كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Yoshiko Maida; Mami Yasukawa; Marco Ghilotti; Yoshinari Ando; Kenkichi Masutomi

doi:10.3791/57021

مقالة منهجية

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

DOI:

10.3791/57021

⸱

يونيو 12, 2018

Yoshiko Maida^*¹ , Mami Yasukawa^*¹ , Marco Ghilotti¹ , Yoshinari Ando¹ , Kenkichi Masutomi¹

¹Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) توليف الحمض النووي تيلوميريك ليس فقط، بل أيضا الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا. وهنا يصف لنا مقايسة المنشأة حديثا للكشف عن نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا ثالثي الذاتية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) هو وحدة فرعية الحفاز من تيلوميراسي، وأنها الغضروفي telomere من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الدنا. على الرغم من أن يدعى ثالثي المنتسخة العكسية، يثبت تحليلات الهيكلية والنشوء والتطور لمادة ثالثي عضو اليد اليمنى [بولمرس]، وتتصل الفيروسية تعتمد على الحمض النووي الريبي رنا بولمرس (ردربس) فضلا عن الفيروسية عكس المنتسخة. وقد حددنا أولاً RdRP نشاط ثالثي البشرية التي تولد رنا مكملة الوقوف إلى قالب غير الترميز الجيش الملكي النيبالي ويسهم في الجيش الملكي النيبالي إسكات في الخلايا السرطانية. لتحليل هذا النشاط الأنزيمي غير متعارف عليه، نحن نمواً الإنزيم RdRP مع ثالثي المؤتلف في عام 2009، وبعد ذلك أنشأت في المختبر بالانزيم RdRP ثالثي الذاتية. في هذه المخطوطة، يصف لنا طريقة الأخيرة. بإيجاز، مجمعات محصنة ثالثي المعزولة من الخلايا، والمحتضنة مع قالب الجيش الملكي النيبالي، ورنتبس بما في ذلك رنتب المشعة لرد فعل RdRP. للقضاء على الجيش الملكي النيبالي واحد-الذين تقطعت بهم السبل، تعامل نواتج التفاعل مع رناسي الأول، والمنتجات النهائية ويتم تحليل مع جل polyacrylamide التفريد. ويمكن الكشف عن راديولابيليد RdRP المنتجات التي أوتوراديوجرافي بعد التعرض بين عشية وضحاها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) المعروف جيدا كوحدة فرعية الحفاز من تيلوميراسي، وأنها الغضروفي telomere استخدام قالب الحمض النووي الريبي محددة¹telomerase الجيش الملكي النيبالي المكون (ترك)،. على الرغم من أن مادة بوليميريزيس تيلوميريك الحمض النووي كعنصر من عناصر تيلوميراسي، التحليل الهيكلي والنشوء والتطور تشير إلى أن ثالثي ارتباطاً وثيقا مع الفيروسية تعتمد على الحمض النووي الريبي رنا بولمرس (ردربس)، فضلا عن المنتسخة العكسية الفيروسية، وتشاطر المجالات مع هذه بولمرس²^،^،من³⁴. RdRP هو الإنزيم الذي يولد حبلا الحمض النووي الريبي مكملة لقالب الجيش الملكي النيبالي. يتم ترميز الإنزيم ليس فقط في الفيروسات ولكن أيضا في نموذج الكائنات، مثل النباتات والخميرة والدودة، وتوليف الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي RdRP يساهم في إسكات الجينات النسخي وبوستترانسكريبشونال في هذه الكائنات الحية⁵^،⁶. على الرغم من أن RdRP البشرية كانت مفقودة منذ فترة طويلة، نحن وجدنا نشاط RdRP ثالثي البشرية في 2009⁷.

أولاً أكد RdRP نشاط ثالثي مع البروتين المؤتلف⁷، ثم أنشأت مقايسة حساسة في المختبر للكشف عن النشاط RdRP الذاتية ثالثي⁸. هنا، علينا أن نظهر في المختبر RdRP المقايسة (مقايسة الملكية الفكرية-RdRP) لمادة الذاتية. هذا الأسلوب يبدأ مع إيمونوبريسيبيتيشن (IP) من مادة الذاتية، وتبعتها في المختبر رد RdRP، التي تدمج ribonucleotides المشعة خيوط الحمض النووي الريبي الوليدة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-كاشف الإعداد

الكواشف المستخدمة "المزامنة الخلية"
1. لتوليد المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) التي تحتوي على thymidine 2.5 ملم، حل ملغ 30.28 من thymidine كل 1 مل مياه الصف زراعة الأنسجة بإعداد thymidine 125 ملم. فيلتراتي الحل مع وحدة تصفية حقنه ميكرومترات 0.22. أضف 1 مل thymidine طازجة 125 مم كل 50 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) المصل البقري الجنين (FBS).
2. لإنشاء دميم يحتوي على 0.1 ميكروغرام/مل من نوكودازولي، حل نوكودازولي في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لإعداد 5 ميكروغرام/ميكروليتر نوكودازولي. إضافة 1 ميليلتر من 5 ميكروغرام/ميليلتر نوكودازولي الواحد 50 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) FBS.
3. لإنشاء دميم المحتوية على 0.002 في المائة (المجلد/المجلد) من [دمس]، أضف 1 ميليلتر من [دمس] في 50 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) FBS.
الكواشف المستخدمة لفحص الملكية الفكرية-RdRP
1. إعداد 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4) تحلل المخزن المؤقت 150 ألف: مم كلوريد الصوديوم، و 0.5% (المجلد/المجلد) نونيديت P-40 (NP-40). تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
2. إعداد 5 × خلات المخزن المؤقت: 50 ملم حمض 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic (حبيس)-كوه (pH 7.8)، خلات البوتاسيوم 500 مم و 20 مم مجكل₂. تخزين الكاشف في درجة حرارة الغرفة.
3. يعد غسل العازلة س 1:1 خلات العازلة، والغليسيرول 10% (المجلد/المجلد)، 0.1% (المجلد/المجلد) تريتون X-100 و 0.06 x حوزتي المانع كوكتيل، حمض اتهيلينيديامينيتيتراسيتيك (يدتا)-مجاناً. إعداد المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 اليوم الاستخدام أو يوم قبل الاستخدام. تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
4. إعداد الحل AGC: 1 x خلات المخزن المؤقت، والغليسيرول 10% (المجلد/المجلد) و 0.02% (wt/المجلد) 3-[(3-Cholamidopropyl) ديميثيلامونيو]-1-بروبانيسولفونات (الفصول). تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
5. لإنشاء حل AGC تحتوي على 2 مم كاكل₂، إضافة 100 ميليلتر من كاكل 1 م₂ لكل 50 مل من محلول AGC. تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
6. لإنشاء حل AGC تحتوي على 3 مم جليكول مكررا (ب-أمينوثيليثير)-ن، ن، ن '، ن'--حمض tetraacetic (عطا)، أضف ميليلتر 375 متر 0.4 عطا (درجة الحموضة 7.5) الواحدة 50 مل من محلول AGC. تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
7. يعد غسل العازلة x 2:1 خلات العازلة والفصول 0.02% (wt/المجلد). تخزين الكاشف في 4 درجات مئوية.
8. إعداد الحل HMD: 0.2 م حبيس-كوه (pH 7.8), 40 مم مجكل₂ و 2 مم ديثيوثريتول (DTT). تخزين الكاشف في-20 درجة مئوية.
  ملاحظة: حل HMD ينبغي تجديد على الأقل في ثلاثة أشهر.
9. إعداد 2 × "ك بروتيناز" المخزن المؤقت: 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.6)، يدتا 20 مم و 1% (wt/المجلد) الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي). تخزين الكاشف في-20 درجة مئوية.
10. إعداد 2 × تحميل المخزن المؤقت: 95% (المجلد/المجلد) ميثلامين، يدتا 20 مم و 1% (wt/المجلد) زاي البرتقال تخزين الكاشف في-20 درجة مئوية.

2-إعداد خلايا هيلا

ملاحظة: إعداد خلايا هيلا متزامنة في المرحلة الانقسامية (التلاعب) أو تقسيم بشكل غير متزامن (unmanipulated). الثقافة الخلايا حضور 5% CO₂ في 37 درجة مئوية.

تزامن هيلا الخلايا في الانقسام
1. بلايت 1 × 10⁶ خلايا هيلا مع 10 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) FBS في صحن ثقافة 10 سم.
2. يومين بعد الطلاء، يستعاض في المتوسط 10 مل دميم تتضمن التريتيوم 2.5 ملم و 10% (المجلد/المجلد) FBS... ثقافة الخلايا ح 24.
3. تغسل الخلايا ثلاث مرات مع 10 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS) (-)، والثقافة في الخلايا التي تحتوي على 10 مل دميم التي تحتوي على 10% (المجلد/المجلد) FBS ح 6.
4. استبدال المتوسطة مع 10 مل دميم يحتوي على 0.1 ميكروغرام/مل نوكودازولي و 10% (المجلد/المجلد) FBS، والثقافة الخلايا ح 14.
5. يهز الطبق الثقافة بلطف، واسترجاع المادة طافية تحتوي على خلايا الانقسامية منفصلة. حساب عدد الخلايا لفحص IP--RdRP.
6. الطرد المركزي العينة في 490 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
  ملاحظة: يمكن تخزين بيليه الخلية في-80 درجة مئوية.
إعداد خلايا هيلا unmanipulated
1. بلايت 1 × 10⁶ خلايا هيلا مع 10 مل دميم وتستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) FBS في صحن ثقافة 10 سم.
2. يومين بعد الطلاء، يستعاض في المتوسط 10 مل دميم التي تحتوي على 10% (المجلد/المجلد) FBS... ثقافة الخلايا ح 30.
3. استبدال المتوسطة مع 10 مل دميم المحتوية على 0.002% (المجلد/المجلد) [دمس] و 10% (المجلد/المجلد) FBS، والثقافة الخلايا ح 14.
4. جمع الخلايا باستخدام 0.7 مل التربسين (2.5 g/L) الذي يحتوي على 1 مم يدتا تريبسينيزيشن. حساب عدد الخلايا لفحص IP--RdRP.
5. الطرد المركزي العينة في 490 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
  ملاحظة: يمكن تخزين بيليه الخلية في-80 درجة مئوية.

3-الملكية الفكرية-RdRP الإنزيم

أ-[اغروس] بروتين حبة إعداد
1. نقل 1 مل (سرير حجم 500 ميليلتر) راتنج انجذاب إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
2. إضافة 800 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت بالخرز، ومزيج جيد بعكس الأنبوبة عدة مرات. الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرتين (إجمالي يغسل ثلاث).
3. إضافة 800 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت بالخرز، تخلط جيدا بعكس الأنبوبة عدة مرات. تدوير الأنبوب بين عشية وضحاها (أو على الأقل 4 ح) في 4 درجات مئوية على شاكر دوارة.
4. الطرد المركزي الأنبوب في 800 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
5. إضافة 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت بالخرز، ومزيج جيد بعكس الأنبوبة عدة مرات. تخزين الخرز عند 4 درجة مئوية.
إعداد الخلية ليستي
1. (اختياري) إذا كان يتم تجميد الخلايا في الخطوة 2، وإذابة الخلايا المجمدة على الجليد حتى تصبح الخلايا فضفاضة.
2. تغسل الخلايا مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني (-). الطرد المركزي العينة في س 1,450 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية.
3. الخلايا مع المثلج تحلل العازلة (1 مل تحلل المخزن المؤقت بكل 1 × 10⁷ للخلايا) بلطيف بيبيتينج.
4. Sonicate العينة في أنبوب 1.5 مل مع الشروط التالية؛ تعيين تضخيم سونيكاتور نسبة 25%، و sonicate لمدة 10 ق.
5. الطرد المركزي العينة في س 20,400 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
6. جمع المادة طافية. نقل 1 مل من المادة طافية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب.
  تنبيه: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف خالية من رناسي.
إيمونوبريسيبيتيشن
1. قبل مسح من الخطوة 3.2.6 بإضافة 40 ميكروليتر (حبة حجم 20 ميليلتر) من البروتين بريواشيد A-[اغروس] حبات كل 1 مل من. خلط جيدا بعكس الأنبوبة عدة مرات وتدوير العينة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
2. الطرد المركزي العينة في س 13,000 ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، واسترجاع المادة طافية.
3. إضافة 40 ميكروليتر (سرير حجم 20 ميليلتر) البروتين بريواشيد A-[اغروس] الخرز و 10 ميكروغرام لجسم الإنسان المضادة مادة (استنساخ: 10E9-2)⁸ إلى المجازين ليستي. خلط جيدا بعكس الأنبوبة عدة مرات وتدوير العينة عند 4 درجة مئوية خلال الليل.
4. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية.
5. أغسل الخرز مع الغسيل المخزن المؤقت 1: إضافة 1 مل من يغسل المخزن المؤقت 1 إلى الخرز ومزيج جيد بعكس الأنبوب وتدوير العينة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات إضافية.
6. أغسل الخرز مرة واحدة مع AGC محلول يحتوي على 2 مم كاكل₂: إضافة 1 مل من محلول AGC تحتوي على 2 مم كاكل₂إلى الخرز ومزيج جيد بعكس الأنبوب وتدوير العينة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية.
7. علاج الخرز مع نوكلاس ميكروكوككال (منسى): إعداد الخليط رد فعل منسى المبينة في الجدول 1. ريسوسبيند الخرز في 60 ميليلتر من خليط رد فعل منسى قبل بيبيتينج لطيف. هزة العينة بلطف (20 إلى 25 لفة في الدقيقة) على القرص الدوار شاكر في حاضنة بلتيير من نوع لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  ملاحظة: من المهم جداً استخدام شاكر متموجة والتقيد الحد الأقصى للسرعة في هذه الخطوة. نوع آخر من الهزازات، مثل خلاطات الدورية، لا ينصح.
8. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية.
9. أغسل الخرز مرتين مع AGC محلول يحتوي على 3 مم عطا: أضف 1 مل من محلول AGC تحتوي على 3 مم عطا إلى الخرز ومزيج جيد بعكس الأنبوب وتدوير العينة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
10. أغسل حبات مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2: إضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2الخرز، تخلط جيدا بعكس الأنبوب، وتدوير العينة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الطرد المركزي العينة في 3,300 س ز 0.5 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية. تبقى الخرز على الجليد أثناء إعداد الرد RdRP.
  تنبيه: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف خالية من رناسي.
رد فعل RdRP
1. إعداد خليط رد فعل RdRP في أنبوب جديد كما هو موضح في الجدول 2.
2. إضافة ميليلتر 6 من [α-³²ف] UTP (3,000 Ci/ملمول) إلى خليط ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
  ملاحظة: ATP [α-³²ف]، [α-³²ف] الأداء النظري المركب، أو أنشئ [α-³²ف] يمكن استخدامها لرد الفعل بدلاً من [α-³²ف] UTP.
3. أضف 1 ميليلتر من قالب الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام/ميليلتر) إلى خليط ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
  ملاحظة: إلى تحديد الإنزيم RdRP، الحمض النووي الريبي القالب التالي يوصي:-ججاوكاوجوججوككووواكووووااكككا 5 '-3' ⁹.
4. ريسوسبيند الخرز مع 20 ميليلتر من خليط رد فعل RdRP من الخطوة 3.4.3 من بيبيتينج.
5. هزة العينة بلطف (20 إلى 25 لفة في الدقيقة) على القرص الدوار شاكر في حاضنة بلتيير نوع ح 2 عند 32 درجة مئوية.
6. إضافة 5.4 ميليلتر من "البروتيناز ك" (20 ملغ/مل) وميليلتر 45.4 x 2 "ك بروتيناز" المخزن المؤقت إلى خليط رد فعل. مزيج من بيبيتينج ويهز (20 إلى 25 لفة في الدقيقة) العينة على القرص الدوار في حاضنة بلتيير من نوع لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
7. إضافة ميليلتر 109.2 المياه خالية من رناسي للعينة.
8. إضافة 200 ميليلتر من حمض الفينول-كلوروفورم للعينة. مزيج جيد من دوامة، ومن ثم الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
9. إضافة 20 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 م (pH = 5.2)، 4 ميليلتر 250 ميليلتر من الإيثانول إلى المرحلة المائية والناقل هطول الأمطار. هز الأنبوبة جيدا لخلط، ثم الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
10. أغسل بيليه مع 300 ميليلتر الباردة الإيثانول (المجلد/المجلد) 70% المخزنة في-20 درجة مئوية. الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
11. تجاهل المادة طافية وأيردري بيليه.
  تنبيه: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف خالية من رناسي.
  ملاحظة: يمكن تخزين بيليه من الخطوة 3.4.11 في-20 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل.
العلاج رناسي
1. ريسوسبيند بيليه من الخطوة 3.4.11 في 20 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
2. إعداد خليط رد فعل رناسي في أنبوب جديد كما هو موضح في الجدول 3.
3. إضافة ميليلتر 180 من خليط رد فعل رناسي للعينة، واحتضان الأنبوب ح 2 في 37 درجة مئوية.
4. إضافة 2.3 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% (المجلد/المجلد) للعينة، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
5. إضافة 2 ميليلتر من "البروتيناز ك" (20 ملغ/مل) للعينة، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
6. إضافة ميليلتر 205 حمض الفينول-كلوروفورم للعينة. ثم أن مزيج جيد من دوامة، الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
7. إضافة 20 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 م (5.2 درجة الحموضة)، 4 ميليلتر من الناقل هطول الأمطار و 250 ميليلتر من الإيثانول إلى مرحلة مائي. هز الأنبوبة جيدا لخلط، ثم الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
8. أغسل بيليه مع 300 ميليلتر الباردة الإيثانول (المجلد/المجلد) 70% المخزنة في-20 درجة مئوية. الطرد المركزي العينة في س 21,100 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
9. تجاهل المادة طافية وأيردري بيليه.
  ملاحظة: يمكن تخزين بيليه من الخطوة 3.5.9 في-20 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل.
هلام التفريد وأوتوراديوجرافي
1. ريسوسبيند العينة مع 20 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
2. إضافة 20 ميليلتر من 2 × تحميل المخزن المؤقت.
3. تغلي العينة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. سحق العينة على الجليد.
4. تشغيل الهلام. في حالة حجم القالب nts 34 (انظر أيضا خطوة 3.4.3)، يتم استخدام جل polyacrylamide م اليوريا-10% 7 يشوه التفريد جل.
5. الجاف للجل مع هلام مجفف.
6. يعرض الفيلم لجل المجففة داخل كاسيت الأشعة سينية مع شاشة تكثيف في-80 درجة مئوية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع قالب الحمض النووي الريبي الموصى بها، لوحظت المنتجات RdRP المشعة بين 20 إلى 30 النيوكليوتيدات (nt) على وجه التحديد في خلايا هيلا في المرحلة الانقسامية بعد التعرض بين عشية وضحاها (الشكل 1A). نموذجياً، يوضح كثافة إشارة من المنتجات RdRP اثنين من قمم المتوضعة حوالي 25 nt و 30 nt بما يتفق مع حجم توزيع المنتجات التي أكدتها تسلسل الجيل القادم⁹. على النقيض من الخلايا الانقسامية، إظهار خلايا هيلا دون التزامن تقريبا غياب المنتجات المشعة nt 20 – 30. إشارات البيضاوي، التي توضع تحت 20 nt في جميع العينات هي الانجرافات غير محدد.

