مقالة منهجية

تحليل موائع جزيئية خلية واحدة نجحت عصية

DOI:

10.3791/56901

⸱

يناير 26, 2018

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم طريقة لتحليل موائع جزيئية الأنساب الخلية البكتيرية الفردية باستخدام نجحت عصية على سبيل مثال. الأسلوب ويتغلب على أوجه قصور أساليب التحليلية التقليدية في علم الأحياء الدقيقة بالسماح بمراقبة مئات الأجيال الخلية تحت ظروف النمو يمكن السيطرة عليها بشكل محكم وموحدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التكنولوجيا موائع جزيئية ويتغلب على العديد من القيود المفروضة على الطرق التحليلية التقليدية في علم الأحياء المجهرية. خلافا لأساليب الثقافة السائبة، ويوفر القرار خلية واحدة والمراقبة طويلة الأوقات التي تمتد مئات من الأجيال؛ بخلاف [اغروس] المستندة إلى منصة الفحص المجهري، أنها ظروف النمو موحد يمكن التحكم بشكل محكم. لأن يعزل التدفق المستمر لمتوسط نمو الخلايا في جهاز موائع جزيئية من اختلافات لا يمكن التنبؤ بها في البيئة الكيميائية المحلية الناجمة عن نمو الخلايا والايض، وتغييرات حقيقية في التعبير الجيني ونمو الخلايا في الاستجابة إلى ويمكن ملاحظة منبهات محددة أكثر ثقة. نجحت عصيات يستخدم هنا كأنواع بكتيرية نموذجية لإثبات "آلة أم"-اكتب أسلوب للتحليل الخلوي. علينا إظهار كيفية بناء ورأسيا جهاز موائع جزيئية وتحميله مع الخلايا وبدء التصوير المجهري وتعريض الخلايا لحافز عن طريق التحول من متوسط النمو واحد إلى آخر. مراسل تستجيب لإجهاد كمثال للكشف عن نوع البيانات التي يمكن الحصول عليها بهذه الطريقة. أيضا بإيجاز نناقش كذلك تطبيقات هذا الأسلوب لأنواع أخرى من التجارب، مثل تحليل تبوغ الجرثومي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من أبرز سمات الحياة على الأرض هو مرونة كبيرة ومتنوعة. هدفا مركزياً للبيولوجيا الجزيئية هو فهم المنطق الذي استخدم الخلايا الجينات والبروتينات لتحقيق أقصى قدر من النمو واللياقة البدنية تحت مجموعة متنوعة من الظروف البيئية. العلماء لتحقيق هذا الهدف، يجب أن تكون قادرة على مراقبة ثقة كيف تنمو خلايا فردية، تقسيم، والتعبير عن الجينات تحت مجموعة معينة من الظروف، مشيراً إلى كيفية استجابة الخلايا للتغييرات اللاحقة في البيئة الخاصة بهم. ومع ذلك، الأساليب التحليلية التقليدية في علم الأحياء المجهرية قد القيود التقنية التي تؤثر على أنواع الأسئلة التي يمكن معالجتها. على سبيل المثال، معظم التحليلات المستندة إلى الثقافة كانت مفيدة للغاية على مر السنوات، إلا أنها توفر بيانات مستوى السكان الذي يمكن أن تخفي الاختلافات خلية إلى خلية ذات مغزى أو في سلوك السكان الفرعية أصغر من الخلايا في مجموع السكان فقط. تحليلات خلية واحدة من البكتيريا الحية استناداً إلى الفحص المجهري الخفيفة تكشف عن سلوك خلية واحدة ولكن هي أيضا محدودة من الناحية الفنية. البكتيريا هي عادة معطلة على منصات [اغروس] يتضمن المتوسطة النمو، لكن الخليوي حشود شعبة ونمو رأي مجهرية ويستنزف المغذيات المتاحة بعد دورة الخلية عدد قليل، إلى حد كبير الحد من وقت الملاحظة1، 2. وعلاوة على ذلك، المحلية استنفاد المغذيات وتراكم ما يصاحب ذلك من تركات الأيضي نتيجة لنمو الخلايا تتغير باستمرار البيئة نمو الخلايا المحلية بطرق يصعب قياس أو التنبؤ بها. هذه التغييرات البيئية باستخدام منصات [اغروس] تشكل تحديا للدراسات من السلوكيات حالة ثابتة أو الاستجابات الخلوية لتغييرات معينة في ظروف النمو3.

