخلايا sf9)؛ يتوفر هذا النظام ليس فقط للتعبير الجيني ولكن أيضا لتقييم نشاط مكافحة apoptotic مرشح البروتينات في خلايا الحشرات. وعلاوة على ذلك، هذا النظام يمكن أن يكون أما transfected مع بلازميد المؤتلف واحد أو شارك transfected اثنين والبلازميدات المؤتلف معادية محتملة وظيفيا في خلايا الحشرات. البروتوكول يوضح كفاءة هذا النظام ويوفر حالة عملية لهذا الأسلوب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظامان التعبير البروتين قد استخدمت عادة لإنتاج البروتينات: prokaryote البروتين التعبير (نظام التعبير الجينيالإشريكيّة القولونية ) والنظم eukaryote البروتين التعبير. نظام التعبير البروتين eukaryote شعبية واحد هو باكولوفيروس التعبير ناقل النظام (بيفس)1. واستخدمت باكولوفيروسيس أولاً كعوامل المكافحة البيولوجية في العالم الزراعية والغابات الآفات. في العقود القليلة الماضية، وضعت باكولوفيروسيس كأدوات التكنولوجيا الحيوية للبروتين، فضلا عن ناقلات التعبير. جينوم باكولوفيروسيس تتكون من DNA دائرية مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل والمغلفة نوكليوكابسيدس2. وحتى الآن، أكثر من ثمانية وسبعون باكولوفيروس قد يعزل التسلسل3. استناداً إلى تتالي الزمانية باكولوفيرال تعبيرات الجين في الخلايا المضيفة الحشرات، يمكن تصنيف النسخ الجيني في الشلالات الزمانية الأربعة، بمن فيهم فوري مطلع، الجينات تأخر-المبكر والمتأخر، ومتأخرة جداً4.

وتم تعيين بيفس حيث أن مروجي الجينات متأخرة جداً (أي، متعدد الوجوه أو p10 المروج) واستخدمت محرك الجينات المستهدفة، بينما باكولوفيروس المؤتلف تم إنشاؤها بواسطة جزئ مثلى. التعبير عن البروتينات الخارجية في خلايا الحشرات التي باكولوفيروس المؤتلف شبيه بالبروتينات الثدييات في التعديلات بوستترانسلاشونال (مناسبة لإنتاج بروتين سكري). وهكذا، تم باكولوفيروس تستخدم على نطاق واسع5،،من67. بيد أن القيد واحد هو وجود مسارات glycosylation ن مختلفة في خلايا الحشرات7.

ولذلك، تم وضع نظام جديد لتعبير باكولوفيروس، النظام الجينات عابرة، والتعبير. هذا النظام وتعرب عن الجينات الأجنبية تحت محرك أقراص المروجين فوري مطلع باكولوفيرال (أي 1 المروج) في خلايا الحشرات. باستخدام هذا النظام، البروتين المستهدف يمكن مباشرة التعبير عن تحت سيطرة المروج 1-أي أثناء تعديل مسار N-جليكوسيلاتيون في خلايا الحشرات، أسفر عن أفضل oligosaccharides ن مرتبط7. علاوة على ذلك، يتم نسخها من قبل الخلية المضيفة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني الجينات فوري مطلع باكولوفيرال ولا تتطلب أي عامل فيروسي لتفعيل4. ولذلك، يمكن التعبير عن البروتينات الخارجية في خلايا الحشرات في فترة زمنية قصيرة. حتى الآن، عابرة نظام التعبير الجيني واحدة من أهم التقنيات لإجراء فحوصات البروتين الوظيفية في نظام الثقافة في المختبر باكولوفيروس الخلية. يمكن تطبيق هذا النظام لتحليل الدالة باكولوفيروس أو البروتينات الخارجية. أحد أنظمة تعبير الجينات عابرة المتاحة تجارياً يرتكز على مروجي الجينات فوري مطلع (IE) بسيودوتسوجاتا أورجييا مولتيكابسيد نوكليوبوليهيدروفيروس (أوبمنبف) (المروجين OpIE2 و OpIE1).

