هذا البروتوكول وصف أسلوب استنساخه وموثوق بها لإعداد المستندة إلى التسامي الفورمالين الثابتة الأنسجة الموجهة للتصوير الطيف الكتلي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين، الكتلي التصوير (استخدام MSI) وقد توسعت بسرعة، منذ هذا الأسلوب بتحليل مجموعة من الجزيئات الحيوية من الأدوية والدهون إلى جليكانس ن. على الرغم من وجود تقنيات إعداد نموذج مختلف، اكتشاف الببتيدات من فورمالدهايد الحفاظ على الأنسجة يبقى واحداً من أصعب التحديات لهذا النوع من التحليل الشامل والمطيافيه. لهذا السبب، نحن إنشاء وتحسين منهجية قوية تحافظ على المعلومات المكانية الواردة ضمن العينة، مع التماس أكبر عدد من الببتيدات التأين. ونحن أيضا تهدف إلى تحقيق هذا الهدف بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وبالتالي القضاء على خطأ التحيز أو إعداد المحتملة، التي يمكن أن تحدث عند استخدام الآلي الأجهزة. والنتيجة النهائية بروتوكول استنساخه وغير مكلفة.
المقدمة
استخدمت الليزر ساعد مصفوفة التصوير (استخدام MSI) الطيف الكتلي الامتزاز/التأين كأسلوب صورة القائمة للعقدين الماضيين1،2، تحليل مجموعة من الجزيئات الحيوية بما في ذلك: الدهون3، الببتيدات2 ،4البروتينات2،5، والايضات6،7، جليكانس ن8والجزيئات الاصطناعية مثل العقاقير العلاجية9،10. ازداد عدد المنشورات التي تبين مدى فائدة هذا الأسلوب إلى حد ك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تنبيه: جميع احتياطات السلامة الواجبة التطبيق ينبغي اتباعها عند تنفيذ هذا الإجراء، بما في ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) (مثلاً، مختبر المعاطف، القفازات النتريل، سلامة النظارات، إلخ)
1-إعداد الكواشف والمعدات
-
إعداد الحلول
- إعداد 500 مل السائل في كارني، خلط الإيثانول 100% (EtOH)، كلوروفورم، وحمض الخليك الجليدية في 6: نسبة 3:1 v/v/v في زجاجة شوت زجاج نظيفة.
- لجعل السائل النيتروسليلوز (NC)، تذوب غشاء NC (تستخدم عادة في النشاف غربي) في الأسيتون أنيق، بالانفعالات لطيف، إلى تركيز نهائي من 40 ملغ/مل.
- إعداد شرائح NC الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إذا اتبعت بشكل صحيح، ينتج هذا البروتوكول الصور التي تمثل وضوح مورفولوجية إجمالية للأنسجة دون أي خدوش أو التشوهات الأخرى (الشكل 1). التحقق من صحة مثالية لإعداد نموذج يقوم بشكل صحيح، القدرة على التمييز بين مختلف الهياكل المادية عن طريق تغيير يجري جزيء شوهدت (الشكل 2).