التكنولوجيا موائع جزيئية، التي يتم تدفق وسيلة سائل بشكل مستمر من خلال أجهزة ميكروفابريكاتيد، ويقدم حلاً لقيود التجريبي الكلاسيكي. جهاز موائع جزيئية يمكن أن تبقى خلايا فردية في موقف للفحص المجهري خلية يعيش بينما تدفق متوسط النمو باستمرار توفر الخلايا مع المواد الغذائية الطازجة ويجرف تركات الأيضي والخلايا الزائدة، مما خلق نمو عالية موحدة البيئة. ظروف النمو المستمر، ويمكن ملاحظة السلوكيات الخلية بمعزل عن التأثير العوامل البيئية، والسماح بطريقة عرض دون عائق من المنطق الداخلي للخلايا. كما يمنع تدفق السائل أصبحت مزدحمة بخلايا الجهاز موائع جزيئية، المراقبة الأنساب خلية واحدة لعشرات أو مئات من الأجيال يصبح ممكناً4،5. مثل هذه الأوقات المراقبة طويلة تسمح بالكشف عن السلوكيات خلية طويل الأجل أو نادرة وإلا لا يمكن الكشف عنها. أخيرا، سيتم تكوين المتوسطة التي يمكن تغيير التدفقات من خلال الجهاز في السماح للخلايا التي سيحتفل بها كما أنها تستجيب لبداية الإجهاد أو مقدمة أو إزالة مجمع خاص.

وقد يتمتع ميكروفلويديكس بالفعل عدد من التطبيقات الهامة. على سبيل المثال، قد استخدمت في الأنسجة أو الجهاز، أو أجهزة الجسم على رقاقة، التي أنواع متعددة من الخلايا البشرية شارك مثقف لمحاكاة في فيفو شرط6؛ لدراسة حركة السلكية في بيئات ميكروستروكتوريد7؛ لدراسة التفاعلات بين الأغشية الحيوية البكتيرية (مثلاً، 8)؛ و للتغليف والتلاعب بكميات صغيرة من المواد الكيميائية (مثل، 9) أو الخلايا. أجهزة موائع جزيئية أصبحت شعبية متزايدة في مجال علم الأحياء الدقيقة (لملاحظات ممتازة، انظر 10 و 11)، لا سيما وأن سلامتهم البدنية وخصائص تدفق جيدا المتطابقة إلى منافذ الميكروبية الطبيعية12. على سبيل المثال، ميكروفلويديكس قد تم مؤخرا يستخدمها الأطباء لمثل هذه الأغراض كقياس دقة الخلية النمو وشعبة13،،من1415، تحليل حركة الممرض16، رصد الاستشعار عن النصاب القانوني17 و18من التحولات الفيزيولوجية، والعد للبروتين،19من بين العديد من الأمثلة الأخرى. الطريقة المعروضة هنا مصممة خصيصا لتحليل الأنساب الخلية البكتيرية الواحدة بدلاً من مجموعات من السلالات أو الأنواع. يستخدم الجهاز موائع جزيئية أثبت هنا تباين واحد "آلة الأم" تصميم4، التي تزرع الخلايا أحادية الملف داخل خندق موائع جزيئية مع نهاية مغلقة واحدة وواحدة من نهاية مفتوحة؛ نمو الخلايا وشعبة يدفع الخلايا ذرية من النهاية المفتوحة ويصل إلى تدفق السائل. تحليلاتنا عادة التركيز فقط على الخلية "الأم" التي تقتصر في نهاية مغلقة الخندق. أننا نعتبر هذا الأسلوب النهوض على السابقة الخفيفة على أساس الفحص المجهري خلية واحدة التقنيات التحليلية، مثل تجميد خلية على منصات [اغروس]. بينما نجحت (ب) يستخدم كنموذج هنا، الأسلوب الذي ينطبق أيضا على سائر الأنواع البكتيرية (الإشريكيّة القولونية نموذج مشترك آخر؛ وقد تتطلب بعض الأنواع ذات أحجام مختلفة من الخلية أو مورفولوجيس تصنيع الأجهزة الجديدة مع أبعاد مختلفة). يتطلب استخدام الصحفيين الفلورسنت لتمييز الخلايا وتصور التغييرات في التعبير الجيني استخدام الأنواع وراثيا أصعب؛ تحليلات لنمو الخلايا ومورفولوجيا غير ممكنة حتى بدون علامات مضيئة.