ومع ذلك، انخفاض مستوى تعبير الجينات الأجنبية في خلايا الحشرات لا تزال تمثل مشكلة عندما كان النظام تعبير الجينات عابرة المستندة إلى مروج OpIE تستخدم8،،من910. وهكذا، شيد نظام التعبير الجيني عابر آخر استناداً إلى مروج المورفولوجية الحرارة صدمة بروتين 70 (hsp70) الجينات8،9. مروج hsp70 يعمل أكثر كفاءة من مروج باكولوفيرال IE عند الناجمة عن صدمة الحرارة في خلايا الحشرات10. وأعرب عن الجينات المستهدفة في هذا النظام، تحت محرك الأقراص من المورفولوجية الحرارة صدمة 70 المروج (Dhsp70). يمكن بسهولة استنساخ جينات أجنبية إلى بلازميد التعبير الجيني عابر بأساليب الاستنساخ القائم على بكر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤديها التحكم في توقيت للتعبير الجيني بالاستقراء صدمة الحرارة.

في هذا التقرير، اتبع النهج ونعرب عن ثلاثة ترونكيشنز مختلفة من الجينات باكولوفيرال (مثبط للمبرمج 3، iap3 من إكسيلينا ليمانتريا منبف) باستخدام نظام التعبير المستندة إلى صدمة بروتين عابر الحرارة و كذلك تنطبق هذه البروتينات أعرب في تحليل نشاط مكافحة--أبوبتوتيك. أما التعبير عن البروتينات الخارجية بسرعة هذا النظام أو تطبق كذلك على تقييم نشاط مكافحة أبوبتوتيك البروتين في الخلايا sf9، بينما أيضا وجود إمكانات ليتم تطبيقها على فحوصات نشاط البروتين الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الأعمال التحضيرية

  1. ثقافة الخلية الحشرات
    1. إعداد 50 مل من خلية الثقافة المتوسطة. للقيام بذلك، قم بإضافة 500 ميليلتر من المضادات الحيوية (الامفوتريسين B = 0.25 ميكروغرام/مل، البنسلين = 100 وحدة/مل، ستربتوميسين = 100 ميكروغرام/مل) و 5 مل مصل البقري الجنين إبطال الحرارة في الخلية خالية من المصل الثقافة المتوسطة (دون FBS أو المضادات الحيوية).
      ملاحظة: الحرارة المصل البقري الجنين عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي قبل الاستخدام.
    2. الحفاظ على فروجيبيردا سبودوبتيرا (قشريات الجناح: Noctuidae)، خلايا الحشرات sf9. فصل ca. 80% الخلايا من 25 سم2 خلية ثقافة قارورة التي تهز قارورة والاختيار تحت المجهر الخفيفة. بعد ذلك، نقل 50% تعليق خلية جديدة 25 سم2 خلية ثقافة قارورة وتسمح الخلايا تعلق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يستعاض عن المتوسط بالمتوسطة ثقافة الخلية الطازجة 5 مل وتنمو في حاضنة في 28 درجة مئوية. مرور خلايا كل 2 إلى 3 أيام تبعاً لنمو الخلايا.
  2. إعداد والبلازميدات تعداء الخلايا
    1. إدراج أجزاء الحمض النووي المستهدف (مثلاً، ليمانتريا إكسيلينا منبف (ليكسيمنبف) iap3 الجينات وفي بنيات الحذف) في بدهسب/V5-صاحب ب أسلوب الاستنساخ المستندة إلى بكر11. تحقق نمو المستعمرات محولة من مستعمرة PCR باستخدام مزيج PCR ماجستير (2 X) والتمهيدي بدهسب-F2/Op--IE2R مجموعة. تأكيد تسلسل بلازميد بخدمة التسلسل التجاري.
      ملاحظة: يسرد الجدول 1 الإشعال المستخدمة لبكر و بنيات المقابلة.
    2. تحديد ثقافة واحدة متسلسلة البكتيرية المستعمرات، التي تتضمن الإنشاءات بلازميد الآنفة الذكر (الخطوة 1، 2) في 200 مل رطل المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية (50 ميكروغرام/مل)، على التوالي.
    3. استخراج البلازميدات من مثقف كولاي استخدام "طقم بلازميد ميدي" وفقا لإرشادات الشركة المصنعة12.
  3. إعداد متوسطة الطلاء بخلط 1.5 مل من خلية الثقافة المتوسطة و 8.5 مل من مستنبت الخلية خالية من المصل.
  4. إعداد والاكيتنوميسين د (ActD) خلية الثقافة المتوسطة بإضافة 1.5 ميليلتر ActD المخزون (1 ملغ/مل) في 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة (التركيز النهائي = 150 نانوغرام/مليلتر). مخزن في 4 درجات مئوية.

