مقالة منهجية

الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني

DOI:

10.3791/56736

⸱

فبراير 26, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكون البويضات في الثدييات المعروف أن يكون عرضه للخطأ، لا سيما بسبب ميسيجريجيشن كروموسوم. توضح هذه المخطوطة الكروماتين انتشرت إعداد أساليب للماوس الطور الأول، الطورية الأول والثاني نظموا بويضات. تسمح هذه التقنيات الأساسية لدراسة البروتينات المرتبطة الكروماتين ومورفولوجيا كروموسوم طوال تكون البويضات الثديية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكروماتين انتشار التقنيات قد استخدمت على نطاق واسع لتقييم التعريب الحيوي للبروتينات المختلفة خلال الجاميطات، خاصة بالنسبة للحيوانات المنوية. تسمح هذه التقنيات للتصور من البروتين والحمض النووي التعريب أنماط أثناء الأحداث هو مثل الكروموسوم مثلى الأقران، إصلاح تشابك والحمض النووي. في حين قد وصفت بعض البروتوكولات في الأدب، الكروماتين العامة انتشار تقنيات استخدام بويضات الثدييات الطور الأول محدودة وصعبة بسبب توقيت بدء الانقسام في المبيضين الجنين. وفي المقابل، يمكن جمع spermatocytes الطور الأول من الفئران الذكور الأحداث مع زيادة الغلات دون الحاجة إلى ميكروديسيكشن. ومع ذلك، من الصعب الحصول على عدد سكانها متزامنة نقية من الخلايا في مراحل محددة بسبب عدم تجانس السكان الخلية الجرثومية هو وهو بعد في الخصية الأحداث والبالغين. للمراحل المتأخرة من الانقسام الاختزالي، أنها مفيدة لتقييم بويضات يمر الانقسام الاختزالي الأول (مي) أو الانقسام الاختزالي الثاني (MII)، لأنه يمكن جمعها من الفئران الإناث البالغات مجموعات من بويضات ناضجة وحفز ليستأنف الانقسام الاختزالي في الثقافة. هنا، أساليب للاستعدادات الكروماتين هو انتشار استخدام بويضات تشريح من الجنين، حديثي الولادة والمبايض الكبار موصوفة بمصاحبة عروض فيديو. كروموسوم ميسيجريجيشن الأحداث في بويضات الثدييات متكررة، لا سيما خلال مي. يمكن استخدام هذه الأساليب لتقييم وتميز آثار الطفرات المختلفة أو التعرض البيئي خلال المراحل المختلفة لتكون البويضات. كما أن هناك اختلافات واضحة بين تكون البويضات والحيوانات المنوية، التقنيات الموضحة داخل لا تقدر بثمن لزيادة فهمنا لتكون البويضات الثديية والميزات ديمبرافيك جنسياً لديناميات كروموسوم والبروتين خلال الانقسام الاختزالي .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال الحيوانات المنوية، موجات شبه متزامن كبيرة من الخلايا الجرثومية هو يتم بسرعة واستمرار تغذية في الخصية في بداية سن البلوغ، وطوال مرحلة البلوغ1. على النقيض من الذكور، وهو بدأ الانقسام في الإناث فقط أثناء التطور الجنيني. عقب الولادة، تظل بويضات المقبوض عليهم في مرحلة ديكتياتي طويلة من الطور الأول أنا مع حويصلة جيرمنال سليمة (غف؛ المغلف النووية) حتى سن البلوغ. في بداية سن البلوغ، يتم تحديد مجموعة فرعية بويضات دورياً للخضوع للنمو والنضج، الاحتفال ببدء استئناف هو. هو استئناف في بويضات شجيرة يتجلى اختفاء غف في عملية تعرف باسم حويصلة جيرمنال انهيار (جفبد). ثم يخضع البويضات كروموسوم التكثيف والعزل، متبوعاً بقذف الجسم القطبي. بويضات تصبح القبض عند التقدم لصناعة المعلومات وتحفز لاستكمال الشعبة هو الثاني والنهائي إلا بعد الإخصاب.

خصوبة الإناث يعتمد اعتماداً كبيرا على نجاح الطور الأول هو أنا التدرج. المفتاح لهذا هو تكوين الربط الفعلي بين الكروموزومات المتماثلة المعروفة باسم تشياسماتا، الذي هو توسط إصلاح فواصل مزدوجة حبلا الحمض النووي المستحث (دسبس) عن طريق وصلة التحويلة جزئ2. تحدث هذه العملية في سياق السقالة الغنية بالبروتين الحيوي المعروف باسم المجمع سينابتونيمال (SC) التي تشكل بين الكروموزومات المتماثلة لتسهيل على تشابك3. اتفاقية استكهولم هي الزمام مثل هيكل ثلاثي يتكون من عنصرين الجانبية متوازية متصلة بالمنطقة الوسطى البروتينات التي تحمل هومولوجس معا في جميع أنحاء الجارية إصلاح الحمض النووي. قبل انتصاف، تشكيل سلائف العناصر الجانبية، وتسمى العناصر المحورية، بين الأخت شقاً الصبغي. وتشكل البروتينات المعقدة سينابتونيمال مثل SYCP2 و SYCP3 العناصر المحورية التي كولوكاليزي على المحاور التماسك chromatid الشقيقة أثناء الطور الأول في وقت مبكر. هذه لاحقاً كمواقع للبروتين خيوط عرضية، SYCP1، مما يسهل الجمعية العنصر المركزي وتشابك بين homologs محاذاة4الربط. في بويضات الماوس، تشابك كاملة يتم الإشارة إلى وجود 20 تماما متداخلة تمتد SYCP3 و SYCP1، التي يمكن تصور باستخدام لونين انتشار الأعمال التحضيرية. اكتمال تشابك عند دخول [سوبستج] باتشيتيني، حيث زينت ناضجة عمليات الانتقال التي تتجه بشكل تشياسماتا بين هومولوجس موتل dimers homolog (MLH1/3) لتعزيز تلك المعالجة الدقيقة5،6 , 7-صون الهيكلية لمجمعات الكروموسومات (SMC)، بما في ذلك كوسين، كوندينسين، ومعقدة، SMC5/6 هامة لتنظيم كروموسوم ديناميات وهيكل خلال الانقسام الاختزالي8،9، 10،،من1112. مجتمعة، هذه الأحداث ضمان اتجاه ثنائية السليم من الكروموزومات المتماثلة لمعارضة أقطاب المغزل عقب تفكك المحكمة العليا.

دورة الخلية هو نموذج قوية لدراسة أدوار مختلف البروتينات في صيانة الجينوم بسبب التعريفي المبرمجة وإصلاح لاحقة من "دسبس الحمض النووي". وعلاوة على ذلك، الانقسام الاختزالي الثدييات أيضا نموذج ذات صلة لدراسة تعديلات جينية والطباعة13. ومع ذلك، من الصعب من الناحية الفنية لتقييم هذه الأحداث أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، الذي ينعقد في المبيضين الأجنة والأطفال حديثي الولادة في الثدييات (الشكل 1). ويمكن تقسيم المراحل الفرعية 5 الطور الأول: ليبتونيما، زيجونيما، باتشينيما، ديبلونيما وديكتياتي. وهنا، نحن تصف كيفية عزل والتمييز بين الأجنة والمواليد المبيض والخصيتين (الشكل 2). مقتبس من الأساليب المذكورة سابقا، وهذه المخطوطة يوجز أيضا بروتوكول (الخطوة 1) مع الفيديو مظاهرة لإعداد الإناث في الطور الأول هو أنا الكروماتين ينتشر14،،من1516،17 . عندما يقترن مع إيمونولابيلينج، كما هو موضح في الخطوات من 6-7، يتيح هذا البروتوكول مفصلة التحليل المجهري للطور الأول أنا الأحداث في بويضات.

تكون البويضات عرضه للخطأ، وتمثل الكروموسوم ميسيجريجيشن الأحداث خلال الشعبة الأولى هو المصدر الأكثر شيوعاً للأمراض الوراثية في نسل18،19. في هذه المخطوطة (الخطوة 2 من البروتوكول)، يصف لنا بروتوكول الذي يتم استخراج بويضات ناضجة نظموا غف من المبايض معبي من الفئران الإناث البالغات. تحت ظروف داعمة، يخضع بويضات شجيرة استئناف مستقلة عن الهرمون للانقسام بعد عزلة والثقافة20. وعقب استئناف هو، بويضات التقدم من خلال الانقسام الاختزالي أنا، ثم القبض على الطورية الثاني. بويضات تظل المقبوض عليهم في الطورية الثاني، ما لم يكن المخصبة. في الخطوات من 2-5، علينا أن نكيف بروتوكولات تم الإبلاغ عنها سابقا مع الفيديو مظاهرة لوصف كيفية جمع، الثقافة وإعداد بويضات مي وصناعة المعلومات ل الاستعدادات الكروماتين نشر21. يسمح هذا الكروماتين نشر تقنية إيمونولابيلينج واضحة من البروتينات المرتبطة بالكروموسومات. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدامها للتمييز بين الكروموزومات الثنائي التكافؤ وأونيفالينت هذا البروتوكول، وكذلك حل واحد الأخت شقاً الصبغي لتيسير تقييم ploidy البويضات. لذلك، بالإضافة إلى الكشف عن أنماط البروتينات هو التعريب، هذا البروتوكول يمكن أيضا بمثابة أداة قيمة للغاية لتوضيح الأسباب المحتملة كروموسوم ميسيجريجاتيون خلال مي وصناعة المعلومات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جون هوبكنز. وأجريت تجارب على الفئران البرية من نوع C57BL/6J.

1-حصاد المبايض الجنين أو حديثي الولادة، وإعداد الكروماتين الطور الأول ينتشر

  1. لاستخراج الأجنة في أيام 14.5 – 19.5 بوست--كويتوم (dpc) التضحية الإناث الحوامل عن طريق عنق الرحم التفكك أو CO2 خنقاً وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.
    ملاحظة: ليوم الولادة المبايض 1-5 قم بالتخطي إلى الخطوة 1، 3. ويلخص الشكل 1 مراحل الطور الأول هو إثراء في مختلف العصور الجنينية وما بعد الولادة.
  2. فتح تجويف أبدومينوبيلفيك استخدام مقص عقيمة، مما يجعل من فتح على شكل V. تشريح خارج الرحم الأم القرن الأفريقي، وفصل الأجنة من المشيمة، ونقل الأجنة في أطباق بتري 35 ملم تحتوي على 3 مل من قبل حرارة 1 × العازلة الفوسفات المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام حاضنة فليبتوب تعيين في 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة الحرارة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام مرحلة زجاج وينظم درجة حرارة للحفاظ على درجة الحرارة أثناء معالجة المبيض.
  3. مع المقص الجراحي 3.5 بوصة، التضحية بالأجنة أو الجراء عن طريق قطع الرأس وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك. وضع الأجنة مقطوعة أو الجراء في برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً قبل تشريح أخرى.
  4. تشريح الجنين أو ألجرو واحد في وقت واحد في طبق بتري منفصلة 35 ملم تحتوي على 3 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً عند 37 درجة مئوية. المضي قدما من خلال قطع على طول خط الوسط البطني النصف الخلفي للجنين، على امتداد النصف الأمامي أدناه الأمامية ومباشرة فوق هند أطرافه والذيل كما هو مبين في الشكل 2 ألف–باء.
  5. فتح البطن باستخدام مقص جراحي 3.5 بوصة. استخدام الملقط مقلوب غرامة تهجير أو إزالة الكبد وحلقات من الأمعاء، تعريض المبايض في طبق بتري 35 ملم جديدة تحتوي على 3 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً عند 37 درجة مئوية (انظر دليل في الشكل 2). وتقع المبايض مباشرة أسفل وخلف الكلي نحو الجدار الخلفي التجويف الصفاقى (الشكل 2–ج). ويرد دليل للتفريق بين الذكور والإناث في الغدد التناسلية في 2D الشكل.
    ملاحظة: للظروف المثلى، سرعة تشريح المبايض بعد التضحية بالإناث الحوامل.
  6. إزالة كلا المبيضين من كل الجنين الأنثى باستخدام زوج من الملقط الجميلة ذات الرؤوس تحت نطاق تشريح ومكان في نظارات مشاهدة أو آبار منفصلة من بئر متعدد لوحة تحتوي على 0.5 إلى 1.0 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً والحفاظ على 37 درجة مئوية.
  7. ضع كل زوج من المبايض في 0.5 مل هيبو-استخراج المخزن المؤقت (17 ملم سترات صوديوم ثنائي هيدرات، السكروز 50 مم، 5 ملم يدتا، 0.5 مم DTT، 30 ملم تريس-HCl، مثبط البروتياز، pH 8.2) في كوب يشاهد نظيفة أو بئر صغير من لوحة 9-جيدا، مع التأكد من أن تزج شركات المبيضين ليتيلي. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل، ولكن ليس أكثر من 30 دقيقة.
    ملاحظة: جعل العازلة هيبو-استخراج جديدة واستخدامها ضمن ح 2 لإضافة القيمة.
  8. أثناء الحضانة، باستخدام قلم PAP حاجز مسعور، رسم مربعين2 22 × 22 ملم على زجاج نظيفة 25 × 75 مم2، 1 مم سميكة مجهر الشريحة كما هو مبين في الشكل 3 ألف.
    ملاحظة: يمكن إعداد الشرائح قبل الموعد المحدد.
  9. "الماصة؛" 45-50 ميليلتر من السكروز 100 مم إلى شريحة نظيفة ونقل زوج واحد من المبايض إلى الانخفاض.
  10. استخدام نهايات اثنين ز 27 الإبر الحادة، ندف المبايض عن بعضها البعض بتحرير الخلايا في محلول السكروز. مع الملقط، إزالة القطع الكبيرة من المبيض وعناية "الماصة؛" محلول السكروز لتفريق الخلايا.
  11. ميليلتر 40 مكان حل مثبت (بارافورمالدهيد 1% (منهاج عمل بيجين) والمنظفات 0.2% (انظر الجدول للمواد)، الرقم الهيدروجيني 9.2) في كل مربع من الشريحة استعداد. مع تلميح ماصة 200 ميليلتر، نشر الحل مثبت بالتساوي على سطح الشريحة.
  12. "الماصة؛" 20 ميليلتر من مزيج السكروز على الساحة كل من الشريحة التي تحتوي على مثبت.
    ملاحظة: وهذا يساوي استخدام زوج واحد من المبايض كل شريحة.
  13. احتضان الشرائح الموجودة في دائرة مغلقة رطبة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن أن تتراوح الحضانة بين عشية وضحاها حوالي (12-15 ساعة) في درجة حرارة الغرفة.
  14. افتح غطاء الدائرة والسماح للشرائح أيردري تماما.
  15. تغسل شرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 50 مل من محلول عامل ترطيب-برنامج تلفزيوني 0.4 في المائة (انظر الجدول للمواد) لمدة 2 دقيقة، الهواء الجاف، والمضي قدما في البروتوكول إيمونولابيلينج (الخطوة 6).
    ملاحظة: قد يكون من الممكن لتخزين الشرائح في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق، ولكن هذا يختلف تبعاً لبروتين الفائدة. لتحقيق أفضل النتائج الشروع فورا في بروتوكول إيمونولابيلينج (الخطوة 6).

2-الطورية أنا جمع البويضات

  1. إلى أقصى حد عدد المسام antral معزولة عن كل الماوس، إينترابيريتونيلي حقن الفئران الإناث عذراء ناضجة جنسياً مع 5 وحدات دولية من المصل تروج الحوامل مير (بمسج، المعروف أيضا الخيول تروج المشيمة (eCG)).
    ملاحظة: للغله البويضيه الأمثل، الفئران يجب أن تكون 1 إلى 3 أشهر عمر، كما سينخفض عدد بويضات تحصد مع التقدم في السن. إعداد بمسج، حل زجاجة من 5000 وحدة دولية في 100 مل مخزن (مل U/0.1 5) PBS العقيمة في مختبرين استخدام واحد من 600 ميليلتر في-20 درجة مئوية.
  2. بعد ح 44 – 48، إعداد مجموعة متوسطة، الحد الأدنى الأساسية المتوسطة ألفا (MEMα) المتوسطة وتستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين (FBS) والبومين المصل البقري 3 ملغ/مل (جيش صرب البوسنة؛ MEMΑ/BSA/FBS). تعقيم وسائل الإعلام من خلال عامل تصفية مسام 0.2 ميكرون. صب 2.5 مل من MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS المتوسطة في صحن زجاج واحد كل الماوس والحارة إلى 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة.
    ملاحظة: جمع ووسائط الثقافة التي هي متوفرة تجارياً (M2 و M16) أخرى أيضا تستخدم عادة.
    تنبيه: من المستحسن إزالة ثقافة الأطباق من 5% CO2 حاضنة واحدة في وقت واحد لمدة محدودة لتقليل التعرض للهواء المحيط أثناء خطوات التلاعب.
  3. التضحية الفئران عن طريق عنق الرحم التفكك أو CO2 خنقاً وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.
  4. فتح تجويف أبدومينوبيلفيك استخدام مقص عقيمة، مما يجعل من فتحه كبيرة على شكل V. استخدام الملقط، يزيح الأمعاء نحو رأس الماوس. حدد موقع كل القرن الرحم؛ المبايض هي تقديم الأقرب إلى القفص الصدري. اضغط قناة مع الملقط غرامة وقطع متفوقة الدهون على المبيض باستخدام مقص التشريح (الشكل 4). الاستمرار في الاحتفاظ قناة، ومع مجموعة أخرى من الملقط غرامة الإفراج عن المبيض من الجراب والمكان إلى جمع الصحن الذي يحتوي على MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS المتوسطة.
    ملاحظة: كما هو الحال في الخطوة 1، من الضروري الحفاظ على المبيضين عند 37 درجة مئوية وعلى الساعة 5% CO2. يمكن استخدام حاضنة فليبتوب التوصيل إلى 5% CO2 ميكس للسماح للصيانة المثلى لدرجات الحرارة ومستويات2 CO. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضا استخدام مرحلة زجاج وينظم درجة حرارة الحفاظ على درجة الحرارة من خلال التلاعب بالبويضات.
  5. استخدام المحاقن 1 مل مع إبرة 27-قياس (أو حجم مماثل)، الإفراج عن مجمعات البويضيه الركام بثقب المسام antral كبيرة يدوياً.
  6. بينما لاحظ من خلال مجهر تشريح، جمع بويضات نظموا غف استخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم أو الشعرية، أو تعمل باليد ميكرومتر-حقنه (الشكل 5). فقط جمع بويضات التي تم إصدارها من المسام أنترال. بويضات غف قد يبلغ قطرها حوالي 90 غف بويضات ميكرومتر. قد تكون محاطة بطبقات 2-3 من الخلايا granulosa، ويكون إجمالي يبلغ قطرها حوالي 200 ميكرومتر.
  7. الثقافة بويضات في كوب يشاهد نظيفة أو لوحة 9-كذلك يتضمن المتوسطة MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS ح 6 تصل إلى الطورية أنا في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5%.
  8. انتقل إلى الخطوة 4.

3-الطورية الثاني (صناعة المعلومات) جمع البويضات

  1. لتحقيق أقصى قدر من بويضات معزولة عن كل الماوس، إينترابيريتونيلي حقن الفئران الإناث عذراء ناضجة جنسياً مع 5 وحدات دولية من بمسج. بعد ح 44 – 48، إينترابيريتونيلي حقن 5 وحدات دولية من تروج المشيمية البشرية (hCG).
    ملاحظة: للغله البويضيه الأمثل، الفئران يجب أن تكون 1 إلى 3 أشهر عمر، كما سينخفض عدد بويضات تحصد مع التقدم في السن. لإعداد قوات حرس السواحل الهايتية، حل زجاجة 10000 U في 200 مل برنامج تلفزيوني (5 مل U/0.1). تخزين في مختبرين استخدام واحد من 600 ميليلتر في-20 درجة مئوية.
  2. وبعد 12-14 ساعة، إعداد MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS جمع المتوسطة، كما هو موضح في الخطوة 2، 2، أعلاه.
  3. التضحية الفئران عن طريق عنق الرحم التفكك أو CO2 خنقاً وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.
  4. فتح تجويف أبدومينوبيلفيك استخدام مقص عقيمة، مما يجعل من فتحه كبيرة على شكل V. استخدام الملقط، يزيح الأمعاء نحو رأس الماوس. تحديد موقع كل القرن الرحم والمبايض هي الموجودة الدانية إلى القفص الصدري. اضغط قناة مع الملقط غرامة وقطع متفوقة الدهون على المبيض باستخدام مقص التشريح (الشكل 4). ثم إزالة المبيض وقناة ووضع في جمع الصحن الذي يحتوي على MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS المتوسطة.
    ملاحظة: كما هو الحال في الخطوتين 1 و 2، من الضروري الحفاظ على المبيضين عند 37 درجة مئوية وعلى الساعة 5% CO2. يمكن استخدام حاضنة فليبتوب التوصيل إلى 5% CO2 ميكس للسماح للصيانة المثلى لدرجات الحرارة ومستويات2 CO. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضا استخدام مرحلة زجاج وينظم درجة حرارة الحفاظ على درجة الحرارة من خلال التلاعب بالبويضات.
  5. استخدام المحاقن 1 مل مع 27 ز (أو حجم مماثل) أو الملقط حادة، المسيل للدموع حفرة في ampulla قناة للإفراج عن بويضات الذااره.
    ملاحظة: يكون حريصا على عدم إتلاف بويضات في أمبالا. سوف تظهر ampulla متورمة وشفافة حيث بويضات مرئية (الشكل 4).
  6. الحصاد الذااره بويضات من ampulla قناة إلى طبق جديد مع جمع المتوسطة باستخدام ماصة زجاجية تعمل بفم أو الشعرية، أو تعمل باليد ميكرومتر-حقنه (الشكل 5).
  7. انتقل إلى الخطوة 4.

4-البويضيه تعرية وإزالة Zona Pellucida

  1. إعداد 300 وحدة دولية/مل من البروتين السكري المثبط في MEMα المتوسطة وتستكمل مع 3 مغ/مل جيش صرب البوسنة سلب بويضات المحيطة بالخلايا الركام (2.5 مل في الماوس) في مشاهدة الزجاج، والحفاظ على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    ملاحظة: فعالية البروتين السكري المثبط ينخفض انخفاضا حادا بعد ح 1 من إعداد. علاج البروتين السكري المثبط لبويضات الوزارة، غير مطلوب.
  2. كشف مجمعات الخلايا البويضيه الركام إلى 300 وحدة دولية/مل من البروتين السكري المثبط في MEMα/جيش صرب البوسنة لمدة 3 دقائق سلب بويضات المحيطة بالخلايا الركام.
    تحذير: لا تتجاوز 3 دقائق بالتعرض للبروتين السكري المثبط، كما أنها سوف تلحق الضرر بويضات.
  3. أغسل بويضات، ونقل بويضات جديدة استعد الطبق المتوسط MEMα/جيش صرب البوسنة. استخدام ماصة زجاجية صغيرة تعمل بالفم أو الشعرية (أكبر قليلاً من قطر البويضات، وهو ما يقرب من 90 ميكرون)، "الماصة؛" المجمعات أعلى وأسفل تماما فصل الخلايا الركام. تسمح بويضات لاسترداد في الحاضنة أثناء التحضير للخطوة التالية.
  4. الحل تيرودي الحمضية الحارة، MEMα/جيش صرب البوسنة، ووسائل الإعلام وايموث إلى 37 درجة مئوية (500 ميليلتر في الماوس). 300 مكان ميليلتر في كل بئر من ألواح زجاجية صغيرة 9-جيدا.
  5. لإزالة zona pellucida (ZP) نقل بويضات 5 – 10 إلى الحل تيرودي. كشف بويضات لفقط 30-45 ثانية إلى الحل.
    ملاحظة: التعرض القليل جداً لأن الحل لن إزالة ZP في تماما، الذي سيمنع بويضات من الانفجار والصبغيات من الانتشار. تعرض الكثير سوف تضر وتقتل البويضات. مشاهدة حل ZP تحت مجهر تشريح يمكن أن تساعد في الاستفادة المثلى من وقت التعرض.
    تنبيه: استخدام الحل الطازجة تيرودي حرجة، حسب وظيفتها في الانخفاض مع التقدم في السن. استخدام بئر جديدة لحل تيرودي لكل مجموعة من بويضات تعامل لضمان الهضم موحدة ZP.
  6. فورا بعد إزالة ZP، يغسل بويضات بنقل إلى حرارة MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS المتوسطة. كرر هذه الخطوة من المياه والصرف الصحي.
    ملاحظة: كن حذراً عند نقل، كما بويضات ستتمسك بسهولة معا وماصة زجاجية أو إزالة ZP التالي الشعرية. قبل ترطيب ماصة زجاجية أو شعري في المتوسط في وايموث سيقلل من بويضات الالتصاق معا.
  7. نقل والسماح بويضات لاسترداد لمدة 30 دقيقة في المتوسط في وايموث عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5%.
  8. انتقل إلى الخطوة 5.

5-مي وينتشر الكروماتين البويضيه صناعة المعلومات

  1. استخدام قلم PAP، رسم مستطيل2 11 × 44 مم على الشريحة الزجاجية كما هو موضح في الشكل 6A.
  2. معطف الشريحة مع طبقة رقيقة من مثبت (بارافورمالدهيد 1%، 0.2% 100 تريتون العاشر في ح2س، الأس الهيدروجيني 9.2) بيبيتينج 100 ميليلتر من مثبت على الشريحة وهزاز الشريحة ذهابا وإيابا. انقر فوق الشريحة للتخلص من فائض مثبت.
  3. تلتقط بين 5-10 بويضات بإبرة ماصة فم صغير مع القليل من وسائل الإعلام قدر الإمكان واسحب الإبرة في خط عبر الشريحة المغلفة بمثبت أثناء إيداع بويضات من 1 سم فوق الشريحة إلى الحل مثبت. تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجهر تشريح للتأكد من أنه قد تم إيداع بويضات وأنه قد انفجر.
    ملاحظة: ينبغي الاندفاع بويضات فورا على الشريحة. الارتفاع الذي يتم بويضات أودعت أثر درجة الكروماتين ينتشر. راجع نتائج الممثل في الشكل 6 للحصول على مزيد من التفاصيل.
  4. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في غرفة مغلقة هوميديفيد بين عشية وضحاها للسماح الكروماتين على الالتزام.
  5. السماح للشرائح أيردري تماما وشطف الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 50 مل من 0.4 في المائة عامل ترطيب-ح2س، pH 8.0.
  6. انتقل إلى الخطوة 6.

6-إيمونولابيلينج

  1. إعداد جسم إضعاف المخزن المؤقت (مصرف التنمية الآسيوي) المبينة في الجدول 1.
  2. إعداد اثنين كوبلين الجرار التي تحتوي على 50 مل من غسل العازلة (البنك الدولي) الحل (10% المخفف بنك التنمية الآسيوي في برنامج تلفزيوني)، وَجْرَةَ كوبلين واحدة تحتوي على 50 مل الحل المنظفات البنك الدولي و 0.05% (مثلاً، إضافة 250 ميليلتر من المنظفات 10 في المائة إلى 50 مل البنك الدولي).
  3. يغسل الشرائح التي تم إعدادها في القسم 1 و 5 من هذا البروتوكول لمدة 10 دقائق في جرة كوبلين واحدة تحتوي على 50 مل من البنك الدولي.
    تنبيه: لا تدع الشرائح الجافة عند أي نقطة أثناء إيمونولابيلينج.
  4. يغسل الشرائح لمدة 10 دقيقة في كوبلين جرة تحتوي على 50 مل البنك الدولي والحل المنظفات 0.05%. ثم، يغسل الشرائح في جرة كوبلين المتبقية التي تحتوي على 50 مل من محلول البنك الدولي لمدة 10 دقائق.
  5. انقر فوق إيقاف الشريحة السائل والغطاء الزائدة مع 100 ميليلتر من الأجسام المضادة الأساسي المحدد المخفف في بنك التنمية الآسيوي. تبني في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في غرفة مغلقة لرطبة.
    ملاحظة: يمكن تقصير مدة الحضانة إلى 2 إلى 3 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدام أحجام أصغر من الأجسام المضادة (مثلاً، 50 ميليلتر) التي تغطي الشريحة مع ساترة أو بارافيلم.
  6. شطف الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 50 مل من 0.2% عامل ترطيب-برنامج تلفزيوني الحل، pH 8.0.
  7. كرر الخطوات من 6.2 إلى 6.5.
  8. انقر فوق إيقاف الشريحة السائل والغطاء الزائدة مع 100 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية المحددة المخفف في بنك التنمية الآسيوي. احتضان الشرائح 1 إلى 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة مغلقة لرطبة.
  9. تغسل شرائح 2 مرات عن 10 دقيقة في الجرار كوبلين التي تحتوي على 50 مل من 0.2% عامل ترطيب-برنامج تلفزيوني الحل، pH 8.0.
  10. تغسل شرائح 2 مرات لمدة 5 دقائق في الجرار كوبلين التي تحتوي على 50 مل من 0.2% عامل ترطيب-ح2س الحل، pH 8.0.

7-تركيب الشرائح

  1. بالنسبة للطور الأول الكروماتين ينتشر إعدادها في الخطوة 2، إضافة 100 ميليلتر من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 1.5µg/mL). إضافة ينتشر الكروماتين مي والوزارة مستعدة في الخطوة 5, 50 ميليلتر من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI (1.5µg/mL). لطخة بلطف السائل الزائدة بعيداً.
  2. ضع ساترة 22 مم × 60 مم في الأعلى وختم مع طلاء الأظافر واضحة. تخزين في مربع شريحة في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية إلى التقييم عن طريق الفحص المجهري الأسفار.
    ملاحظة: اضغط طفيفة في كشف الغطاء التخلص من تصاعد الزائدة المتوسطة قبل الختم بطلاء الأظافر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بوصف اثنين من التقنيات لتصور وتقييم الكروموسومات هو في بويضات. الأسلوب الأول هو تهتم تجاه تقييم تطور الطور الأول في المبيضين الأجنة وحديثي الولادة. هي قيمة بشكل لا يصدق لتصور العديد من العمليات الحيوية خلال الانقسام الاختزالي، بما في ذلك كروموسوم الأقران، تشابك الطور الأول الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية وديسينابسيس، ممارسو مثلى، ويعيد البناء كروموسوم جينية. هنا، وقد أثبتنا جدوى هذا الأسلوب للتصور قوية والتحليل الكمي لتشكيل كروس في بويضات حصادها من الأجنة C57BL/6J (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية تسمح للباحثين لدراسة زمنياً الانقسام الثدييات الإناث والتعريب الحيوي للبروتينات المشاركة. الحيزات الكروماتين الأجنة وحديثي الولادة تسمح بالتحليل الدقيق للأحداث في جميع أنحاء هو الطور الأول. الطورية والطوريه الثاني ينتشر الكروماتين يمكن استخدامها للتمييز بين شقيقة واحد شقاً الصبغي من أزواج الأخوات وإقران الكروموزومات المتماثلة، فضلا عن تقييم بلويدي. وبالمقارنة، البروتوكول هو موضح هنا يمكن يكون من المفيد مقارنة إيمونولابيلينج البويضات كلها، التي كثيرا ما تنتج مستويات عالية من الإشارات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نيجمس (R01GM11755) إلى P.W.J وعلى تدريب منحة زمالة من الوطنية سرطان معهد (NIH) (CA009110) للزمان و J.H. كان تأييد هذا العمل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10X محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS) درجة الحموضة 7.4جودة بيولوجية119-069-161
60 مم × 15 مم أطباق بتريDenvilleT1106
35 مم × 12 مم أطباق بتريDenvilleT1103
ملقط ناعمVWR300-050
مقص تشريح دقيقTed Pella1340
تشريح  مقص ، طرف حاد ، 41/2 "VWR82027-578
مربع زجاجي للساعة 1 5/8شركة كارولينا للتوريد البيولوجي742300الأوتوكلاف قبل كل استخدام
السكروزسيجماS8501
ثلاثي الصوديوم سيترات ثنائي هيدراتسيجماS1804
EDTAسيجماE6758
Trizma BaseSigmaT1503
1،4-Dithiothreitol (DTT)Sigma646563أضف إلى المخزن المؤقت منخفض التوتر مباشرة قبل الاستخدام
50x مثبط الإنزيمالبروتيني Roche11873580001أضف إلى المخزن المؤقت منخفض التوتر مباشرة قبل الاستخدام
حقنة Turberculin مع إبرة (1cc ، 27 جم × 1/2 بوصة)Becton ، Dickinson (BD)309623
زجاجية فائقة الصقيع ذات الختم الذهبي (25 × 75 مم ، سمك 1 مم)حراري3063-002
قلم PAP فائق ، كبير (مانع سائل)علوم المجهر الإلكتروني (EMS)71310
16٪المجهر الإلكتروني المائي (EMS)15710
Triton X-100SigmaT8787منظف في المخطوطة
غرفة رطوبة البقع المناعيةدائمة الخضرة240-9020-Z10
برطمانات كوبلنفيشر08-815
Photo-flo 200علوم المجهر الإلكتروني (EMS)74257عامل ترطيب في مخطوطة
موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG)SigmaG4877تخزين الحصص عند -20 درجة مئوية
موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG)SigmaC0434قم بتخزين الحصص عند -20 درجة
مئوية PYREX لوحات بقعة مع تسعة تجاويف مقعرةفيشر13-748Bالأوتوكلاف قبل كل استخدام
22260943 فيشر الشعرية الزجاجيةلصنع إبر جمع البويضات
العلامة التجارية Parafilm MSigmaBR701501لصنع إبر جمع البويضات
أنابيب مطاطية من اللاتكس (قطر داخلي 3.2 مم × 6.4 مم قطر خارجي)فيشر14-178-5Bلصنع إبر
جمع البويضاتأنابيب مطاطية من اللاتكس (قطر داخلي 6.4 مم × قطر خارجي 11.1 مم)فيشر14-178-5Dلصنع إبر جمع البويضات
قطعة أنف مطاطية مرنة من السيليكون ، لسان حال بلاستيكي صلب و 15 بوصة من أنابيب اللاتكسSigmaA5177-5EAلصنع إبر جمع البويضات
رأس ميكرومتر MitutoyoMituoyo150-208لصنع إبر جمع البويضات
حقنة 5 ملBD Biosciences309646لصنع إبر جمع البويضات
مرشح حقنة 0.45 & مرشح mCorning431220لصنع إبر جمع البويضات
ماصة باستور زجاجية 5 3/4 "فيشر13-678-6Aلصنع إبر جمع البويضات
83 × 0.5 مم طرف ماصةDenvilleP3080لصنع إبر جمع البويضات
&alpha ؛ -MEMInvitrogen11415049
Waymouth'sMedia Life Technologies11220035
مصل الأبقار الجنينيفيشرA3160602
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجماA3311لوسائط زراعة البويضات
500 مل وحدات تصفية 0.22umDenvilleF5227
HyaluronidaseSigmaH3506
Tyrode ' s solutionSigmaT1788تخزين الحصص في -20C
مصل الحصانSigmaH-1270ل ADB / الغسيل
المخزن المؤقت ألبومين مصل الأبقار (BSA)SigmaA1470ل ADB / الغسيل
المخزن المؤقت VECTASHIELD المضاد للتلاشي مع شرائح غطاء المجهر DAPIVectorLabs H-1200
(22 مم × 60 مم)فيشر12-544-G
طلاء أظافر شفافAmazonN / A
Name< / strong>Company< / strong> Catalog NumberComments
Microscopes
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000
Observer Z1Zeiss
NameCompany Catalog NumberComments
Primary Antibodies
Mouse anti-MLH1Life TechnologiesMA5-15431عامل التخفيف- 1:100
أرنب مضاد ل SYCP1Life TechnologiesPA1-16763عامل التخفيف - 1: 1000
الماعز المضاد ل SCP3سانتا كروزsc-20845عامل التخفيف - 1:50
الأجسام المضادةللبروتين البشري المضاد للسنتروميرمدمجة 15-235عامل التخفيف - 1: 100
أرنب مضاد ل TOPOIIAbcamab109524عامل التخفيف - 1: 100
فأر مضاد للهيستون H4 (دي ميثيل K20 ، ثلاثي ميثيل K20)عامل التخفيف Abcamab78517- 1: 500
Rabbit anti-Rec8بإذن من الدكتورة كارين شندلرN /A عامل التخفيف - 1: 10،000
Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>Comments
Secondary Antibodies < / strong>
الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) Alexa Fluor 568 المترافقThermo-Fisher ScientificA-11057عامل التخفيف - 1: 500
الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) Alexa Fluor 488 المترافقThermo-Fisher ScientificA-21202عامل التخفيف- 1: 500
الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) Alexa Fluor 647 المترافقThermo-Fisher ScientificA-31573عامل التخفيف - 1: 500
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) Alexa Fluor 568 المترافقThermo-Fisher ScientificA-11004عامل التخفيف - 1: 500
الماعز المضاد للإنسان IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 488Thermo-Fisher ScientificA-11013عامل التخفيف - 1: 500
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) Alexa Fluor 568 المترافقThermo-Fisher ScientificA-11011عامل التخفيف - 1: 500
شرائح علوم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
  2. Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
  3. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
  4. Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
  5. Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
  6. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
  7. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
  8. Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
  9. Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
  10. Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
  11. Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413(2014).
  12. Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
  13. Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
  14. Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
  15. Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
  16. Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
  17. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  18. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  19. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
  20. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  21. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
  22. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA

مقالات ذات صلة