ويستبعد هذا البروتوكول عملية اختﻻق سيد السليكون التصويرية، التي كانت توصف على نطاق واسع في أماكن أخرى باستخدام5؛ يمكن أيضا أن تكون درجة الماجستير بسهولة الاستعانة بمصادر خارجية من مرافق ميكروفابريكيشن. ويشمل صب جهاز PDMS من سليكون المقوى ماجستير؛ ارتباط الجهاز بقطعة من الزجاج غطاء؛ تجميع موائع جزيئية مدخل ومخرج السباكة والصمامات قرصه بما في ذلك السماح بتبديل المتوسطة؛ تخميل الجهاز وإعداد الخلايا البكتيرية، وتحميل الجهاز مع الخلايا البكتيرية؛ إرفاق السباكة للجهاز واكويليبراتينج الخلايا؛ وتحميل الجهاز على مجهر الأسفار للتصوير. نظراً لأن العديد من الصور المختلفة اكتساب ومعالجة البرمجيات أدوات يمكن استخدامها لوضع تصور وتحليل البيانات المختلفة لمصلحة4،5، يتم عرض الصور مثلاً، ولكن لا يتم تضمين أساليب التقاط الصور في هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-PDMS جهاز الصب

  1. في بيئة خالية من الغبار، مزيج البوليمر PDMS وعامل التجفيف بنسبة 10:1 وديغا تحت الفراغ لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  2. ضع سيد سليكون (أو نسخة متماثلة الإيبوكسي أو البولي يوريثان منه) على قطعة من رقائق الألومنيوم دون انقطاع في طبق بتري البوليستيرين. صب خليط PDMS ديجاسيد على سيد بعمق من حوالي 5 مم. ديغا لوحة بيتري لمالا يقل عن 10 دقيقة استخدام دفق الهواء لكسر الفقاعات السطحية لطيف.
    ملاحظة: أبعاد الجهاز مستويين تستخدم ترد في المرفق به ملف CAD5 (انظر 1 ملف تكميلي). سيد النسخة متماثلة بلاستيك قد تعدت جزئيا خلال ولﻵﻻت؛ في حالة حدوث ذلك، دفع أسفل النسخة المتماثلة مع قضيب بلاستيك نظيفة.
  3. علاج PDMS على الأقل 1 ح في فرن عند 60 درجة مئوية وباردة بدرجة حرارة الغرفة. إزالة رقائق الألومنيوم التي تحتوي على PDMS الرئيسي وشفي من لوحة بيتري. تقشر بعناية رقائق الألومنيوم من الجزء الخلفي من الشريحة الرئيسية، ثم بعناية قشر PDMS من الشريحة الرئيسية.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، PDMS قد يمكن علاجه بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. الهشاشة النسبية للماجستير رقاقة السيليكون قد يمكن التغلب عليها باستخدام لاصق الإيبوكسي للسندات بشكل دائم يفر إلى 1/16 بوصة-القرص الألومنيوم سميكة من نفس الحجم ويفر.
  4. كما رقاقة تتضمن عادة عدة أجهزة موائع جزيئية مع أبعاد مختلفة بعض الشيء (انظر 1 ملف التكميلية)، قطع جهاز واحد حجم استخدام مشرط نظيفة وحادة.
    ملاحظة: لروتين العمل نجحت باء ، استخدام الأجهزة مع الخنادق 1.0 ميكرومتر-على مستوى الخلية، التي تم وضع علامة مع C أو F في ملف CAD المصاحبة.