2-بروتين تعبير عابر

  1. خلية البذر
    1. حصاد الخلايا sf9 اهتزاز قارورة الثقافة والإطاحة وتقع تعليق خلية في أنبوب 50 مل ونقل 10 ميليلتر إلى هيموسيتوميتير بواسطة ماصة P10. حساب عدد الخلايا تحت مجهر خفيفة.
    2. لوحة 3 × 105 الخلايا sf9 في كل بئر في صفيحة 24-جيدا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يستعاض في المتوسط 0.5 مل من تصفيح المتوسطة...
  2. تعداء البلازميدات
    1. كاشف تعداء خلية مخفف: 8 إضعاف ميليلتر من كاشف تعداء الخلية في 100 ميليلتر الخلية خالية من المصل الثقافة المتوسطة ومزيج من قبل فورتيكسينج ل 1 s.
    2. إضافة 2 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي (pDHsp70-ميلان-P35/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3-بير/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3-خاتم/V5-صاحب) إلى 100 ميليلتر من مستنبت الخلية خالية من المصل ومزيج من فورتيكسينج ل 1 ثانية (الشكل 2).
    3. الجمع بين الحمض النووي بلازميد المخفف وكاشف تعداء الخلايا المخفف (210 ميليلتر)، ومزيج من فورتيكسينج إينكوباتي س. 1 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إضافة 210 ميليلتر من خليط كاشف تعداء الحمض النووي دروبويسي على الخلايا بواسطة ماصة P1000. تبني في 28 درجة مئوية ح 5.
    5. استبدال المتوسطة الطلاء مع 0.5 مل مستنبت الخلية استخدام ماصة P1000. إغلاق لوحة 24-جيدا مع الشريط واحتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية ح 16.
  3. صدمة الحرارة transfected الخلايا: وضع اللوحة في حمام مائي 42 درجة مئوية (تطفو على سطح الماء). الحرارة لمدة 30 دقيقة والعودة لوحة 24-جيدا للحاضنة 28 درجة مئوية.
  4. الكشف عن البروتين التعبير
    1. بعد ح 1 أو صدمة الحرارة ح 5، غسل الخلايا مع 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت بإيجاز ثلاث مرات.
      ملاحظة: تمييع 10 × برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت إلى 1 × المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني عن طريق إضافة 1 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني 10 x إلى 9 مل تعقيم ddH2س
    2. الخلايا مع 40 ميكروليتر 1 × صبغ تحميل الحزب الديمقراطي الصربي من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
      ملاحظة: تمييع 4 × صبغ تحميل الحزب الديمقراطي الصربي بخلط 30 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني و 10 ميليلتر من 4 × المخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة.
    3. الحرارة عينات البروتين عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة حرارة وتدور إلى أسفل لمدة 1 دقيقة ووضعت على الجليد لتحليل لطخة غربية.
    4. الغربية لطخة الإنزيم
      اتبع الإجراء لتحليل لطخة غربية من إسلامي ولوجان13. تشغيل الهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة14: جل واحد تعرض لأخذ الأزرق تلطيخ (تحميل عنصر التحكم للتحقق من أن كمية البروتين عينات تم تحميلها في كل جيدا المساواة في مقدار) وأخرى تعرض للغربية لطخة المقايسة، وفقا لاسلامي ولوجان13 .
    5. الكشف عن البروتينات الانصهار معلم V5 مع الأضداد المضادة-V5 أرنب (5 ملغ/مل) (تمييع بينها في المخزن المؤقت تبسة إلى العمل بتركيز 1 ميكروغرام/مل) والماعز الأرنب المضادة IgG-الفجل البيروكسيديز (HRP) المتقارن (0.8 mg/mL) (تمييع 1:10000 في المخزن المؤقت تبسة للعمل تركيز 0.08 ميكروغرام/مل).
      ملاحظة: ضبط النسبة المئوية ل polyacrylamide إلى 17.5 في المائة عند الوزن الجزيئي البروتين يكون < كاتشين 17.