دليل جيد لتحديد ما إذا كانت العينات قد أعدت بشكل غير صحيح للتحقق من وجود تمركز أو تجميع مصفوفة؛ تواقيع ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تصميم هذا البروتوكول إلى أقصى حد توليد الأنواع الجزيئية التأين في حين القضاء على تمركز لتحليلها. العوامل الرئيسية التي تنطوي على استخدام نفس المبدأ الأسمى عند تطبيق مصفوفة، هضم العينة، أو ريكريستاليزينج بعد التسامي24؛ إلا وهي أن حتى ترسب بخار، مصفوفة أو خلاف ذلك، تحتاج إلى إنشاء وصون. بيبيتينج يغسل المذيب للبلورة والهضم، بالتساوي تحت العينة، يمنع أي منطقة فردية تلقي بخار المذيب أكثر من أي مكان آخر. هذا أمر مهم لمنع تشكيل التكثيف مرئية وعموما يحول دون تمركز الجزيئات السطحية، فضلا عن ضمان أن العي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا يوجد تضارب في المصالح أو المصالح التجارية الكشف عن
شكر وتقدير
الكتاب تود أن تقر بمؤسسة المدرسة الطبية في سيدني وكآبة ومؤسسة لتمويل جزء من هذا العمل من خلال برنامج المنح الدراسية الدكتوراه لأبحاث مرض الزهايمر، ومنحة اكتشاف القوس (DP160102063) منحت إلى PKW.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | لتحضير وتقسيم الأنسجة. |
| مجهر أكسيد القصدير الإنديوم | Bruker | 8237001 | لإعداد وقسم الأنسجة. |
| برطمانات كوبلين | سيجما ألدريتش | S5516 | لتحضير وتقسيم الأنسجة. |
| قدر الضغط | Kambrook | KPR620BSS | لتحضير وتقسيم المناديل. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | لإجراء التسامي. على غرار CG-3038 في التصميم ، ومع ذلك ، فقد تم صنعه حسب الطلب ؛ |
| حمام الرمل | NA | NA | لإجراء التسامي. رمل نهر ناعم الدرجة محفوظة في رقائق الألومنيوم المطوية التي يتم الحصول عليها من الخارج وليس من أي شركة معينة |
| Glass Petri Dish | Sigma | Aldrich CLS70165100 | لإجراء التسامي. |
| مضخة فراغ | NA | NA | لإجراء التسامي. مصدرها كقطعة غيار من مطياف الكتلة القديم ؛ |
| فخ بارد | كيم زجاج | CG-4510-02 | لإجراء التسامي. |
| لوحة ساخنة | جون موريس | EW-15956-32. | لإجراء التسامي. |
| طبق بتري بلاستيك | سيجما ألدريتش | Z717223 | لإجراء التسامي. |
| 37 درجة ؛ حاضنة C | NA | NA | لإجراء التسامي. لا ينطبق ، الحاضنة غير معقمة ويزيد عمرها عن 30 عاما ؛ |
| ورقة النشاف | Sigma Aldrich | P7796 | لإجراء التسامي. |
| النيتروسليلوز | سيجما ألدريتش | N8395 | لغسل الشرائح. |
| الأسيتون | سيجما ألدريتش | 650501 | لغسل الشرائح. |
| زيلين | سيجما ألدريتش | 214736 | لغسل الشرائح. |
| 100٪ EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | لغسل الشرائح. |
| 70٪ EtOH | Sigma Aldrich | NA | لغسل الشرائح. صنع في المختبر من 95٪ مخزون من الإيثانول |
| الكلوروفورم | سيجما ألدريتش | C2432 | لغسل الشرائح. |
| حمض الخليك الجليدي | سيجما ألدريتش | ARK2183 | لغسل الشرائح. |
| تريس هيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8 | سيجما ألدريتش | TRIS-RO | للانقسام المحلل للبروتين. مسحوق مصنوع إلى 1 متر متبوعا بالتوازن مع 32٪ حمض الهيدروكلوريك إلى درجة الحموضة 8.8 |
| مللي Q ماء فائق النقاء | سيجما ألدريتش | NA | للانقسام المحلل للبروتين. التنقية التي يتم إجراؤها في المنزل بواسطة نظام تنقية المياه Sartorious |
| الأمونيوم بيركربونات | Sigma Aldrich | A6141 | للانقسام المحلل للبروتين. |
| التربسين | سيجما ألدريتش | T0303 | للانقسام المحلل للبروتين. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | لإعادة التبلور. |
| أسيتونيتريل | سيجما ألدريتش | 1.00029 | لإعادة التبلور. |
| حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) | سيجما | ألدريتش 302031 | لإعادة التبلور. |
المراجع
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