2-الجهاز اللكم والترابط

  1. الشريط مكان قطعة من مكتب شفافة (انظر الجدول للمواد) على جانب الجهاز لتسليط الضوء على ميزات منقوشة منقوشة. يتم تحديد مداخل ومخارج المنافذ كمناطق دائرية على طرفي نقيض من القنوات فلويديك مرئية (الشكل 1). لتحسين ظهورها عند اللكم الثقوب في الجهاز لدبابيس مدخل ومخرج، علامة على مداخل ومنافذ مع النقاط باستخدام علامة غرامة ذات الرؤوس.
    ملاحظة: لضمان أن دبابيس مدخل ومخرج ليست مزدحمة، كل قناة أخرى هي لكمات، بدءاً بالقناة تحت الرمز الدلالي الأبجدي للجهاز فقط.
  2. قلب الجهاز PDMS حيث أن الجانب منقوشة باستمرار، ولكمه من خلال الجهاز للنقاط ملحوظة استخدام لكمه خزعة 0.75 مم؛ تجاهل اللكم.
    ملاحظة: يتم لكمات الأجهزة مع الجانب منقوشة إلى أسفل لأن الحفرة التي تم إنشاؤها بواسطة لكمه خزعة يتم عادة حرقه قليلاً حيث يدخل لكمه البوليمر. اللكم الجهاز في اتجاه معكوس يضمن أن حفرة على الجانب منقوشة لها حدود حادة.
  3. استخدام ستيريوميكروسكوبي، ضمان أن الثقوب لكمات تتداخل مع مجالات مدخل ومخرج للجهاز. استخدام الملقط غرامة ذات الرؤوس لإزالة أي أجزاء غريبة من PDMS من الثقوب لكمه.
  4. استخدم شريط لاصق لإزالة الغبار من كلا الجانبين بالجهاز ومكان في طبق بتري البوليستيرين نظيفة. إعداد زجاج غطاء 22 ملم × 40 ملم بالتبول مع 100 ٪ كحول الأيزوبروبيل وفرك مع مسح تنظيم؛ الجافة مع تيار الهواء خالية من الغبار أو النيتروجين.
  5. ضع الجانب ميزة الجهاز PDMS لكمات حتى جنبا إلى جنب مع الزجاج غطاء تنظيفها في بلازما أكسجين أنظف.
    1. بلازما-علاج الجهاز بالإعدادات التالية: الفراغ، متور 70؛ O ضغط2 ، متور 200؛ مدة 15 ثانية؛ الطاقة، 30 جورج فورا بعد انتهاء فترة العلاج البلازما، إزالة الجهاز والزجاج غطاء من البلازما أنظف.
    2. عكس PDMS ووضعه في وسط الزجاج غطاء حيث أن اتصالات الجانب منقوشة على الزجاج؛ تأكد من محاذاة قنوات التغذية (تشغيل بين مجالات مدخل ومخرج) مع المحور طويلة من الزجاج غطاء. اضغط لأسفل بلطف جداً التأكد من أن الأختام PDMS ضد الزجاج.
  6. خبز الجهاز المجتمعون في فرن على الأقل 1 ح عند 60 درجة مئوية. بعد الخبز، التحقق يدوياً من أن PDMS هو الرهينة للزجاج بواسطة تضغط بلطف على زاوية واحدة من الجهاز.
    ملاحظة: حالما المستعبدين من الجهاز، أنه ينبغي استخدام خلال 24 ساعة، كما ستصبح البوليمر مسعور يتزايد مع تزايد الوقت بعد المعالجة بالبلازما.

3-إعداد السباكة موائع جزيئية

  1. قطع أطوال من البوليمر الأنابيب (القطر الداخلي (ID) 0.02 بوصة، القطر الخارجي (OD) 0.06 بوصة) لأطوال مناسبة للوصول إلى من مضخة الحقن إلى جهاز التبديل (إذا استخدمت) والجهاز عندما شنت على المجهر. قطع العديد من أطوال كما توجد ممرات موائع جزيئية.
  2. تجميع الوصلات Y للصمامات قرصه (في حالة استخدام) بقطع وربط أطوال 2-سم سيليكون مرنة أنابيب (معرف 0.03 بوصة بوصة 0.065 OD) إلى انتقادات لاذعة العلوي "y" وأطوال 1 سم من أنابيب سيليكون بشوكة أسفل "y".
  3. قطع أطوال 10 سم (أو مناسباً) من أنابيب البوليمر؛ قم بتوصيلها في نهاية واحدة لتقاطع التبديل عن طريق إدراج لهم في قطاعات أنابيب سيليكون 1 سم على شوكة أسفل "y". قم بتوصيلها في النهاية الأخرى للابر ز 21 التي تم إزالتها من محولات المحاقن البلاستيكية وبنت حوالي 90 ° حوالي 9 مم من نهاية الإبرة.
  4. قم بتوصيل الإبر فجة ز 21 نهاية أحد أجزاء الأنابيب التي سيتم تشغيلها من المحاقن إلى جهاز تبديل بإدخال الإبر في الأنبوب. إدراج الغايات الأخرى لكل طول الأنابيب في قطاعات أنابيب سيليكون على انتقادات لاذعة مدخل من الوصلات Y.
    ملاحظة: استخدم نوعا من جهاز لعقد الصمامات قرصه وتقاطعات في المكان؛ ويمكن إجراء ذلك بسهولة من مربع تلميح ميكروبيبيتي (الشكل 2D).
  5. قطع أطوال أنابيب البوليمر حمل النفايات من منفذ الجهاز إلى كوب نفايات. قم بتوصيلها في نهاية واحدة لبنت إبر ز 21 إعداد كما هو موضح أعلاه. الشريط على الطرف الآخر من الأنابيب داخل دورق نفايات.
  6. إعداد وحدات التخزين المناسبة للوسائط التي تحتوي على 0.1 مغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA) وشغل بالحجم المطلوب وعدد الحقن. الاتصال المحاقن محملة بجيش صرب البوسنة بالإبر ز 21 استعداد تعلق للمحاقن الأنابيب وتحميل مدخل إلى مضخات الحقن.
    ملاحظة: لنموذجي التجارب تستخدم 5 قنوات للجهاز، كل مع حقنه 20 مل. تجربة التي حولت المتوسطة سيتطلب المصارف 2 من كل 5 المحاقن. هنا، المضخة التي تحتوي على أول بنك يشار مضخة المرحلة 1، ومضخة تحتوي على المصرف الثاني، مع المتوسط بعد رمز التبديل، يشار إلى ضخ المرحلة 2.
  7. إزالة الهواء من مدخل السباكة عن طريق تشغيل المضخات حقنه بمعدل تدفق عالية (> 500 ميليلتر/دقيقة)، بدءاً بتوجيه مضخات الحقن عمودياً والتنصت على الحقن إحضار فقاعات الهواء إلى الأعلى. مرة واحدة وقد تم إزالة الهواء من الحقن، ضع المضخة حقنه أفقياً وتدريجيا اضغط أو نفض الغبار خطوط البوليمر من المحاقن تصل عن طريق جهاز التبديل إزاحة وإزالة فقاعات الهواء. كرر هذه العملية للمصرف الثاني من المحاقن (في حالة تبديل وسائط الإعلام).
  8. بعد أن تم إزالة فقاعات الهواء، تعيين مضخة الحقن المرحلة 2 (أي، مع المتوسط التي سيتم استخدامها الثانية، بعد رمز التبديل) إلى 1.5 ميليلتر/دقيقة، ثم توقف التدفق. ضع مقاطع صغيرة الموثق على شرائح أنابيب مرنة في فرع الوصلات Y المناظرة للمرحلة المتوسطة الثانية. الاستمرار في تشغيل المضخة المرحلة-1 حقنه بمعدل تدفق متواضعة (مثلاً، 10 ميليلتر/دقيقة) عن 30 دقيقة على الأقل لتطهير المتوسطة الثانية من أنابيب مدخل المصب من تقاطع Y.

4-خلية ثقافة إعداد

  1. ينمو بريكولتوري من سلالة الفائدة في الأجل المتوسط المطلوب بين عشية وضحاها، إلى مرحلة ثابتة. يجب أن يحتوي على السلالة البكتيرية طفرة يجعل الخلايا غير متحركة، حيث أن الخلايا لا تسبح خارج قنوات الجهاز.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، السلالة البكتيرية هي نجحت 3610 المحتوية على الحاجA233V استبدال (أسباب هذه الطفرة السوط لتكون مباشرة بدلاً من حركية الخلية حلزونية، ومنع)، فرسبف-منيونجرين مراسل للإجهاد في الخلية، وتأسيسي فهايبرسبانك-منيبتوني (أحمر) مراسل تمييز الخلايا. ويستخدم رطل لينوكس المتوسطة في البروتوكول المثال. سلالات نموذجية للتجارب ميكروفلويديكس تحتوي على الصحفيين النسخي فلوري واحد أو أكثر وبروتين فلوري المنتجة مؤثرا، هيولى لتسهيل الكشف الآلي للخلايا. عيوب النمو لم تراع عندما تستخدم لينوكس رطل المتوسطة الغنية، ولكن قد تحول دون النمو ب-نجحت في الحد الأدنى من وسائل الإعلام في ظروف موائع جزيئية لأن يفرز siderophores جرفت بالتدفق في المتوسط. وفي ظل هذه الظروف، قد تكون استعادة النمو بإضافة سترات الصوديوم وكلوريد الحديد إلى المتوسط، كما ذكرت S750 متوسطة11.
  2. صباح اليوم للتجربة، تمييع الخلايا نجحت 01:50 في قارورة 250 مل حيرة التي تحتوي على 25 مل متوسط النمو. تنمو الخلايا ح 5-6 في تهز الثقافة في 37 درجة مئوية كثافة بصرية من أكبر من 1.
    ملاحظة: ثقافة خلية كثيفة الأفضل لأن الخلايا الثابتة-المرحلة باء-نجحت هي أصغر حجماً وأقل الخلايا غالباً ما توجد في سلاسل، وتيسير تحميل الجهاز. الأنواع البكتيرية المختلفة قد تتطلب الشروط المتوسطة أو النمو الأخرى للتحميل الأمثل.
  3. استخدام المحاقن مزودة بمرشح حجم مسام 5-ميكرومتر، تصفية حوالي 15 مل ثقافة الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل لإزالة سلاسل خلية نجحت (أنه من غير الضروري كولاي وقد لا يكون ضروريا مع الأنواع الأخرى).
    ملاحظة: يجب إزالة الخلايا قليلة نسبيا؛ ينبغي أن يكون فيلتراتي عكر.
  4. الطرد المركزي ثقافة المصفاة لمدة 10 دقيقة في 4,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. من أجل إيقاف المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في السائل طاف المتبقية المتبقية في الأنبوب، مضيفاً ما يقارب 500 ميليلتر من متوسطة جديدة إذا لزم الأمر لتسهيل بيبيتينج تعليق خلية.

5-جهاز التحميل

  1. بلطف ضع فارغة ميكروبيبيتي هلام-تحميل رقيقة ونصائح (انظر الجدول للمواد) في الثقوب منفذ الجهاز موائع جزيئية.
  2. استخدام رقيقة هلام-تحميل نصائح مع ميكروبيبيتي P200، تخميل الجهاز عن طريق حقن المتوسطة التي تحتوي على 1 ملغ/مل جيش صرب البوسنة في الثقوب مدخل، التقيد بالنصائح في الثقوب منفذاً لرصد ملء القنوات موائع جزيئية (الشكل 2A). احتضان الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق تقريبا.
    ملاحظة: يستخدم جيش صرب البوسنة عادة كحجب أو التخميل عامل التي سوف تربط إلى السطح مسعور من البوليمر PDMS، زيادة في هيدروفيليسيتي والحد من الربط من البروتينات الأخرى أو خلايا (عن طريق خلية الجزيئات السطحية).
  3. استخدام رقيقة هلام-تحميل نصائح، تحميل كل قناة مع الخلايا ريسوسبينديد (من القسم 4)، استخدام التلميحات في القناة منفذاً لرصد التقدم المحرز في الخلايا عن طريق الجهاز (الشكل 2).
    ملاحظة: تحميل تيسر إعداد ميكروبيبيتي P200 إلى حجمه الأقصى 200-ميليلتر وثم يسفط وسادة هواء قبل يسفط كمية صغيرة (حوالي نصف حجم المقطع رقيقة من طرف ماصة) من الخلايا. لا يلزم حجم الخلايا حراكه دقيقة، حسب حجم الجهاز PDMS صغيرة بالنسبة إلى ميكروبيبيتي. نحن نعرف من لا الحد الأعلى لكثافة الخلايا ريسوسبينديد، ما دام يمكن بيبيتيد تعليق خلية في الجهاز. كتل الخلايا يمكن أن تسد الجهاز وينبغي تجنب بيبيتينج شامل و/أو خلط دوامة.
  4. إزالة بلطف نصائح تحميل لجل من ثقوب المآخذ، عمل واحدة في كل مرة لمنع الأضرار بالجهاز.
  5. الطرد المركزي الجهاز في ميكروسينتريفوجي أعلى هيئة في محول دوار مناسبة على 6,000 تقريبا x ز لمدة 10 دقائق (الشكل 2).
    ملاحظة: تم استخدام محول دوار ألومنيوم آلة مخصصة تم تصميمها لتناسب في دوار ميكروسينتريفوجي (الشكل 2)؛ ويمكن استخدام نماذج مختلفة للطرد المركزي مع محولات الدوار المناسبة. ميزة هامة من المحول أنه يوفر القوة الجانبية في اتجاه نهايات مغلقة الخنادق الخلية، مما اضطر الخلايا في القنوات الجانبية.
  6. تحقق من تحميل ناجحة تحت المجهر (الشكل 3) ولكن دون تحديد الجهاز إلى الشريحة حامل/المرحلة إدراج.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، 60 س، يستخدم الهدف النفط-الغمر Ph3 نا 1.4 للتحقق في هذه المرحلة وتصوير اللاحقة.

6-جهاز الجمعية، والموازنة، وتصاعد

  1. جبل الجهاز المحمل على إدراج مرحلة بعناية قبل تسجيل زجاج الغطاء على جانبي PDMS إلى الجزء السفلي من إدراج مرحلة (أيعكس إدراج مرحلة قبل إرفاق الجهاز). عكس الجمعية إدراج جهاز المرحلة ذلك PDMS هو مواجهة ومكان على سطح لينة، مثل مسح خالية من الغبار (الشكل 2D).
  2. ضبط معدل تدفق المضخة حقنه المرحلة 1 إلى 35 ميليلتر/دقيقة تعمل مع حارة واحدة في وقت واحد، إدراج مدخل الإبرة ثم الإبرة منفذاً (أيتشغيل للكأس النفايات؛ الشكل 2E).
  3. مسح بعيداً من أي وسيط الزائدة مع مسح نظيفة خالية من الغبار وبصريا فحص الجهاز بحثاً عن الثقوب. فحص الأنابيب منفذ لمظهر الخلايا الزائدة (عادة ما تظهر كمجموعة شريطية عكر) وغضروف المتوسطة، التي سوف تتحرك ببطء نحو الكأس النفايات.
  4. السماح للجهاز بتشغيل في الدقيقة 35 ميليلتر لحوالي 15-30 دقيقة، حتى أن جميع الممرات المتصلة هي تصب في الكأس النفايات.
  5. تعيين مضخة الحقن المرحلة 1 إلى 1.5 ميليلتر/دقيقة وتوقف التدفق. إحضار جهاز المضخة وجهاز كامل بالمجهر (هو مساعدة هذه العملية بوضعه على عربة متداول)، وإعادة تشغيل المرحلة-1 جبل تدفق المتوسط في 1.5 ميليلتر/دقيقة بعناية إدراج مرحلة مع الجهاز إلى مجهر مقلوب الأسفار، باستخدام الشريط عند الضرورة لتوجيه مدخل ومخرج الأنابيب.
  6. تحديد المواقف المطلوبة على الجهاز للتصوير والبدء في التصوير كما هو مطلوب. ملاحظة أن الخلايا عادة ما تتطلب بضع ساعات (ما يقارب 10 الأجيال) للوصول إلى حالة مستقرة الأسى مرحلة النمو، وقد يتأخر بدء الحصول على الصور كالمطلوب حيث أن التصوير يبدأ بعد فترة الموازنة.
    ملاحظة: نمو الخلايا في المرحلة الأسية حالة ثابتة ينبغي التحقق من خلال تحليل الصور اللاحقة بتعقب مرات انقسام الخلية وضمان أنهم توصلوا إلى قيمة الحد أدنى ثابتة.