3-مكافحة-apoptotic نشاط الإنزيم

  1. استموات الخلايا المستحثة بالجينات: تكرار الإجراء المذكور أعلاه من 2.1 إلى 2.3. شارك ترانسفيكت 1 ميكروغرام من بدهسب/د-امتاز/العلم-صاحب بلازميد الحمض النووي (التي تحتوي على الجينات محفز المبرمج) مع 1 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي [pDHsp70/V5-صاحب المتجهات (المراقبة السلبية)، pDHsp70-ميلان-P35/V5-صاحب (مراقبة إيجابية)، pDHsp70-لي-IAP3/V5-صاحب، pDHsp70-لي-IAP3-بير/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3-خاتم/V5-صاحب، على التوالي.]. في العلاج بالصدمة بعد الحرارة ح 5، إجراء فحص صلاحية الخلية (الشكل 2).
  2. استموات الخلايا الناجمة عن المواد الكيميائية: تكرار الإجراء المذكور أعلاه من 2.1 إلى 2.3. في خطوة 2.1.2، لوحة 1 × 106 الخلايا sf9 في كل بئر في لوحة 6-جيدا. ترانسفيكت 4 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي [pDHsp70/V5-صاحب المتجهات (المراقبة السلبية)، pDHsp70-ميلان-P35/V5-صاحب (مراقبة إيجابية)، pDHsp70-لي-IAP3/V5-صاحب أو pDHsp70-لي-IAP3-بير/V5-صاحب pDHsp70-لي-IAP3-خاتم/V5-صاحب، على التوالي.]. ح 5 الحرارة ما بعد الصدمة، يعامل الخلايا sf9 مع 2 مل من أكتد خلية الثقافة المتوسطة ح 16 وإجراء فحص صلاحية الخلية (الشكل 2).
    ملاحظة: حجم الحد الأدنى لتغطية بئر واحدة للوحة 6-جيدا 1 مل.
  3. القيام بتجارب المقايسة نشاط مكافحة apoptotic أعلاه، بما في ذلك 3.1 و 3.2 في تريبليكاتيس.

4-خلية جدوى الفحص

  1. تغسل الخلايا المعالجة بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني x 1 لمدة 1 دقيقة 3 مرات. ريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج 1 x 1 مل برنامج تلفزيوني مخزن يحتوي على 0.04% تريبان الأزرق ووصمة عار لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل تعليق خلية في microtube 1.5 مل.
    ملاحظة: تمييع الحل تريبان الأزرق 0.4 في المائة بخلط مل 9 1 x برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت ومل 1 0.4% الحل تريبان الأزرق.
  2. نقل 10 ميليلتر تريبان تعليق خلية ملطخة باللون الأزرق إلى هيموسيتوميتير مع ماصة P10 وعد الخلايا سليمة قابلة للاستمرار تحت مجهر خفيفة.
  3. التحليل الإحصائي
    1. حساب البيانات المسجلة وتقديمها كوسائل ± التنمية المستدامة لجميع التهم الموجهة إليه.
    2. تحليل البيانات باستخدام الطالب ثنائي الطرف اختبار t قبل مع Microsoft Excel. تعريف البيانات إحصائيا فقيمه < 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طول كامل وغيرها truncations اثنين (المجالات بير وخاتم) من IAP3 لي من ليكسيمنبف كانت أوفيريكسبريسيد في الخلايا sf9، استناداً إلى الحرارة المستندة إلى صدمة بدهسب/V5-صاحب/فروجيبيردا سبودوبتيرا خلية النظام (الخلايا sf9). الواردة بدهسب/V5-صاحب المورفولوجية حرارة صدمة بروتين مروج، الذي يدفع التعبير الجيني المصب عند درجة حرارة 42 درجة مئوية شرط باستخدام عوامل النسخي الخلوية و نظام (الشكل 1) ترجمة8 ،،من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف مفهوم النظام القائم على صدمة خلية بدهسب/V5-صاحب/sf9 الحرارة أولاً كليم et al. في عام 19948. أظهرت مقارنة باكولوفيرال الجينات المروج (IE1) و المورفولوجية hsp70 أن hsp70 كان مستوى أعلى من كفاءة في البعوض خلايا10. وعلاوة على ذلك، بسبب تحريض صدمة الحرارة، يمكن التحكم توقيت التعبير البروتين تحديداً بعد العلاج بالصدمة الحرارة. ثم طبق هذا النظام لفحوصات البروتين وظيفية من الجمبري ونوكليوبوليهيدروفيروس (NPV) الأكاديميات البروتينات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الدكتور جيان-Horng لوي من المعهد "علم الأحياء البحرية"، جامعة المحيط تايوان الوطنية لتوفير 3 بلازميد الإنشاءات. وأيد هذا البحث بمنحه 106-2311-ب-197-001-من وزارة العلوم والتكنولوجيا (معظم).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مضاد حيوي مضاد للفطريات ، 100XGibco15240-062لزراعة خلايا
الحشرات مصل بقري الجنين المعتمدBioind04-001-1A
SF-900 II SFMThermo Fisher10902096وسط زراعة الخلايا الخالية من المصل
خلايا Sf9ATCCCRL-1711
قارورة زراعة الخلايا 25 سم 2، ثيرمو فيشر156340
الفحص المجهري الضوئي المقلوبWHITEDWHITED WI-400
RBC HIT Competence Cell BiomanRH618-J80 الإشريكية القولونية< / em> (DH5 & alpha;)
L.B. مرق (ميلر)BiomanLBL407
Agar ،BiomanAGR001 Bioman AGR001
ZeocinInvitrogenant-zn-1اختيار مضاد حيوي
PCR Master Mix (2X)ThermoFisherK0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (خالي من السموم الداخلية)GeneaidPIE25
Actinomycin DSIGMAA9415
كورنينج 50 مل أنابيب الطرد المركزيSIGMACLS430829-500EA50 مل أنابيب
الدمالدم Gizmo Supply CoB-CNT-SLDE-V2
24-well multidishnunc ، Thermo Fisher14247524-well لوحة
Cellfectin II كاشفThermo Fisher10362100خلية كاشف ترانسفكتين
PBS-Phosphate-Buffered محلول ملحي (10X) درجة الحموضة 7.4ثيرمو فيشرAM9624
4 مرات ؛ SDS تحميل صبغBiomanP1001
Immobilon-P (أغشية النشاف PVDF)أغشية Merck MiliporeIPVH00010PVDF
نظام الخلايا العابرة المصغرةBIO-RED1703930جهاز نشاف
Ponceau Sحل SIGMA6226-79-5
Anti-V5SIGMAV8137الأرانب المضادة للجسم
المضاد V5الماعز المضادة للأرانب IgG-horseradidish peroxidase (HRP)جاكسون111-035-003
Tween 20Merck817072
6-WellMultidish Nunc ، Thermo Fisher145380
0.4٪ محلول تريبان الأزرقAMRESCOK940-100ML
P10 pipetmanGilsonF144802
P1000 pipetmanGilsonشريط F123602
SymbioPPS724 شريط جيد (19 مم ومرات; 36 م)
مقياس مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة