نقدم هنا بروتوكولا لزيادة إنتاج الوهم دون الاستخدام المعدات الجديدة. يمكن تغيير اتجاه بسيط للجنين لحقن زيادة عدد الأجنة المنتجة، ويساعد على تقليل الفترة الزمنية لنقل الخط.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في محاولة لزيادة الكفاءة في خلق الفئران المعدلة وراثيا عن طريق منهجيات خلية دإط، نقدم لتكيف لبروتوكول الحقن الكيسة الحالي. هنا يمكننا تقرير أن دوران بسيطة للجنين، وحقن من خلال كتلة الخلايا الداخلية عبر (تكم) زيادة النسبة المئوية للفئران تشيميريك من 31 في المائة إلى 50 في المائة، مع أي معدات إضافية أو مزيدا من التدريب المتخصص. 26 مختلفة فطري الحيوانات المستنسخة، وتم حقن الحيوانات المستنسخة إجمالي 35 خلال فترة 9 أشهر. كان هناك لا اختلاف كبير في معدل الحمل أو معدل الاسترداد الأجنة بين تقنيات الحقن التقليدية وتكم. ولذلك، دون أي تغيير رئيسي في عملية الحقن والمواقع بسيطة الكيسة والحقن من خلال ICM، الإفراج عن خلايا ES في تجويف blastocoel يمكن أن يحتمل أن تحسين كمية الإنتاج تشيميريك واللاحقة نقل الخط.
المقدمة
لما يقرب من 25 عاماً، تم إنشاء الفئران وراثيا المستهدف عملية بطيئة، كثيرا ما تعرقل باختناق في مرحلة microinjection blastocysts دإط الخلايا لتوليد germline تحيل التركيبات. التطورات الأخيرة، بما في ذلك كريسبر/Cas91،2 استهداف دإط الخلايا ووفاق الفائق الخلية اتحادات جيل مثل كومب، تحسنت الجيل/توافر دإط الخلايا المحورة وراثيا. ومع ذلك، يظل توليد التركيبات germline عنق زجاجة في خلق الفئران المعدلة وراثيا من هذه الخلايا ES3،4. مشاريع توليد خلايا ES الفائق ابتليت بتقلب عالية في وفاق خلية الجودة، هو أمر حاسم لنجاح إنشاء التركيبات germline. بالإضافة إلى ذلك، بعض خطوط الخلية ES المستخدمة عادة معروفة انيوبلويدي العالية، وصعوبة إنتاج germline التركيبات المختصة5.
تم تطوير العديد من الأساليب لخلق الفئران مع أما حلما أعلى، أو تماما المستمدة خلية ES الفئران6،،من78،،من910. بينما كل من هذه الأنظمة له مزاياه الخاصة، كما أن لها عيوبها. توليد التركيبات تيترابلويد، في حين توليد 100% وفاق الخلية المستمدة من الفئران، غير فعالة، وتقتصر عموما على خطوط أووتبريد 5،6. أحدث أساليب الحقن morula يمكن أن تسفر عن ارتفاع نسبة التركيبات، تقترب من 100%، لكن عموما تتطلب معدات إضافية هامة (أشعة الليزر أو بيزوس) وتدريب10،11. في المختبرات حيث هذه التقنيات موجودة بالفعل، قد لا تكون هذه المنهجية الجديدة الضرورية.
وكان الهدف من هذه الدراسة لإيجاد أسلوب يستخدم التقنيات الشائعة والمعدات متاحة بسهولة لزيادة معدل توليد الوهم، وزيادة فرصة انتقال germline اليل متحولة لإنشاء مستعمرة الماوس اللاحقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع العمليات كجزء من العمل العادي لمرفق "نيس تدق الماوس خارج الأساسية". وأبقى جميع الفئران في 12:12 دورة ح الضوء: الظلام، وكانت تتغذى على نظام غذائي من المعاهد الوطنية للصحة-31 والمياه متواصلة ad. جميع التجارب التي أجريت وفقا للعناية بالحيوان واستخدام اللجنة للوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية.
1-إعداد الحيوان
- تتكاثر الفئران المانحين، B6 (Cg)-صور < ج-2J > الفئران الإناث/J في 8-10 أسابيع عمر بطبيعة الحال إلى B6 (Cg)-صور < ج-2J >/J الفئران الذكور بين 8 و 26 أسبوعا من العمر. افحص المقابس بصريا في صباح اليوم التالي (E0.5).
- تتكاثر الفئران المستفيدة، "بستر السويسرية" هي بطبيعة الحال ولدت الفئران الإناث بين 6 و 9 أسابيع من العمر للفئران الذكور "وبستر السويسرية" استؤصل الاسهر لديهم. افحص المقابس بصريا في صباح اليوم التالي (E0.5).
2-إعداد الخلية ES
- 129-ديريفيد AB2.2 ES الخلايا، ثقافة الخلايا في دميم وتستكمل مع 15% FBS، 1% الجلوتامين و 1% بنسلفانيا/بكتيريا و 0.1% β-ميركابتوثانول. ثقافة جميع دإط الخلايا الأخرى كل تعليمات ES خلية المورد، باستخدام البروتوكولات الموصى بها.
3-الأجنة جمع
-
تشريح الحيوان
- إعداد عدة أطباق 60 ملم، ما يقرب من 1 كل الفئران 5 زائد 3 إضافية، مع 10 مل انفجار جمع وسائل الإعلام (بليون متر مكعب) (10% FBS في دميم)، وكذلك طبق 4 واحد مع مل 0.5 بليون متر مكعب في بئر. حجته على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- Euthanize B6 (Cg)-صور < ج-2J > الفئران الإناث/J في E3.5 استخدام CO2 الخنق، مع معدل تدفق بنسبة 10%.
- وبعد يوثانيزينج، وضع الفئران في موقف ضعيف والرطب في البطن جيدا مع الإيثانول 70%.
- جعل الشق الأول من خلال الجلد فقط، في منتصف البطن، مما يجعل فتح أوسع نطاق ممكن. بعد فتح من خلال جدار البطن، مرة أخرى مما يجعل شق أوسع نطاق ممكن.
ملاحظة: القيام بذلك في خطوتين يساعد على الحد من أو القضاء على التلوث الفراء. - بدءاً مبيض، ويحمل لوحة الدهون المبيض مع الملقط حادة، بعناية إزالة المبيض، قناة، والرحم، واتخاذ المزيد من الحيطة للحفاظ على الأنسجة الدهنية إلى الحد أدنى. إزالة الرحم كوحدة واحدة، أو كأبواق الفردية، بدون أي تغيير في الإجراء التالي.
- بعد الإزالة، مكان الرحم في طبق 60 ملم تحتوي على انفجار جمع وسائل الإعلام.
-
إزالة الجنين
- إعداد حقنه 10 مل مليئة بليون متر مكعب، وتناسب مع إبرة 25 جرام.
- الرحم واحد في كل مرة، بإزالتها من طبق عقد بليون متر مكعب، لطخة لهم في أنسجة لإزالة الدم الزائد، ووضعه في طبق 60 ملم تحت تكبير منخفضة تشريح مجهر.
- أثناء الضغط بعناية ولطف الرحم أسفل النهاية البعيدة (بالقرب من قناة) مع تشريح الملقط، إدراج الإبرة من الرحم في وسط التوازي طائرة قدر الإمكان. أدخل إبرة أبعد من مجرد النصائح من الملقط.
- تطبيق بعض الضغوط على الملقط عقد الرحم بالإبرة، وطرد حوالي 1 مل من بليون متر مكعب خلال القرن الأفريقي الرحم.
ملاحظة: يجب الحرص في هذه الخطوة، سوف يسبب الكثير من الضغط في المحاقن دفق لا يمكن السيطرة عليها من وسائل الإعلام، وكثيراً ما يترك الطبق. - بعد التنظيف الرحم، والتي تصل إلى 5 كله كل طبق 60 مم، ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة حتى جمع.
-
جمع الجنين
- استخدام ماصة زجاج مرسومة يد، وجهاز ماصة فم، جمع blastocysts تحت نطاق تشريح، تعيين بين 25 X و 35 س. (الشكل 1).
ملاحظة: الفم ماصة جهاز يتألف من 30-40 سم أنابيب مرنة، وإدراج تحت 5 ملم معرف من 1، 000 نصيحة ماصة ميليلتر، تشير أولاً إلى نهاية واحدة، وإلصاق ماصة زجاجية في ذلك. إضافة عامل تصفية حقنه في الطرف الآخر، مع مرفقة 1 cc حقنه لبرميل، لا المكبس، بمثابة قطعة فم. - إزالة الأطباق من الحاضنة، واستخدام نمط شبكة، تفحص كل جزء من الطبق للأجنة. يتم انتقاء الأجنة فردياً، ووضع على قطره من بليون متر مكعب في طبق ثانوي.
- بعد جمع من جميع الأطباق، تغسل الأجنة مرة أخرى في قطره جديدة بليون متر مكعب، ومن ثم ضع الطبق جيدا 4 انتظارا لحقن.
- استخدام ماصة زجاج مرسومة يد، وجهاز ماصة فم، جمع blastocysts تحت نطاق تشريح، تعيين بين 25 X و 35 س. (الشكل 1).
4-الجنين حقن
- التقاط دإط الخلايا على حدة مع إبرة حقن استناداً إلى تأكيد.
- تحضير طبق حقن بإضافة 5-7 مل من حقن وسائل الإعلام (دميم، 10% FBS و 20 ملم حبيس) إلى طبق حقن أسفل زجاج. الحقن تتم في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام الهواء أو زيت ميكروينجيكتور، تنطبق فراغ إبرة حقن رسم خلايا ES. الحرص على الحفاظ على مساحة صغيرة قدر الإمكان بين الخلايا. عد الخلايا ES هنا، أو في خطوة الحقن.
- حدد دإط الخلايا التي هي المتوسطة وصغيرة الحجم بالمقارنة مع السكان عموما من الخلايا، مع سطح أملس، والخالية من العيوب الواضحة مثل فاكوليس.
ملاحظة: الخلية ES السكان تختلف اختلافاً كبيرا في نوعية المورفولوجية، والمعايير المستخدمة وسوف تحتاج إلى ضبط معهم.
- حقن الأجنة بحوالي 15 دإط الخلايا (الشكل 1).
- إرفاق ماصة القابضة نصيحة ميكروينجيكتور جوية ثانية، ووضع جنين قرب افتتاح الحامل. تطبيق فراغ لتأمين الجنين إلى الحامل.
- ضبط للمحور z بتحريك ماصة القابضة لأعلى أو لأسفل حتى أن مجرد لمس الجنين الشريحة، متبوعاً بغرامة يركز زونا. المقبل، ضبط المحور Z من إبرة حقن حيث تكون خلايا ES قرب الحافة في التركيز.
- ضبط الجنين الآن بدفع بلطف من إبرة حقن في الجزء العلوي أو السفلي، الدورية لوضع ICM في الموضع المطلوب.
- أدخل إبرة حقن من خلال زونا، وأما ICM أو تروفوبلست، استخدام ضغط الثابت الخاضعة للرقابة. تطبيق ضغط طفيف على ميكروينجيكتور إبرة الحقن للمساعدة في الحفاظ بلاستوكول من الانهيار.
- الضغط مرة واحدة قد اخترقت الإبرة بلاستوكول، من ميكروينجيكتور لنقل خلايا ES إلى بلاستوكول للجنين. يبدأ وقفه بإيجاز المجسم مشطوف الحواف الإبرة لخروج الجنين إلى السماح الضغط في الجنين إلى العودة إلى وضعها الطبيعي، في حين لا يزال الإبقاء على الخلايا.
ملاحظة: تم حقن خلايا ES المجموعة المرجعية عادة، عقب وفاق تقليدية الخلية حقن البروتوكول9، مع الحرص على عدم لمس ICM. أيضا تم حقن دإط الخلايا عن طريق ICM، دفع الإبرة مباشرة من خلال ICM (تكم) (الشكل 2، فيلم تكميلية).
5-نقل إمبريس
- نقل أجنة للفئران "السويسرية وبستر" في E2.5، باستخدام جهاز نقل جنين غير جراحية، كل الإجراءات للتصنيع. لا يتطلب هذا الإجراء غير الجراحي أي تخدير أو الرعاية بعد العملية الخاصة. بيت الفئران على حدة بعد نقل الأجنة، ومن خلال الولادة والفطام اللاحقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
علاج خط الخلية كأثر عشوائي، استخدم نموذج خطي آثار مختلطة لتحليل البيانات في البرنامج (مثل محركات أقراص SAS (الإصدار 9.2)). تحليل كل الخاضعة لعدد الأجنة المنقولة وخط الخلية. التحليل الثاني يسيطر أيضا على عدد من الجراء التي نجت.
لهذه الدراسة، كل خط الخلية وفاق واستنساخ تم حقن على حد سواء مع التقليدية وتقنيات تيكم، بالتناوب بين هاتين الطريقتين بعد كل الأجنة. بعد الحقن، فصل في الطبق وتجميعها بواسطة نقل، وعموما بين الأجنة 12 و 15 كل ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وكان يعتقد منذ فترة طويلة أن أي اضطراب الرياضيات يمكن أن يؤدي إلى وفيات، في الواقع، بروتوكولات microinjection الكيسة الحالي ما زال التحذير من هذا12،13. ما أثبتنا هنا أن microinjection من خلال مؤسسة أي سي أم لا يضر بالجنين، وزيادة عائد التركيبات.
لا تم التعرف على الآلية الدقيقة لهذا الغرض. ومع ذلك، تعطل الميكانيكية في الرياضيات، و hypoblast المصاحبة لها، ينبغي زيادة حدوث وفاق خلية إدماج ICM المشكل حديثا بعد microinjection. وقد أظهرت عمل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا البحث [جزئيا] "برنامج البحوث الداخلية" للمعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية. خاص بفضل بيدادى شيامال للتحليل الإحصائي. كما نود أن نشكر ياو همفري والطيور غاري اراو يوكي لاستعراض هذه المخطوطات، و "ديمايو فرانكو" لمواصلة تقديم الدعم والمشورة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| إبرة حقن ES Cell | Humagen | MSC-20-0 | |
| جهاز NSET | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (تقنيات الحياة) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (تقنيات الحياة) | 10439-024 | يجب اختبارها بشكل فردي لتوافق ES Cell. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| &# 946 ؛ -mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| مناور دقيق | Leica | مناور | |
| حاقن دقيق | Eppendorf AG | خلية ترام هواء 5176 | |
| مجهر | Leica | DM IRB | |
| 4 طبق جيد | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 ملم طبق | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6 (Cg) -Tyr &# 60 ؛ c-2J & # 62 ؛ / J | Jackson Labs ، بار هاربور ، مين ، الولايات المتحدة الأمريكية | 000058 | |
| الفئران السويسرية ويبستر | تاكونيك ، الولايات المتحدة الأمريكية | Tac: SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
المراجع
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