7-التبديل بين متوسطة

  1. بين جولات متعاقبة من التصوير، توقف تدفق مضخة الحقن المرحلة 1. Unclip بعناية مقاطع الموثق من السيليكون المرحلة 2 الأنابيب، ونقل بعضها إلى أنابيب سيليكون في فرع المرحلة 1 من تقاطع Y. الأمم المتحدة--توقف تدفق المرحلة الثانية المحاقن مضخة (الذي تم تعيينه إلى 1.5 ميليلتر/دقيقة في الخطوة 3، 8) ومواصلة التصوير.
    ملاحظة: عند 1.5 ميكرومتر/دقيقة بطول 10 سم من أنابيب البوليمر المصب من الوصلات Y، يصل المتوسط المرحلة الثانية إلى الجهاز في حوالي 50 دقيقة. يمكن اختبار الوقت للجهاز تجريبيا باستخدام الوسائط التي تحتوي على جزيئات الراسم الفلورسنت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر الخلية الأولى الناجحة تحميل، حسب تقييم التباين مرحلة الفحص المجهري قبل إرفاق السباكة موائع جزيئية للجهاز، ككل أو ما يقرب من جميع القنوات الجانبية موائع جزيئية تحتوي على واحد أو أكثر من الخلايا البكتيرية ( الشكل 3A). تحميل الأمثل سوف تظهر عدة خلايا في كل قناة، ولكن مع ذلك سوف تملأ القنوات مع الخلايا بسبب نمو الخلية خلال فترة الموازنة (الشكل 3B). الممرات مع الفقراء تحميل، فيها نسبيا قليلة (< 50 ٪) الجانب قنوات يتم تحميلها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول ميكروفلويديكس يتسم بالمرونة في ذلك العديد من الخطوات التي يمكن تعديلها لتحسين استخدامها مع نوع معين أو سلالة أو لغرض محدد. وفي الواقع، في هذا البروتوكول قمنا بتعديلات على مفهوم "آلة الأم" الأصلي4 لتحسين استخدامها مع باء-نجحت. وغالباً ما تشكل الخنادق التي تقتصر الخلايا ميزة طبقة واحدة، بينما في هذا البروتوكول نستخدم الخنادق خلية طبقتين، مع قناة ضحلة المحيطة بالخلايا. عرض تصميم طبقتين كوسيلة لتحقيق أقصى قدر من تدفق المواد المغذية إلى ونواتج الأيض من الخلايا باء-نجحت ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا المشروع من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت GM018568. تم تنفيذ هذا البروتوكول في جزء في المركز لأنظمة النانو (CNS)، عضوا للوطنية تكنولوجيا النانو منسقة البنية التحتية الشبكة (ننسى)، الذي تدعمه "المؤسسة الوطنية للعلوم" NSF جائزة 1541959 رقم. الجهاز العصبي المركزي جزء من جامعة هارفارد. شكرا جزيلا تعود نورمان توماس والرب ناثان لعملهم في تصور واختلاق القالب الرئيسي المستخدم للأجهزة الموضحة هنا، وفي بناء على النسخة الأصلية للجهاز. كما نشكر يوهان بولسون لنصيحته التعاونية القيمة وأشكر أعضاء مختبرة للمشورة والتحسينات المستمرة للمستحضرات البكتيرية موائع جزيئية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Sylgard 184 سيليكون المطاط الصناعي كيتداو كورنينج(240)4019862يشار إلى هذا باسم PDMS في البروتوكول. هناك مكونان يتم خلطهما بنسبة 10: 1
0.75 مم لكمة خزعةPrecision Instruments504529
22 × 40 مم رقم 1.5 غطاء زجاجيVWR48393 172
Plasma Etch PE-50Plasma Etch Inc.أداة PE-50تستخدم لربط PDMS بالزجاج باستخدام معالجة بلازما الأكسجين
الأنابيب المرنة Tygon 0.02 "، OD 0.06"Saint-Gobain PPL Corp.AAD04103بالنسبة للجزء الرئيسي من الأنبوب ، على سبيل المثال ، متصلة بالإبر
أنابيب السيليكون ، 0.04 "معرف ، 0.085" ODHelixMark أنابيب سيليكونقياسية 60-795-05لصمامات القرص واتصال Y-junction
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA7906-100Gيستخدم كعامل تخميل
ART Gel Pipet Tips (P200)المنتجات الحيوية الجزيئية2155لتحميل الجهاز بمرشح
حقنة Acrodisc 32 مم متوسط وخلايا مع 5-& م غشاء سوبورPall Life Sciences4560لتصفية الثقافات قبل تحميل الجهاز
الإبر الحادة 21 ga ، موصل 1 "McMaster-Carr75165A681
Y مع 200 سلسلة انتقادات لاذعة ، 1/16 "أنابيب معرف ، بولي بروبيليننوردسون الطبيةY210-6005الشركة هي AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E مجهرمقلوب نيكونتم إيقاف هذه الوحدة من قبل الشركة المصنعة وتم استبدالها ب Ti 2 E.
LB LennoxSigma-AldrichL3022
Microfuge 18Beckman Coulter367160<
em>Bacillus subtilis< em> سلالة NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1سلالة أبوية من النوع البري معدلة للاستخدام في التجارب الموضحة في هذا البروتوكول
الحمل الحراري بالجاذبيةVWR414005-106لمعالجة PDMS والخبز المجمعة يمكن استخدام الأجهزة
Scotch-Weld Epoxy Kit3M2216 B / Aلربط رقاقة السيليكون بلوحة دعم من الألومنيوم
شريط سكوتش ماجيك ، عرض 3/4 بوصة3Mلتنظيف الغبار من أجهزة PDMS ووضعها فوق الميزات لزيادة الرؤية (يشار إليها ب "شريط المكتب" أو "الشريط اللاصق" في البروتوكول)
مجهر مجسمنيكونSMZ800Nمدرج هنا كمثال ؛ تقريبا أي مجهر مجسم سوف تفعل
كحول الأيزوبروبيلسيجما ألدريتشW292907لتنظيف مضخة الحقن الزجاجية
، 6 قنواتNew Era Pump Systems Inc.NE-1600
KimwipesKimberly-Clark34120ماركة للمناديل المبللة الخالية من الغبار
World معرف فرن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  2. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
  3. Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
  4. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
  5. Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
  6. Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).
  7. Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
  8. Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
  9. Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
  10. Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
  11. Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
  12. Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
  13. Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11(2017).
  14. Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
  15. Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
  16. Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
  17. Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1 (4), (2010).
  18. Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
  19. Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641(2016).
  20. Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
  21. Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
  22. Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
  23. Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة