نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

ملخص

نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنتاجها إسكات الجينات مورين ناغورني كاراباخ الخلايا باستخدام نظام تمايز خالية من التغذية للدراسة الميكانيكية في المختبر و في فيفو.

الملخص

تنتمي إلى نظام المناعة الفطرية الطبيعية القاتل من الخلايا (ناغورني كاراباخ) وهي الخط الأول لمكافحة سرطان المناعي دفاع؛ ومع ذلك، أنها تقمع في ورم المكروية والآلية الأساسية التي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. يحد عدم وجود مصدر متسقة وموثوق بها للخلايا ناغورني كاراباخ تقدم البحوث الحصانة خلية ناغورني كاراباخ. هنا، نحن التقرير في المختبر نظام التي يمكن أن توفر عالية الجودة والكمية المستمدة من نخاع العظم خلايا ناغورني كاراباخ مورين تحت شرط خالية من علبة التغذية بالورق. الأهم من ذلك، نبدي أيضا إسكات الجينات بوساطة siRNA أن يمنع نضوج الخلية E4bp4-تعتمد على ناغورني كاراباخ بنجاح باستخدام هذا النظام. وهكذا، هذه الرواية في المختبر ناغورني كاراباخ الخلية التفريق بين النظام حل مادة بيولوجية للبحوث الحصانة.

المقدمة

تطور السرطان يعتمد إلى حد كبير على ورم المكروية^1،2، بما في ذلك إيمونوسيتيس المستمدة من المضيف، مثلاً، خلايا ناغورني-كاراباخ. وأظهرت دراسات عدة أن ناغورني كاراباخ intratumoral الخلايا ترتبط سلبا مع^3،4تطور الورم. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات السريرية أن ناغورني كاراباخ خلية العلاج التبني استراتيجية ممكنة للسرطان^5،،من^67،،من⁸⁹. ناغورني كاراباخ المستندة إلى خلايا السرطان العلاج المناعي قد اقترح مؤخرا كخيار علاجي للأورام الصلبة، ولكن توجد تحديات بسبب إفراز السيتوكينات كآبته ودوونريجوليشن لتفعيل يغاندس في المكروية الأورام الصلبة ^10،11. تحويل عامل النمو-بيتا (TGF-β) قد اقترح القيام بدور قمعية في التسرطن، ولكن من المفارقات أيضا إنتاج الخلايا السرطانية TGF-β1 لدعم التنمية ورم^12،،من^{1314 , 15}-مما يشير إلى TGF-β يمكن قمع النشاط عن ناغورني كاراباخ الخلايا عن طريق تنظيم أسفل استجابة انترفيرون ووساطة CD16 انترفيرون-غاما (IFN-γ) الإنتاج في المختبر^{16،17، 18}.

على الرغم من أن قد يكون تعطل إشارات TGF-β في ورم المكروية طريقة ممكنة للقضاء على أمراض السرطان، حجب تماما مما يشير إلى TGF-β سوف يسبب أمراض المناعة الذاتية بسبب وظيفتها للالتهابات، كما يدل على ذلك وضع الآثار الجانبية الضارة بما في ذلك التهاب النظامية، تشوهات القلب والأوعية الدموية، والمناعة الذاتية في الماوس نماذج¹⁹. ومن ثم، فهم إليه العامل TGF-β-بوساطة الكبت المناعي سوف يؤدي إلى تحديد هدف العلاجية موجوداً لعلاج السرطان.

لتوضيح الأحداث الجزيئية الضرورية للتنمية الخلية ناغورني-كاراباخ، أنشأت ويليامز et al. نظاما في المختبر للتفريق بين الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام مورين في ناغورني كاراباخ الخلايا²⁰. وييسر هذا النظام إلى حد كبير الدراسة الميكانيكية للتنمية الخلية ناغورني كاراباخ، بما في ذلك تحديد المتكفل رواية من ناغورني كاراباخ الخلايا²¹. ومع ذلك، ينبغي أن تكون مثقف المتكفل نخاع العظام في النظام مع دعم الخلايا اللحمية OP9 كتغذية طبقة^20،21، ويحد هذا السكان خلية غير متجانسة إلى حد كبير تطبيق مزيد من تعطيل الجينات أدوات (مثلاً، إسكات الجينات بوساطة siRNA) المطبقة على وجه التحديد إلى تمييز الخلايا ناغورني-كاراباخ.

وهنا يصف لنا نظام خال من علبة التغذية بالورق الذي تم وضعه عن طريق زيادة تعديل النظام في المختبر وآخرونويليامز²⁰. في نظامنا، وخلايا التغذية اللحمية OP9 غير مطلوبة، وبدلاً من ذلك OP9 يستخدم المتوسط الشرطي دون التأثير على التفريق بين ناغورني كاراباخ الخلايا في المختبر، وهذا مؤخرا يؤدي بنا إلى الكشف عن أن TGF-β غير قادرة على تعزيز تطور السرطان عن طريق قمع التنمية الخلية E4bp4-تعتمد على ناغورني كاراباخ في ورم المكروية²². ويوفر هذا النظام الرواية بنجاح أسلوب خال من الخلفية لتوضيح الآلية الجزيئية للتنمية الخلية ناغورني كاراباخ تحت شروط معينة (مثلاً، ارتفاع TGF-β1، إسكات الجينات بوساطة siRNA، إلخ.) في المختبر.

البروتوكول

البروتوكول للحصول على والتفريق بين ناغورني كاراباخ المشتقة من نخاع العظم خلايا (بي أم-ناغورني كاراباخ) يستند إلى أساليب المنشورة سابقا^20،،من²¹²². تمت الموافقة على جميع الإجراءات مع الفئران بالحيوان الأخلاقيات التجريبية اللجنة (الكنائس) في الجامعة الصينية في هونج كونج.

1-إعداد متوسطة الشرطي OP9

1. الثقافة خط الخلية ستروما مورين OP9 في ألفا-الفنزويلية التي تحتوي على 20% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100 ز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل، في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد من الهواء/CO₂ (95%: 5 ٪).
   1. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير، ثم البذور 2 × 10⁶ خلايا OP9 لكل قارورة الثقافة² 75 سم مع 15 مل متوسطة. الثقافة من أجل ح 48.
   2. عندما يصل الثقافة إلى التقاء 80%، يغسل قارورة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 20 مل متوسطة ألفا-الفنزويلية عادي (بدون FBS والمضادات الحيوية) كل قارورة.
2. جمع المتوسطة شرط OP9 من قارورة الثقافة في 24 ساعة وتنظيف الحطام خلية مع 0.25 ميكرومتر بولييثيرسولفوني (PES) تصفية والحفاظ عليها عند 4 درجة مئوية (استخدم في غضون أسابيع 2).

2-عزل خلايا نخاع العظام الماوس

1. Euthanize ماوس C57BL/6J عمرها 12 أسبوع مع جرعة بينتوباربيتوني (100 مغ/كغ، والحقن داخل). تأكيد وفاة بسبب عدم التنفس، ثم الحصاد عظام الفخذ مع قطع سكين جراحية في الوصلات بين العظام وإزالة العضلات المتبقية مع الشفرة بخدش لطيف.
2. وضع العظام في أنبوب الطرد مركزي 50 مل يحتوي على ألفا العقيمة برود-الفنزويلية، وقم بتنفيذ الخطوات التالية في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
3. تجاهل المتوسطة ألفا-الفنزويلية، وشطف العظام مع الإيثانول 70% لمدة 30 ثانية.
4. غسل العظام مع PBS العقيمة المثلج مرتين لتنظيف الإيثانول المتبقية.
5. نقل العظام في قذيفة هاون تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، وفراجمينتيزي العظام برفق مع مدقة (لا يطحنون لهم).
6. تحرض العظام برفق بدوامات المدقة إطلاق خلايا النخاع العظمى في برنامج تلفزيوني. جمع الخلايا نخاع العظام التي تحتوي على برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة.
7. كرر الخطوة 2.6 لأربع مرات حتى تصبح شظايا العظام صلبة بيضاء اللون.
8. الطرد المركزي الأنبوب في 465 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم تجاهل المادة طافية.
9. ريسوسبيند بيليه مع 18 مل ماء المقطر المعقم والسماح لها الوقوف لمدة 30 ثانية لإزالة خلايا الدم الحمراء.
10. إضافة 2 مل 10 المثلج X برنامج تلفزيوني التوقف عن رد فعل، ثم تصفية الخليط من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة خلايا الدم الحمراء ليسيد.
11. الطرد المركزي الأنبوب في 465 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه مع 20 مل من برنامج تلفزيوني المثلج.
12. غسل الخلايا بتكرار الخطوة 2.11 مرة ثانية.
13. نقل بيليه الخلية في 100 ملم معقمة بيتري طبق مع 10 مل من OP9 المتوسطة الشرطي من الخطوة 1، 2 وتستكمل مع 20% FBS وخليط من 0.5 نانوغرام/مليلتر مورين إيل-7, 30 نانوغرام/مليلتر الماوس صندوق إنقاذ الطفولة، و flt3L مورين يو/مليلتر 100.
14. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ ل 2 حاء نقل الخلايا فاتحة في وعاء ثقافة جديدة في كثافة 5 × 10⁵ صالحة خلايا/مل (حساب عدد الخلايا التي هيموسيتوميتير مع استبعاد تريبان الأزرق) مع نفس الصيغة المتوسطة كما هو الحال في الخطوة 2، 13 ، واحتضان في 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
15. في يوم 4، تستكمل تغيير شرط الثقافة المتوسطة الشرطي OP9 مع 20% FBS و 2,000 يو/مليلتر من مورين إيل-2.
16. تحديث المتوسط الثقافة كل 3 أيام؛ يمكن الحصول عليها من يوم 7 ناضجة ناغورني كاراباخ الخلايا والمؤهلين كما هو الحال في القسم 4.

3-بوساطة siRNA سيلينسينج الجينات "التفريق بين الخلايا ناغورني كاراباخ"

1. بريمكس siRNA أو هراء عنصر التحكم (NC) مع عامل تعداء وفقا لدليل المنتج.
2. نفذ الخطوة 3.1 في أي وقت منذ اليوم 0.
3. إضافة 50 نانومتر siRNA أو خليط NC للخلايا من الخطوة 2، 14.
4. كرر الخطوة 3.1 على كل المرطبات متوسطة الحجم (مثلاً، اليوم 0 و 4 و 7) حتى نقطة النهاية التجريبية.

4-تحليل تمايز خلية ناغورني كاراباخ باستخدام التدفق الخلوي

1. عند نقطة في وقت مناسب، بجمع التعليق للتفريق بين الخلايا وتغسل مع برنامج تلفزيوني المثلج.
2. إصلاح الخلايا مع المخزن المؤقت لتثبيت الخلية وفقا لدليل المنتج.
3. تغسل الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني المثلج، ومن ثم ريسوسبيند 1 × 10⁶ خلايا في 100 ميليلتر من "التدفق الخلوي تلطيخ المخزن المؤقت" الذي يتضمن مترافق Cy3 المضادة الماوس NKp46 ومترافق PE الأجسام المضادة CD244 المضادة الماوس في تخفيف نسبة 1: 100.
4. وصمة عار العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ح 2.
5. ريسوسبيند العينات الملون مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، ثم الحصول على بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحليلها مع سيتوبانك منصة²⁰ (http://cytobank.org/).

النتائج

يتم الحصول على نتائج الممثل بعد وصف البروتوكول. كانت تزرع خلايا نخاع العظام مجموع تعليق تحت نظام التمايز خالية من علبة التغذية بالورق لمدة 11 يوما؛ ولوحظ زيادة كبيرة في معدل انتشار يوم 7 مقارنة مع عدد مجموع الخلايا في اليوم 0 (الشكل 1أ). عثر ناضجة ناغورني كاراباخ الخلايا مع ارتفاع نسبة النووي إلى هيولى ومورفولوجيا السيتوبلازم الحبيبية الغنية يوم 6 في النظام (الشكل 1ب).

المناقشة

في هذا العمل، لقد قمنا بوصف طريقة جديدة لإنتاج المشتقة من نخاع العظم مورين ناغورني كاراباخ الخلايا في المختبر. وحدة تغذية الخلية في^21،النظام الأصلي²² بنجاح محله المتوسطة الشرطي من الخلايا OP9، مما زاد إلى حد كبير في استقرار نظام التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، أن النظام يمكن أن تنتج كمية عالية ونقاء ناضجة ناغورني-كاراباخ الخلايا في المختبر كذلك في فيفو فحوصات، التي يمكن أن تيسر الدراسة الميكانيكية، فضلا عن البحوث متعدية الجنسيات من ناغورني ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خط خلية OP9	ATCC	ATCC® < / sup> CRL-2749& < / sup>
MEM &alpha ؛ بدون نيوكليوسيدات	جيبكو	22561021
مصل الأبقار الجنيني	جيبكو	10500064
PBS ، درجة الحموضة 7.4	Gibco	10010049
الفئران المؤتلف IL-7	PEPROTECH	217-17
المؤتلف الفئران SCF	PEPROTECH	250-03
المؤتلف الفئران Flt3-Ligand	PEPROTECH	250-31L
المؤتلف الفئران IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX كاشف الإرسال	Invitrogen	1377815
IC Tتثبيت Buffer   ؛	eBioscience	00-8222-49
Flow Cytometry Staining Buffer	eBioscience	00-4222-26
PE المترافق المضاد للفأر CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3 المترافق المضاد للفأر NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
التحكم في الهراء (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA ضد الماوس E4BP4 mRNA	Ribobio	N / A	5 & prime ؛ -GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3 & مقتبل;