الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

Summary

هذا البروتوكول وصف أسلوب استنساخه وموثوق بها لإعداد المستندة إلى التسامي الفورمالين الثابتة الأنسجة الموجهة للتصوير الطيف الكتلي.

Abstract

استخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين، الكتلي التصوير (استخدام MSI) وقد توسعت بسرعة، منذ هذا الأسلوب بتحليل مجموعة من الجزيئات الحيوية من الأدوية والدهون إلى جليكانس ن. على الرغم من وجود تقنيات إعداد نموذج مختلف، اكتشاف الببتيدات من فورمالدهايد الحفاظ على الأنسجة يبقى واحداً من أصعب التحديات لهذا النوع من التحليل الشامل والمطيافيه. لهذا السبب، نحن إنشاء وتحسين منهجية قوية تحافظ على المعلومات المكانية الواردة ضمن العينة، مع التماس أكبر عدد من الببتيدات التأين. ونحن أيضا تهدف إلى تحقيق هذا الهدف بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وبالتالي القضاء على خطأ التحيز أو إعداد المحتملة، التي يمكن أن تحدث عند استخدام الآلي الأجهزة. والنتيجة النهائية بروتوكول استنساخه وغير مكلفة.

Introduction

استخدمت الليزر ساعد مصفوفة التصوير (استخدام MSI) الطيف الكتلي الامتزاز/التأين كأسلوب صورة القائمة للعقدين الماضيين^1،2، تحليل مجموعة من الجزيئات الحيوية بما في ذلك: الدهون³، الببتيدات^{2 ،4}البروتينات^2،5، والايضات^6،7، جليكانس ن⁸والجزيئات الاصطناعية مثل العقاقير العلاجية^9،10. ازداد عدد المنشورات التي تبين مدى فائدة هذا الأسلوب إلى حد كبير على الماضي العقد^6،11،،من¹²¹³. بعض الجزيئات، مثل الدهون، سهلة نسبيا لتحليل عن طريق استخدام MSI، كما أنها تتأين سهولة نظراً لطبيعتها الكيميائية ومن ثم تتطلب إعداد مسبق قليلاً³. أكثر صعوبة من الأهداف مثل الببتيدات والخطوات المطلوبة لفعالية تتأين هذه الجزيئات غير واسعة ومعقدة عموما¹⁴. وهناك حاليا عدد قليل جداً من المنشورات التي تهدف إلى معالجة أو إثبات إمكانية تكرار نتائج في المنهجيات التي تستخدم لإعداد الأنسجة لهذه التقنية البصرية الفريدة¹⁵. ولهذا السبب، لدينا تجميع الملاحظات وتنفيذ تحسينات في واحدة، سهلة التنفيذ، المنهجية التي ينبغي أن تتطلب القليل إلى أي تعديل، لتحليل الببتيدات من فورمالدهايد تصميمهما الأنسجة المصدر¹⁴.

في هذه المخطوطة، لقد قمنا بوصف منهجية استنساخه تم التحقق من صحتها، ومنخفضة التكلفة للكشف ورسم الخرائط المكانية من الببتيدات، المتولدة من الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) أقسام الأنسجة وثابتة الفورمالين المجمدة (FFF). لا تتطلب هذه المنهجية أو الاعتماد على أي الأجهزة المتخصصة³. على وجه التحديد، علينا التصدي للجوانب العديدة لإعداد نموذج المتخصصة اللازمة لتحليل الببتيدات؛ خطوات مثل استرجاع مستضد¹⁶ ومصفوفة الطلاء. لدينا بروتوكول يستخدم أيضا معدات غير مكلفة والمواد الكاشفة، مما يجعل هذه المنهجية من الوصول إلى مجتمع أوسع الذي خلاف ذلك سيكون غير قادر على تحمل تكاليف الأجهزة الروبوتية بديل¹⁷.

كان السبب الكامن وراء تطوير أسلوب إعداد عينة يدوي شقين: أولاً، استخدام سوبليماتور يقوم بطلاء متجانسة ومتسقة من بلورات المصفوفة التي هي ~ 1 ميكرومتر في الطول¹⁸، شيء لا يمكن تحقيقه برش أكثر شيوعاً تقنيات. ثانيا، إعداد تكاليف صغيرة نسبيا: بلغت التكلفة الإجمالية لجهاز مخصص < 1500 دولار أسترالي ونلاحظ، من حيث فعالية التكاليف، السعر لكل عينة أرخص بكثير عندما يوجد لا الآلات الروبوتية. استخدام التسامي أبلغ سابقا، ومع ذلك، على حد علمنا، لم تم الإبلاغ عن المنهجيات خطوة بخطوة التي تصف هذه العملية ونماذج إعداد لا الموصوفة في الأدب.

هذا البروتوكول يهدف إلى مساعدة الباحثين التي يستطيعون الوصول إلى استخدام مطياف كتلة، والذين عازمة على توليد المعلومات المكانية بالنسبة لجزيء بيو الفائدة¹⁹. في جوهرها، هي استخدام MSI شكلاً من أشكال النسيجي الفرز التي لا تعتمد على الأجسام المضادة أو البقع².

Protocol

تنبيه: جميع احتياطات السلامة الواجبة التطبيق ينبغي اتباعها عند تنفيذ هذا الإجراء، بما في ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) (مثلاً، مختبر المعاطف، القفازات النتريل، سلامة النظارات، إلخ)

1-إعداد الكواشف والمعدات

1. إعداد الحلول
   1. إعداد 500 مل السائل في كارني، خلط الإيثانول 100% (EtOH)، كلوروفورم، وحمض الخليك الجليدية في 6: نسبة 3:1 v/v/v في زجاجة شوت زجاج نظيفة.
   2. لجعل السائل النيتروسليلوز (NC)، تذوب غشاء NC (تستخدم عادة في النشاف غربي) في الأسيتون أنيق، بالانفعالات لطيف، إلى تركيز نهائي من 40 ملغ/مل.
2. إعداد شرائح NC المغلفة
   1. استخدام تقنية مماثلة لتلك المستخدمة لإعداد الدم مسحات ل الفحص النسيجي²⁰ إلى إعداد NC مغلفة بالشرائح.
   2. "الماصة؛" ميليلتر 40 من نورث كارولاينا السائل على حافة واحدة من شريحة مجهر إنديوم موصل أكسيد القصدير (إيتو). استخدام شريحة الميكروسكوب زجاجية عادية، اسحب NC تحت التوتر السطحي عبر الشريحة لإنشاء طلاء حتى رقيقة.
   3. تسمح NC لتجف في درجة حرارة الغرفة 20 s والمتجر ثم حتى حاجة في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين العينات في ظل هذه الظروف إلى أجل غير مسمى شريطة المحافظة على الأنسجة وخالية من الغبار.
      ملاحظة: هذا الأسلوب من إعداد المعروف "رقيقة" وسوف ينتج طلاء موحد يعتمد على لزوجة NC، فضلا عن افتقاره إلى التوتر السطحي المستوى الذاتي على الشريحة. فقط الرعاية التي ينبغي اتخاذها عند إعداد الشرائح لا تتحرك بسرعة كبيرة جداً، مما سيخلق الشرائط NC بدلاً من تغطية كاملة.
      تنبيه: كما NC السائل يجف بسرعة كبيرة، من الضروري للعمل بسرعة لتفادي التجفيف الحل قبل قد انتشر بشكل صحيح. ينبغي أيضا توخي الحذر عند التعامل مع نورث كارولاينا في حالته السائلة، كما هو مركب نشيطة جداً ولا ينبغي الاتصال بمصدر الإشعال منع انفجار حارقة. كما يخضع NC انتقالات ماص للحرارة عند التجفيف ويمكن أن تسبب الحروق الباردة إذا سمح لفترات طويلة تتلامس مع الجلد أو الأيدي القفاز. لتقليل المخاطر المرتبطة بها جميعا، ينبغي إعداد كميات صغيرة فقط في كل مرة (< ينصح مل 1). وبمجرد جفاف أنها مستقرة في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، يمكن أن تظل NC المتفجرة عندما تكون موجودة بكميات كبيرة.
3. إنشاء دوائر بخار مخصصة
   1. قص قطعة من ورق نشاف ثخين مع زوج من مقص كبيرة بما يكفي لاحتواء الجزء السفلي نصف طبق بيتري البلاستيك القياسية (94 مم وقطرها 3 مم).
   2. قص الورقة، ترك شريط مستطيل في الوسط، بنفس حجم شريحة مجهر، ترك ما يكفي الزائدة حيث أن الورقة سوف تحافظ على موقفها في طبق بتري (تكميلية الشكل 1).

2-إعداد مقاطع الأنسجة

1. الأنسجة FFPE²¹.
   1. حدد كتلة الأنسجة المرجوة وقسم أنه في 12 ميكرون سمك في مقاعد البدلاء قياسية محملة مبضع وتعويم جبل على NC المغلفة مسبقاً إيتو الشرائح.
   2. غمر شرائح زيلين نفط جديدة لإزالة البارافين المتبقية لمدة 2 دقيقة، وكرر العملية مرة ثانية.
      ملاحظة: إذا كانت كتلة البارافين منتشر خاصة أو الأنسجة صغيرة نسبيا بالمقارنة مع كتلة البارافين، يمكن تسخين العينات عند 60 درجة مئوية لإذابة أغلبية بعيداً قبل الغسيل في زيلين نفط.
   3. تغسل العينات ديبارافينيزيد بغمر الشرائح في سلسلة المذيبات متدرج: 70% v/v EtOH المياه، 100% EtOH، كارني للسوائل، 100% EtOH، مياه نقية جداً و 100% EtOH. وينبغي أن تكون مدة غمر كل 30 ثانية، باستثناء السائل في كارني، والتي يجب أن تستمر 2 دقيقة.
      تنبيه: السائل في كارني وزيلين نفط يجب المخزنة والمستخدمة في غطاء دخان، كما أنها شديدة السمية إذا استنشق.
2. الأنسجة الثابتة الفورمالين المجمدة (FFF)
   ملاحظة: العينات يجب الفعل تجميد، على نحو مناسب وفقا لنوع العينة.
   1. حجته كتلة الأنسجة عند درجة حرارة التشغيل مبضع ل 20 دقيقة²².
      ملاحظة: درجة حرارة الموازنة تعتمد على نوع الأنسجة.
   2. قسم الأنسجة باستخدام مبضع في جبل 12 ميكرومتر وذوبان الجليد المقاطع على NC معدّة سلفا المغلفة إيتو الشريحة.
   3. تخزين الشرائح في مجفف فراغ على مقاعد البدلاء في الظلام.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات لعدة أسابيع في ظل هذه الظروف.
   4. تغسل العينات في سلسلة المذيبات متدرج كما ذكر للأنسجة FFPE (2.1.3).
      ملاحظة: ليست هناك حاجة لخطوة ديبارافينيسيشن زيلين نفط ليس هو جزءا لا يتجزأ من العينة.

3-الميثيلين التشعب التحلل المائي

1. تحميل الشرائح عينة (FFF أو FFPE) في مربع شريحة بلاستيكية التي مليئة بالأعلى 20 ملمول تريس-HCl (pH 8.8). ختم المربع ووضعه في حمام مائي، التي تحتوي على 500 مل الماء، يسمح مربع للمس الأسفل. ثم الحرارة لمدة 15 دقيقة على 120 درجة مئوية في طنجرة الضغط الذي يمكن أن تحققه ضغط تشغيل 70 كيلو باسكال.
2. إزالة الشرائح، وتسمح لهم ببارد، والسماح لهم الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

4-الأنسجة الهضم

1. عندما تحلل، معطف العينات مع 10 ميليلتر لحل التربسين (1 ملغ/مل) في المياه النقية فائقة، قبل بيبيتينج ميليلتر 10 الحل على حافة مقطع الأنسجة، ثم استخدام نفس تلميح ماصة، اسحب الحبرية عبر السطح كله من الأنسجة تحت سطح التوتر.
   ملاحظة: تجنب خدش سطح النسيج مع طرف ماصة، وعبر نشر الإنزيم خارج حدود حواف الأنسجة.
2. تسمح العينات لتجف في درجة حرارة الغرفة.
3. وبمجرد جفاف، جبل العينات داخل الجزء العلوي من قاعة بخار شيدت سابقا (الأنسجة أسفل) مع شريط اﻷوتوكﻻف أما الحافة من الشريحة (تكميلية الشكل 2).
4. "الماصة؛" 600 ميليلتر من محلول يحتوي على مزيج 1:1 v/v من بيكربونات الأمونيوم الاسيتو الانيتريل و 50 مم 100% بعناية على ورقة نشاف الإصبع في الجزء السفلي من صحن بيتري حتى يبدو أن الإصبع الرطب بالتساوي.
5. ضع النصف العلوي من قاعة بخار في أسفل النصف، وضمان الشريحة الإصبع ونموذج ورقة محاذاة تماما، وختم الدائرة حول به خط الاستواء مع الفيلم البارافين.
6. اترك العينة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح بإكمال عملية الهضم.

5-مصفوفة الطلاء عبر التسامي

1. وبمجرد يهضم، تزن الشريحة عينة على توازن ميكرواناليتيكال 5 أرقام.
2. جبل الشريحة على إصبع تبريد جهاز التسامي وآمنة مع الشريط النحاس، بنفس الطريقة كما هو موضح لقاعة بخار (تكميلية الشكل 3).
   ملاحظة: للتأكد من أن الشريحة يتم الاتصال بالتساوي بأصبع التبريد، يتم وضع طبقة من الشريط النحاس على الجزء السفلي من إصبع تبريد مستوى السطح. وهذا ما يضمن أن الشريحة يتم تبريده بشكل متساو مما يؤدي إلى ترسب حتى من المصفوفة.
3. ضع 300 ملغ من حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك (شكا) مصفوفة في طبق بتري زجاج في الجزء السفلي من الدائرة وانتشارها بشكل متساو لخلق طبقة رقيقة من بلورات المصفوفة.
4. التجمع في سوبليماتور وتأمين النصفي مع المشبك حدوة الحصان. تعليق تجميع الوحدة 15-20 سم فوق حمام رملي، يسخن في 220 درجة مئوية، بوضعه في حلقة معدنية متصلة بموقف معوجة.
5. توصيل الدائرة بمصدر فراغ والانخراط في الفراغ، والسماح لها بتحقيق الاستقرار وصولاً إلى متور ~ 25 لمدة 5 دقائق.
6. حزمة إصبع تبريد إلى الأعلى مع الجليد وإضافة 50 مل الماء. السماح لجهاز لتسوية 5 دقائق أخرى قبل المتابعة.
7. انخفاض الدائرة على سطح الرمل، ضمان اتصالات الرمال تماما الجزء السفلي من الغرفة، وترك الأمر لمدة 45 دقيقة لإنشاء طلاء مثالية من 0.22 ملغم/سم²
   تنبيه: يجب توخي الحذر عند التعامل مع الأواني الزجاجية في فراغ عالية، كأي ضرر للجهاز، في حين تم إجلاء، يمكن أن يؤدي في فشل ذريع لقاعة الزجاج.
8. وبعد 45 دقيقة، إزالة الدائرة من حمام الرمل برفع حلقة معدنية والتنفيس عن الدائرة.
   ملاحظة: بمجرد قد تم تنفيس الدائرة، الشريحة يجب إزالتها بشكل سريع جداً كما سوف تبدأ المياه في الجو تتكثف على الشريحة الإصبع وعينه تجميد.
9. قم بإزالة الشريحة وتزن على كفالة الطلاء المطلوب قد تحقق.
   ملاحظة: إذا أنجز طلاء غير كافية، ببساطة تكرار عملية التسامي للشريحة حتى سمك الطلاء المطلوب قد تحقق.

6-البلورة

1. بمجرد المتسامي، جبل الشريحة عينة داخل الجزء العلوي من قاعة بخار المشيدة سابقا، كما وصف سابقا (الأنسجة إلى الأسفل).
2. "الماصة؛" 600 ميليلتر من محلول يحتوي على 1:1 (v/v) مزيج من حامض trifluoroacetic v/v الاسيتو الانيتريل و 0.1% 100% في الماء بعناية على ورقة نشاف في الجزء السفلي من صحن بيتري لضمان طلاء حتى.
3. تجميع الدائرة، وضمان الشريحة التبويب ومجهر ورقة محاذاة تماما، وترك في حاضنة 37 درجة مئوية أجل ح 1.
   تنبيه: لا ختم الدائرة.
   ملاحظة: مرة واحدة يتطلب، هوي الأصفر عادة من المصفوفة يجب تغيير إلى اللون الأبيض وتبدو أقل لامعة وتظهر جداً حتى. يشير هذا إلى أن البلورة قد أجريت بشكل صحيح.
4. النموذج جاهز الآن للتحليل.

7-الأجهزة

1. تفحص الشريحة في الماسح ضوئي مسطح لإنشاء صورة رقمية.
2. تحميل العينة في مطياف كتلة وتحليلها ثم استخدام منصة برمجيات مناسبة.
3. تحليل العينات في وضع ريفليكترون أيون إيجابية مع مجموعة شامل دا 750-3,500، مع دقة موضعية التي تنطبق على النتيجة المرجوة. في معظم الحالات، 20-50 ميكرون النقطية العرض غير كافية، ولكن أقل من 10 ميكرون يمكن أن تستخدم¹⁵.
   تحذير: استخدام الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر مصدرا من مصادر الإشعاع المؤين وينبغي أن لا ينظر إليها مباشرة. ضمان أن الليزر يرد ضمن صك التدريع قبل إجراء العملية.

Results

إذا اتبعت بشكل صحيح، ينتج هذا البروتوكول الصور التي تمثل وضوح مورفولوجية إجمالية للأنسجة دون أي خدوش أو التشوهات الأخرى (الشكل 1). التحقق من صحة مثالية لإعداد نموذج يقوم بشكل صحيح، القدرة على التمييز بين مختلف الهياكل المادية عن طريق تغيير يجري جزيء شوهدت (الشكل 2).

دليل جيد لتحديد ما إذا كانت العينات قد أعدت بشكل غير صحيح للتحقق من وجود تمركز أو تجميع مصفوفة؛ تواقيع ال...

Discussion

تم تصميم هذا البروتوكول إلى أقصى حد توليد الأنواع الجزيئية التأين في حين القضاء على تمركز لتحليلها. العوامل الرئيسية التي تنطوي على استخدام نفس المبدأ الأسمى عند تطبيق مصفوفة، هضم العينة، أو ريكريستاليزينج بعد التسامي²⁴؛ إلا وهي أن حتى ترسب بخار، مصفوفة أو خلاف ذلك، تحتاج إلى إنشاء وصون. بيبيتينج يغسل المذيب للبلورة والهضم، بالتساوي تحت العينة، يمنع أي منطقة فردية تلقي بخار المذيب أكثر من أي مكان آخر. هذا أمر مهم لمنع تشكيل التكثيف مرئية وعموما يحول دون تمركز الجزيئات السطحية، فضلا عن ضمان أن العي...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryo Microtome	Leica	CM3050	لتحضير وتقسيم الأنسجة.
مجهر أكسيد القصدير الإنديوم	Bruker	8237001	لإعداد وقسم الأنسجة.
برطمانات كوبلين	سيجما ألدريتش	S5516	لتحضير وتقسيم الأنسجة.
قدر الضغط	Kambrook	KPR620BSS	لتحضير وتقسيم المناديل.
Sublimator	Chem Glass	NA	لإجراء التسامي. على غرار CG-3038 في التصميم ، ومع ذلك ، فقد تم صنعه حسب الطلب   ؛
حمام الرمل	NA	NA	لإجراء التسامي. رمل نهر ناعم الدرجة محفوظة في رقائق الألومنيوم المطوية التي يتم الحصول عليها من الخارج وليس من أي شركة معينة
Glass Petri Dish	Sigma	Aldrich CLS70165100	لإجراء التسامي.
مضخة فراغ	NA	NA	لإجراء التسامي. مصدرها كقطعة غيار من مطياف الكتلة القديم   ؛
فخ بارد	كيم زجاج	CG-4510-02	لإجراء التسامي.
لوحة ساخنة	جون موريس	EW-15956-32.	لإجراء التسامي.
طبق بتري بلاستيك	سيجما ألدريتش	Z717223	لإجراء التسامي.
37 درجة ؛ حاضنة C	NA	NA	لإجراء التسامي. لا ينطبق ، الحاضنة غير معقمة ويزيد عمرها عن 30 عاما ؛
ورقة النشاف	Sigma Aldrich	P7796	لإجراء التسامي.
النيتروسليلوز	سيجما ألدريتش	N8395	لغسل الشرائح.
الأسيتون	سيجما ألدريتش	650501	لغسل الشرائح.
زيلين	سيجما ألدريتش	214736	لغسل الشرائح.
100٪ EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	لغسل الشرائح.
70٪ EtOH	Sigma Aldrich	NA	لغسل الشرائح. صنع في المختبر من 95٪ مخزون من الإيثانول
الكلوروفورم	سيجما ألدريتش	C2432	لغسل الشرائح.
حمض الخليك الجليدي	سيجما ألدريتش	ARK2183	لغسل الشرائح.
تريس هيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8	سيجما ألدريتش	TRIS-RO	للانقسام المحلل للبروتين. مسحوق مصنوع إلى 1 متر متبوعا بالتوازن مع 32٪ حمض الهيدروكلوريك إلى درجة الحموضة 8.8
مللي Q ماء فائق النقاء	سيجما ألدريتش	NA	للانقسام المحلل للبروتين. التنقية التي يتم إجراؤها في المنزل بواسطة نظام تنقية المياه Sartorious
الأمونيوم بيركربونات	Sigma Aldrich	A6141	للانقسام المحلل للبروتين.
التربسين	سيجما ألدريتش	T0303	للانقسام المحلل للبروتين.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	لإعادة التبلور.
أسيتونيتريل	سيجما ألدريتش	1.00029	لإعادة التبلور.
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA)	سيجما	ألدريتش 302031	لإعادة التبلور.