اختبار في نموذج ثقافة خلية 3D على أساس كروي للرأس والرقبة الحرشفية خلية العلاج

الرأس والعنق الخلايا الحرشفية (HNSCC) هو سادس أكثر أنواع السرطان شيوعاً في جميع أنحاء العالم مع حدوث ارتفاع المرضية المرتبطة بالإصابة المخاطية فيروس الورم الحليمي البشري (فيروس الورم الحليمي البشري)، إلى جانب غالبية الحالات الناجمة عن إفراط النيكوتين والكحول الاستهلاك ^1،2. بينما عادة علاجها جيدا مع الاستئصال الجراحي، عادة جنبا إلى جنب مع تشريح العقدة الليمفاوية عنق الرحم، أورام أصغر ومراحل ما قبل الغازية علاج هنسكك مرحلة متقدمة والمتكررة لا تزال صعبة بسبب غزو الورم العدوانية مع انتشار المنتشر والمقاومة للإشعاع والعلاج الكيميائي البروتوكولات^3،4،،من^56،،من⁷⁸. تشير الدراسات الأخيرة إلى تقلب عالية من النمط الظاهري الخلوية، وتوصيف الفرعية المتمثلة في تعميم ونشر ورم الخلايا قد بدأت للتو^9،10. اعتقاد سابق من ورم صلبة وموحدة قد الجماهيري المزمع تنقيحها في ضوء الدراسات التي أجريت مؤخرا في الماضي سنوات^11،،من^1213،14. النهج الحالي لتوصيف الورم وتحديد الطفرات الرئيسية يمكن تحديد عدد الجينات التي يبدو أنها مرتبطة بمقاومة العلاج، لكنه يظل نهجاً باهظة التكلفة. وعلاوة على ذلك، لا تسمح معرفة التركيب الوراثي تنبؤ موثوق بها من النمط الظاهري وردها العلاج بالضرورة.

وهناك بعض التقدم في تحسين البقاء على قيد الحياة عموما وخالية من الأمراض للمرض مرحلة متقدمة والمتكررة. للنيكوتين-فضلا عن سرطان المرتبطة بالفيروس، أرفق خيارات العلاج الحالية إلى جانب الجراحة الإشعاعية العدوانية ونظم العلاج الكيميائي على أساس البلاتين. وكانت هناك آثار بالنسبة لمعدلات استجابة مختلفة بين سرطان فيروس الورم الحليمي البشري-السلبية والإيجابية؛ ولكن هذا لم يؤدي إلى تغيير وجه عام المبادئ التوجيهية للعلاج. المقاومة تجاه الإشعاع والعلاج الكيميائي هو ظاهرة واسعة انتشار في جميع مراحل الورم ويوجد للبلاتين--على أساس العلاج الكيميائي كذلك أما بالنسبة للعلاج المستهدفة (مكافحة-EGFR؛ مستقبلات عامل نمو البشرة) ومؤخرا بدأت تظهر نقطة تفتيش تثبيط¹⁵. يأتي الإشعاع غير فعالة والعلاج الكيميائي بتكلفة عالية كبيرة الاعتلال المرضى من حيث خطر انخفاض وظيفة الكلي أو القلب بينها عسر البلع وجفاف الفم والتهاب الغشاء المخاطي. التنبؤ باستجابة العلاج قبل قرار مفهوم العلاج العام لكل مريض على حدة ويبدو أن الهدف الحاسم، ومنع مفاهيم العلاج لا لزوم لها، والآثار الجانبية والتكاليف.

لقد سعينا إلى إقامة نموذج لاختبار قابلية المعالجة الفردية للمريض نحو الحالية الكيماوي-الإشعاع القياسية التي يمكن إدماجها في الخوارزمية علاج الأورام العادية ومراقبة الجودة من وجهة نظر تقنية دائمة. وكان الهدف الأقصى لاستخدام النموذج دون استخدام خطوط الخلايا المتغيرة بشكل كبير والذين تتراوح أعمارهم بين، كما أنها تمثل ضعف الخلايا السرطانية البشرية الفعلية دون تغيرها وعدم التجانس كما نعلم الآن، أثناء إنشاء بروتوكول جرى في مختلف خطوط الخلايا. أن تكون مستقلة فقط من خطوط الخلايا المتوفرة تجارياً، نحن مؤخرا بنجاح إنشاء خط خلية وسيطة تسمى "البيكا" من الخلايا هنسكك الأولية من عينات الأورام البشرية مع علامات الخلوية يحافظ على الممرات السطحية والمحدودة ¹⁶. ينبغي خط الخلية "بيكا هذا" بمثابة تمهيدا لوضع نموذج على الطريق إلى ثم في وقت لاحق عقب محاكمات مع الخلايا السرطانية البشرية الطازجة من ورم الخزعات. وقد ثبت أن الخلايا في خلية ثلاثية الأبعاد تتفاعل الثقافات بشكل مختلف وأكثر في فيفو-تود إدارة عقاقير مضادة للسرطان من تلك التي تنمو في مونولاييرس^17،،من^{1819،20 ،21}، أساسا بسبب الحفاظ على الهجرة والتمايز الفرعية خصائص معينة خلية فرعية^22،،من²³²⁴. هنا، يمكننا وصف البروتوكول لنموذج ثلاثي الأبعاد على أساس كروي من خطوط الخلايا الوسيطة والخلايا الأولية الخلايا الحرشفية البشرية وطرق كيفية دمج هذا نموذج في علاج سرطان الرأس والرقبة الجراح والأورام ( الشكل 1).

جميع الدراسات التي تظهر في هذه المخطوطة، هي استخدام عينات من الأورام البشرية، محمية تحت وفي موافقة مع القرارات السابقة من الطب من ماينز/جامعة "ميونيخ، الأخلاقيات الطبية على مركز" اللجنة. المرضى قد أعطت الموافقة عن علم وفقا للمبادئ التوجيهية القانونية الوطنية الموافقة على الاستخدام العلمي للفائض من المواد البيولوجية التي تم الحصول عليها أثناء علاجهم. وقد أجريت بحوث امتثالا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان.

1-أخذ خزعة ورم من الرأس والخلايا الحرشفية هيك

1. أداء العام (بروبوفول و/أو سيفوفلوراني، عامل استرخاء العضلات) أو تسلل المحلية (التراكايين 2%، أدرينالين)/سطح التخدير (xylocaine) في كرسي فحص غرفة العمليات أو الحنجرة. تصور كتلة ورم في الفم أجزاء تجويف/البلعوم/الحنجرة/أخرى من الجهاز الهضمي والجهاز التنفسي العلوي مع تشغيل أدوات موحدة، وإذا لزم الأمر، تحت المجهر.
2. أخذ خزعة ورم طازجة من محيط الآفة السرطانية بأدوات غير حادة أو قطع. تجنب مركز الآفة سبب نخر الوفيرة في هذا المجال. وضع الأنسجة التي تم الحصول عليها في حاوية معقمة بمحلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر.
3. بعد الخزعة، إجراء الأرقاء حسب الحاجة، على سبيل المثال-، مع جهاز تخثر القطبين أو أحادي القطب بالإضافة إلى استخدام المواد فاسوكونستريكتيفي.
4. إحضار خزعة الورم يعتزم استخدامها لإجراء التجارب على ثقافة الخلية مباشرة إلى المسالك المختبر مجاورة. إرسال الخزعات الورم الأخرى إلى الطبيب الشرعي كالمعتاد استبعاد السرطان.
5. تأكد من أن فني مختبر على استعداد لتجهيز العينة مباشرة.

2-تجهيز العينة الورم

1. ضع العينة الورم على سطح مناسب والعقيمة وقطع عليه تماما مع استخدام واحد مشرط معقم أربا بأقل قدر ممكن.
   تنبيه: تأكد من موثق توثيقاً جيدا الحالة الأمراض المعدية والمنقولة عن طريق الدم والفني في اهتمام المؤسسات المعيارية بروتوكولات لمنع إبرة عصا أو إصابة القطع مع يحتمل أن تكون واقية من المواد المريض بروتوكولات لمتابعة بعد الإصابة المحتملة.
2. بعد فصل الميكانيكية كافية من الأنسجة الأولية، وضع الأنسجة في قنينة تحتوي على كولاجيناز أنا/ثانيا واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. منخل من خلال 70 ميكرومتر صقر خلية مصفاة وتغسل التعليق مع حل هانكس "متوازن الملح" (حبس).
3. بعد فصل ناجحة والغسيل اللاحقة، ضع تعليق يحتوي على 1-2 × 10⁶ خلايا في T75 خلية ثقافة قوارير (75 سم²) ليصل إلى كونفلوينسي الفرعية في 5% CO₂ ودرجة الحرارة 37 درجة مئوية. هذه الخطوة قد يستغرق مدة تصل إلى 10 أيام.
   1. استخدام keratinocyte خاصة الثقافة المتوسطة تتألف مما يلي: 125 مل دولبيكو تعديل النسور المتوسطة (دميم)، 250 مل من Keratinocyte تكمل المتوسطة (المتوسطة يكمل تتألف من 500 مل من المتوسطة سادس Keratinocyte، 15 ملغ للأبقار الغدة النخامية استخراج (بب)، 2.5 مل من البنسلين/ستربتوميسين، 150 نانوغرام المؤتلف طلائي النمو العامل البشري (لو)، ميليلتر 516 من 300 مم كاكل₂، مزيج الأسهم لتكون معدّة مسبقاً)، 125 مل مزيج المغذيات F12، 10 ملغ بب (0.75 مل)، 75 نانوغرام الماشوب البشري لو (2 ميليلتر) ، 3.75 مل مم 200 لتر-Alanyl-لجلوتامين-ديبيبتيدي (جدول المواد).

3. بذر الخلايا في لوحات الثقافة خلية التصاق منخفضة للغاية

1. تأكيد نمو الخلايا السرطانية تحت مجهر. عد الخلايا في الثقافة (الابتدائي أو خلية ثقافة) والبذور 5,000 الورم الرئيسي الخلايا أو الخلايا 1,000 2,000 خط الخلية المتوسطة/خط الخلية آخر في 200-300 ميليلتر من الوسائط (الخطوة 3.2.) داخل صفيحة التصاق منخفضة للغاية مع محدب، جولة القيعان (96-أيضا).
2. الثقافة الخلايا في 5% CO₂ في 37 درجة مئوية وفي أجزاء متساوية دميم ومجرى الهواء الخلايا الظهارية المتوسطة (بيجم)، 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، بيروفات صوديوم 1%، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%، 1% لالجلوتامين (الخطوة 2.3.). إذا كانت تستخدم خطوط الخلايا، وسائل الإعلام على أساس دميم غير كافية.
   1. إجراء تغييرات في وسائل الإعلام كل يوم. تولي اهتماما لا لنضح كروي مع ماصة أثناء تغييرات الوسائط. الثقافة الماغنيسيوم حتى مستوى النمو كما هو التوصل إلى المشروحة في 3.3 (حوالي 7-10 أيام).
3. تأكيد تشكيل كروي عفوية تحت المجهر التي تبحث عن التكتلات خلية ثلاثية الأبعاد، على شكل كروي. استبعاد الآبار مع عدم انتظام و/أو تشكيل كروي متعددة من إجراء مزيد من التحقيقات.
   ملاحظة: الماغنيسيوم يجب أن تكون مرئية بالعين المجردة، أيضا، تيسير مواصلة تجهيزها والوسائط التغييرات كما هو موضح أدناه.

4-تعريض الماغنيسيوم لعلاج الورم المتعدد الوسائط القياسية أو التجريبية

1. اختيار نظام علاج المطلوب. تصميم مجموعات كبيرة بما فيه الكفاية أن تسمح بإجراء مقارنات لعلاجات الماغنيسيوم غير المعالجة أو الماغنيسيوم تلقي نظم العلاج الجزئي فقط، على سبيل المثال. الإشعاع وحدها. حجم المجموعات التحكم يعتمد على تصميم المجموعة التجريبية ولا يمكن أن يعرف عالمياً.
2. تبادل وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام مع إضافات، ووسائط الإعلام معنى بتشريعات و/أو الأجسام المضادة عند التركيزات المطلوبة. إضافة سيسبلاتين في تركيزات 2.5/5/10 ميكرومتر أو 5-فلوروراسيل (5FU) في 30 ميكرومتر.
   ملاحظة: لتجارب إنتاجية عالية أو عدد أحجام/كبير مجموعة كبيرة من الفئات، يمكن للمرء استخدام روبوت الآلي بيبيتينج كما نحن كذلك إنشاء في التجارب.
3. وبدلاً من ذلك، تشع لوحات ثقافة الخلية مع الماغنيسيوم في 2 غراي استخدام مرفق إشعاع مناسبة.
   تنبيه: احترام بروتوكولات للمؤسسة فيما يتعلق بالوقاية تعرض للإشعاع الضار للموظفين. يعمل فقط مع الفنيين المعينين والمدربين وفقا للمبادئ التوجيهية للحماية الإشعاعية. إذا رغبت في ذلك، إضافة تشريعات كما هو موضح تحت 4.2. بعد ذلك.
4. احتضان الخلايا ل 24 ساعة في ظروف الثقافة هو موضح سابقا (37 درجة مئوية، والخطوة 3، 2).
5. بعد الحضانة، لا تزال ثقافة الخلية على الأقل 6 أيام مع التغييرات وسائل الإعلام كل يوم.

5-تقييم حجم كروي ومدى انتشار الهاتف الخلوي للقراءة بالانزيم

1. قياس حجم كروي من حيث المساحة بعد وثائق الصور الرقمية في يوم 6 (يوم 10، يوم 16) مع برامج رسم (المعلمة 1).
2. بعد الطرد المركزي في 520 ز x 2.5 دقيقة اللوحة، إزالة المادة طافية. تغسل في الخلايا التي تحتوي على كمية كافية من 1 × برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي اللوحة مرة أخرى كما هو موضح، يليه إزالة المادة طافية (PBS).
3. إضافة 100 ميليلتر من الخلية الانزيمية مفرزة الحل لكل قنينة للسماح الماغنيسيوم حل. احتضان لوحة ل 8 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
4. البحث عن حل ناجح كروي تحت المجهر. إضافة 100 ميليلتر من دميم. الطرد المركزي اللوحة في ز 520 x 2.5 دقيقة إزالة المادة طافية وتعليق الخلايا في 100 ميليلتر من دميم.
5. القيام مقايسة انتشار اللونية متاحة تجارياً، في مقايسة WST-8 مثال على كل قنينة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة²⁵. وقرأ المقايسة في قارئ المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) (المعلمة 2).

كنا قادرين على تكاثر توليد الماغنيسيوم من تعليق خلية مفردة، أولاً من خطوط الخلايا المختلفة بما في ذلك خط الخلية بيكا الملكية، في وقت لاحق من الخلايا السرطانية البشرية الأساسية المستمدة من خزعات ورم جديدة كما هو موضح في هاجمان وآخرون . 26-نحن تقييم اثنين من الأساليب المتبعة لجيل كروي؛ إسقاط اثنين يجري معلقة ما يسمى (HD) أسلوب وطريقة التصاق منخفضة للغاية (العلا)، يجري واحد أكثر فعالة وآمنة. كنا قادرين على تسليط الضوء على مزايا الأسلوب العلا عالية الدقة، بما في ذلك نمو أسرع كروي، بالمقارنة مع عدد أقل من القضايا مع لوحة المناولة، وما يترتب عليه من فقدان الماغنيسيوم مع الاهتزازات الثقيلة، ومزيد من النمو كروي استنساخه من حيث الاتساق ( الشكل 2). وكان حدوث الماغنيسيوم متعددة كل قنينة أكثر شيوعاً في أسلوب عالية الدقة. علينا التحقق من وصف أكثر وضوحاً مورفولوجية كروي. ويبين الشكل 3 إيمونوتشيميستري تلطيخ ل Ki67، علامة على انتشار، كروي من الخلايا بيكا. كما هو موضح في الأدب، والماغنيسيوم تتألف من أقل تنتشر الأساسية مع طبقة خارجي المتكاثرة، ومحاكاة مختلف مناطق انتشار HNSCC الصلبة في البشر. في المختبر في فيفو، هذا يرجع يفترض أن تدرج المواد المغذية والأكسجين تم توفيره بواسطة وسائل الإعلام ثقافة خلية مما تسبب في انخفاض من الهامش إلى مركز الورم.

ثم حاولنا أن نظهر أن المقايسة قادراً على الكشف عن الاختلافات في حجم كروي بعد الحضانة مع عقاقير العلاج الكيميائي أو التعرض للإشعاع المؤين، هنا يمثلون اثنين نظم العلاج القياسي الموحد هنسكك. قبل ربما إدماج المقايسة في روتين معالجة مسبقة، سيكون التحقق حساسية المقايسة شرطا أساسيا. معلمتين كانت متاحة كنقاط النهاية للمقايسة: حجم كروي (منطقة؛ والمعلمة 1 من الخطوة 5، 1) وانتشار (انظر المعلمة 2 من الخطوة 5.4.)، يجري علامة بديل لبقاء الخلية وإمكانات النمو بعد العلاج. وترد نتائج دراسات العلاج مع العلاج الكيميائي مشترك وبروتوكولات العلاج الكيماوي-الإشعاع في الشكل 4. التعرض والحضانة الماغنيسيوم مع سيسبلاتين أو 5FU أدى إلى انخفاض كبير في سرعة النمو مع مرور الوقت مقارنة بمجموعة السيطرة غير معالجة (ف< 0.001). الإشعاع مع 2Gy كان قادراً على الحد من سرعة النمو على نحو كبير (ف< 0.01). مقايسة البقاء على قيد الحياة (WST-8) كان قادراً على الكشف عن قيمة إضافية وكبيرة من الإشعاع الكيماوي مع سيسبلاتين مقارنة بالإشعاع وحدة (ف = بين 0.017)، مسبقاً دون أن تكتشف الفرق في تقييم حجم كروي. وهذا يؤكد أهميتها بالنسبة المقايسة ككل، زيادة حساسيتها للتغيرات الصغيرة استجابة العلاج.

رقم 1: مفهوم نموذج في الطريق إلى العلاج شخصية المستقبل- المرضى الذين لديهم أما الخلفية لعدوى فيروس الورم الحليمي البشري المخاطية و/أو تاريخ من تعاطي التبغ والكحول هذا إلى مركز الرعاية الثالثية الإحالة للاشتباه في تشخيص سرطان الرأس والرقبة. وتؤخذ خزعات من المناطق المخاطية المشبوهة أو الجماهير ورم العيانية تحت التخدير لتأمين التشخيص. بالإضافة إلى ذلك، نحن نأخذ ورم الخزعات لتوليد الثقافات الخلية على شكل كروي ثلاثي الأبعاد في المختبر. عند نمو كافية الماغنيسيوم استناداً إلى الخلية الأولية، نحن يعرضهم لنظم العلاج القياسي أو التجريبية الحالية لاختبار استجابة العلاج الفردي. يمكن إضافة تحاليل أخرى من الاختلافات الوراثية أو الجزيئية بعد تحليل نتائج العلاج. ويمكن استخلاص علاج النتائج في المختبر في الاعتبار في عملية التخطيط مفاهيم العلاج بالنسبة للمريض. وهذا الرقم هو طبع من هاجمان، J. et al. 26، مع الإذن الممنوح من قبل المؤلفين ودفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: يمكن أن تولد كل خلية خطوط الماغنيسيوم موثوقة؛ والاختلافات في حجم ووقت القراءة وهي وفقا للشكل 1- في التجارب الأولية والخلايا الأولية لا تشكل الماغنيسيوم استنساخه في هد لكن العلا لوحات (أسفل اليسار). إجراء المزيد من الدراسات التي يتعين الاضطلاع بها لتقييم الخصائص النمو كروي من الخلايا الأولية. عدد الخلايا على اليمين هو العدد الأولى لخلايا وضعت في القنينة شكل كروي. وهذا الرقم هو طبع من هاجمان، J. et al. 26، مع الإذن الممنوح من قبل المؤلفين ودفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: Ki67 immunochemistry تلطيخ شريحة كروي (بيكا)- هامش الثقافة يبين معدلات انتشار أعلى بكثير من الخلايا المركزية، محاكاة توزيع المغذيات في الأورام المخاطية الصلبة التي غالباً ما تظهر النوى نخرية. وهذا الرقم هو طبع من هاجمان، J. et al. 26، مع الإذن الممنوح من قبل المؤلفين ودفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: دراسات العلاج. (أ) كانت بيكا الخلايا المزروعة لتوليد الماغنيسيوم (n = 12 كل مجموعة) في لوحات العلا. حفز الخلايا وفقا للبروتوكول مع أي برنامج تلفزيوني كما التحكم، سيسبلاتين في 5 ميكرومتر أو 5FU في أحجام ميكرومتر. 30 الماغنيسيوم وحددت يوم 6 و 10 و 16 وفقا للبروتوكولات القياسية. المعاملة سيسبلاتين أو 5FU أدى إلى انخفاض كبير في حجم (فيتم إعطاء القيم في أسفل اليسار في الجزء (ب) تصميم تجريبية مماثلة كما هو الحال في (أ) (ن = 12)، ولكن مع إشعاع إضافية من 2Gy. (ج) يظهر المؤامرة دقيقة إلى الحد الأقصى. ووفقا الرتبةفالقيم الواردة في (ج)، الإشعاع السابق مع 2Gy أدى إلى انخفاض كبير في حجم كروي في مجموعة مراقبة، تقليد العلاج بالإشعاع، وعرض الإشعاع حساسية الخلايا بيكا. الإشعاع في تركيبة مع سيسبلاتين العلاج لا يؤدي إلى زيادة انخفاض كبير في حجم كروي (p> 0.05). ويبين مؤامرة مين إلى ماكس. (ج) تحسب فالقيم من 2-طريقة تحليل ANOVA من تحليل تجارب ألف وباء (د) WST8 يؤديها في يوم 16 كبديل للتحليل المتعلقة (المنطقة) الماغنيسيوم. تحليلات WST8 كانت قادرة على الكشف عن انخفاض كبير في الخلايا الحية بعد العلاج الكيماوي-الإشعاع (الإشعاع 2Gy وسيسبلاتين) بالمقارنة مع سيسبلاتين وحدها (ف = بين 0.017)، ومن ثم تظهر في الاستفادة من الجمع بين التحليل المتعلقة و WST8 مقايسة اللونية في وقت القراءة المقايسة. ويظهر المؤامرة دقيقة إلى الحد الأقصى. وهذا الرقم هو طبع من هاجمان، J. et al. 26، مع الإذن الممنوح من قبل المؤلفين ودفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.