في حالة أن هناك فقط منتج nt ~ 30 مع إشارة ضعيفة في خلايا هيلا الانقسامية، فإنه يشير إلى أن رد فعل RdRP لم يذهب جيدا. على سبيل المثال، إذا كان يتم تنفيذ المعاملة منسى تقريبا وغير لائق، كثافة إشارة في هيلا الانقسامية الخلايا يقلل إلى حد كبير (الشكل 1B). رد فعل RdRP يؤديها مع الحل HMD القديم يقلل أيضا من المنتجات (الشكل 1).

figure-results-1
الشكل 1 : منتجات RdRP ممثل ثالثي الذاتية في الانقسامية هيلا الخلايا. معالجة نتائج المقايسة RdRP الملكية الفكرية في خلايا هيلا الممثل ثلاثة (A) مع نوكودازولي (التلاعب) أو [دمس] (unmanipulated). 34 مركباً كيميائيا nt الرنا كقالب. (ب) الملكية الفكرية-RdRP الإنزيم في خلايا هيلا الانقسامية يؤديها مع منسى معاملة غير لائقة. (ج) الملكية الفكرية-RdRP الإنزيم في خلايا هيلا الانقسامية يؤديها مع الحل HMD أما جديدة أو قديمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكواشف	وحدة التخزين
ميكروكوككال نوكلاس، 20 ش/ميليلتر	1 ميليلتر
المخزن المؤقت نوكلاس ميكروكوككال، 10 x	ميليلتر 8
المياه خالية من رناسي	ميليلتر 51

الجدول 1: منسى رد فعل المزيج المكون.

الكواشف	وحدة التخزين
الفصول، 0.07% (wt/المجلد)	ميليلتر 6
الحل HMD	2 ميليلتر
rATP، 80 مم	0.5 ميليلتر
رجتب، 8 مم	1 ميليلتر
راتب، 0.4 مم	1 ميليلتر
ركتب، 8 مم	1 ميليلتر
رناسي المانع، 40 ش/ميليلتر	0.5 ميليلتر
المياه خالية من رناسي	1 ميليلتر

الجدول 2: RdRP رد فعل المزيج المكون.

الكواشف	وحدة التخزين
Ribonuclease رناسي واحد، يو 10/ميليلتر	ميليلتر 0.2
رد فعل المخزن المؤقت, 10 x	20 ميليلتر
المياه خالية من رناسي	159.8 ميليلتر

الجدول 3: Ribonuclease رد فعل المزيج المكون.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقايسة RdRP الملكية الفكرية أسلوب حساسة للكشف عن النشاط RdRP من البشر ثالثي. وأعرب عن البروتين ثالثي هو الغاية في خلايا هيلا الانقسامية، التي تشكل مادة RdRP المعقدة⁸^،^،من⁹¹⁰. وهذا يشير إلى أن خلايا هيلا الانقسامية مادة أمثل للكشف عن النشاط RdRP. في البروتوكول، المذكورة أعلاه، الانقسامية وغير متزامنة هيلا يتم تضمين الخلايا إيجابية، ومن الأمثلة سلبية، على التوالي. كما هو موضح في الشكل 1A، منتجات الإنزيم RdRP من قالب الحمض النووي الريبي الموصى بها في خلايا هيلا الانقسامية إظهار إشارات مشعة واسعة بين 20 إلى 30 nt. بالإضافة إلى خلايا هيلا، لدينا إجراء المقايسة مع أنواع مختلفة من خطوط الخلايا، ووجدت أنه لا يمكن تغيير نمط الإشارات في خلية مختلفة الأنواع⁹: تظهر بعض إشارة قوية فقط حوالي 30 nt، تظهر بعض نمط مماثل مع خلايا هيلا. ونحن أيضا بإجراء المقايسة مع قوالب الرنا خلاف 34 قالب nt⁸، قصيرة وطويلة (~ 300 nt) الكشف مع تسلسل مختلف، ونجاح الحصول على منتجات RdRP من تلك القوالب رغم أنه قد تكون هناك بعض التفضيل. في المحاكمة الأولى، ومع ذلك، نوصي باستخدام خلايا هيلا في المرحلة الانقسامية والقالب nt الحمض النووي الريبي 34. ردربس يمكن أن تولد الرنا المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في تعتمد على التمهيدي وفي طريقة مستقلة عن التمهيدي¹¹. وقد أبلغنا أن ثالثي يحتفظ بهذه الخاصية البشرية RdRP⁷^،⁹؛ يجمع ثالثي دسرنا من قالب الجيش الملكي النيبالي مع هيكل 3 '-foldback من خلال إليه فتيلة ظهر⁷. 34 قالب nt الجيش الملكي النيبالي، يجمع ثالثي خيوط التكميلية دون استخدام كبسولة تفجير⁹. على وجه التحديد الكشف عن منتجات RdRP توليفها بطريقة مستقلة عن التمهيدي، أي دي نوفو توليف الحمض النووي الريبي المنتجات، [α-³²ف] NTP يمكن الاستعاضة عن [γ-³²ف] NTP في رد فعل RdRP⁹.

علاج منسى ثالثي مجمعات محصنة في الخرز خطوة حاسمة لتحقيق النتائج المرجوة. إذا كان يتم تنفيذ معاملة مناسى طويل جداً أو بالهز مكثفة، منتجات RdRP ستقل ملحوظ. لتجنب هذه المتاعب، نوصي بشدة على التقيد البروتوكول بعناية. الحل HMD عامل حاسم آخر للنجاح. إذا كنت تجد أن الإشارات ضعيفة جداً، يحل محل حل HMD واحدة أعدت حديثا.

في جميع أنحاء البروتوكول، واحدة ينبغي إيلاء عناية كبيرة لتفادي التلوث رناسي. ينبغي أن تجري معاملة ribonuclease مع معدات مخصصة. بعد التلاعب في Ribonuclease، واحدة ينبغي تجاهل نصائح وأنابيب مع رناسي فورا، القضاء على رناسي مع الحل المتخصصة (مثل هادئة رناسي)، وتغيير بساتين.

ثالثي يتفاعل مع ترك ليس فقط ولكن أيضا العديد من أنواع الكشف الذاتية، وكنا قد ذكرت جزءا منها⁷. التعديل في مقايسة RdRP الملكية الفكرية، مثل المقايسة RdRP الملكية الفكرية دون علاج مناسى، ستوفر قائمة كاملة من قوالب الرنا الذاتية لدليل النشاط و bioinformatic RdRP المرتبطة بمادة على ملامحها التسلسل. ونحن قد طبقت بنجاح هذا البروتوكول للأنسجة ليستي. لأن هو أعرب ثالثي في مجموعة متنوعة من الأنسجة العادية والورم، هذا التحليل قد تكون مفيدة للتحقيق غير متعارف عليه وظيفة ثالثي الأنزيمي في الإنسان.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل وأيده في الجزء المشروع "تطوير البحوث الابتكارية" في علاجات السرطان (فالمباشر) (15cm0106102h0002، ك. م.) والمشروع لأبحاث السرطان والتطور العلاجي (ف إنشاء) (16 سم 01061150001، ك. م.) من الوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية، AMED؛ مؤسسة العلوم وتاكيدا (Y.M.)؛ منحة صندوق أبحاث السرطان الأميرة تاكاماتسو (13-24520، Y.M.)؛ وعدد المنح JSPS كاكينهي JP16K07133 (Y.M.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
دولبيكو s النسر المعدل s متوسط (DMEM)	واكو	044-29765
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	CORNING	35-010-CV
محلول مختلط للبنسلين والستربتومايسين	nacalai tesque	26253-84
محلول حمض التربسين - الإيثيلين ديامينيتيترا أسيتيك (EDTA)	ناكالاي تيسك	32777-44
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS (-))واكو		166-23555
Thymidine	nacalai tesque	07147-61
Nocodazole	Sigma	M1404
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	nacalai tesque	08904-85
كلوريد الصوديوم	nacalai tesque	31333-45
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان	ناكالاي تيسك	35434-21
حمض	الهيدروكلوريكNacalai Tesque	18321-05
Nonidet P-40 (NP-40)	Nacalai tesque	25223-04
بيرس بروتين أ بالإضافة إلى Agarose	Thermo Scientific	22812
2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيل] حمض الإيثان سلفونيك (HEPES)	ناكالاي تيسك	17514-15
هيدروكسيد البوتاسيوم	واكو	168-21815
البوتاسيوم أسيتات	ناكالاي تيسك	28405-05
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl2 & bull; 6H2O)	واكو	135-00165
الجلسرين	ناكالاي tesque	17045-65
بولي أوكسي إيثيلين (10) أوكتيل فينيل الأثير (تريتون X-100) واكو		169-21105
جأومبليت ، خالي من EDTA	Roche Applied Science	11 873 580 001
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2 & bull; 2H2O)	nacalai tesque	06731-05
نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase)	Takara Bio	2910A
الإيثيلين جلايكول مكرر (b-aminoethylether) -N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA)	nacalai tesque	15214-92
3- [(3-كولامیدوبروبيل) ثنائي ميثيل أمونيو] -1-بروبان سلفونات (CHAPS)	ناكالاي تسك	07957-64
ثنائي ثيوثريتول (DTT)	nacalai tesque	14128-91
rCTP ، rATP ، rUTP ، rGTP ، 100 ملي مولار لكل	بروميجا	E6000
[a-^{32< / sup>P] UTP (3,000 Ci / mmol)}	PerkinElmer	NEG507H	استخدم RI الطازج لمثبط الفحص
RNase	TOYOBO	SIN-201
Proteinase K	Takara	9033
حمض الفينول: الكلوروفورم ، الرقم الهيدروجيني 4.5 ( مع IAA ، 125: 24: 1)	Life Technologies	AM9720
3 M أسيتات الصوديوم	NIPPON GENE	316-90081
الإيثانول (99.5)	nacalai tesque	14713-95
Dr. GenTLE ناقل الترسيب	Takara Bio	9094
RNase One Ribonuclease	Promega	M4265
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)	nacalai tesque	02873-75
ناكالاي	منزوع الأيونات	16345-65
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ثنائي الصوديوم ثنائي هيدرات الملح (EDTA)	nacalai tesque	15130-95
Orange G	nacalai tesque	25401-22
حاضنة CO2	على سبيل المثال ،	SCA-325DRS
	على سبيل المثال ، TOMY	EX-135	للخطوة ب)
جهاز طرد مركزي مبرد دقيق	على سبيل المثال ، KUBOTA	3740	للخطوة 6.2
Sonicator	Qsonica	Q125	ضع طرفا صغيرا (# 4422) على جهاز الصوتنة ، للخطوة 6.4
طرد مركزي مبرد دقيق	على سبيل المثال ، TOMY	MX-305	للخطوة 6.5
حاضنة مبردة	على سبيل المثال ، باناسونيك	MIR-154-PJ	ضع شاكر دوار بالداخل
شاكر دوار	على سبيل المثال ، TAITEC	RT-5
حاضنة مبردة ؛	على سبيل المثال ، TAITEC	BR-43FL	تعيين شاكر " موجة صغيرة" في الداخل ، للخطوة 7.7
موجة صغيرة	كواحدة	WEV-03	شاكر للخطوات 7.7 و 8.5 و 8.6
حاضنة	على سبيل المثال ، TAITEC	HB-80	قم بتعيين شاكر " موجة صغيرة" في الداخل ، للخطوتين 8.5 و 8.6
حاضنة الكتل	، على سبيل المثال ، ASTEC	BI-516S

فورماميد ، جهاز الطرد المركزي ASTEC جهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).
Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA dependent RNA Polymerase Activity Human Telomerase Reverse Transcriptase RdRP Assay TERT Immune Complex Isolation Polyacrylamide Gel Electrophoresis Autoradiography Detection RNase I Treatment Radioactive rNTP Incubation Protein A agarose Beads Anti human TERT Antibody

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة