التقديم ثلاثي الأبعاد وتحليل إيمونولابيليد، أوضح البشري شبكات الأوعية الدموية فيلوس المشيمية

Summary

تقدم هذه الدراسة وضع بروتوكول للأنسجة يمكن عكسها المقاصة، إيمونوستينينج، 3D--تقديم وتحليل شبكات الأوعية الدموية في المشيمة البشرية الزوائد عينات تتراوح بين 1-2 مم³.

Abstract

تبادل المغذيات والغاز بين الأم والجنين يحدث في الواجهة من الدم إينتيرفيلوس الأمهات والشبكة الشعرية فيلوس الواسعة التي تشكل جزءا كبيرا من حمة المشيمة البشرية. الشبكة الشعرية فيلوس القاصي هو المحطة إمدادات الدم الجنين بعد عدة أجيال من تفريع السفن تمتد خارجاً من الحبل السري. هذه الشبكة قد غمد خلوية متجاورة، طبقة حاجز تروفوبلست المخلوي، مما يمنع اختلاط دم الجنين ودم الأم الذي هو اغتسل بشكل مستمر. الإهانات لسلامة الشبكة الشعرية المشيمة، التي تحدث في اضطرابات مثل الأمهات مرض السكري وارتفاع ضغط الدم والبدانة، عواقب تلك المخاطر الصحية الخطيرة الحالية للجنين، وفيات الرضع، والكبار. لتحديد الآثار الهيكلية لهذه الإهانات بشكل أفضل، تم وضع بروتوكول لهذه الدراسة، أن يلتقط بنية الشبكة الشعرية بناء على أمر من 1-2 مم³ فيه أحد يمكن التحقيق معالمه طوبولوجي بتعقيداتها كاملة. لتحقيق هذا الهدف، يتم تشريح مجموعات من الزوائد الطرفية من المشيمة، وطبقة تروفوبلست والجهاز الشعرية إيمونولابيليد. ثم توضح هذه العينات مع أنسجة جديدة تطهير العملية التي تجعل من الممكن الحصول على رصات الصور [كنفوكل] إلى أعماق z ~ 1 مم. اﻷداءات ثلاثية الأبعاد هذه المكدسات ثم معالجتها وتحليلها لتوليد شبكة الشعرية الأساسية تدابير مثل الحجم وعدد الفروع الشعرية، ونقاط النهاية فرع الشعرية، كالتحقق من مدى ملاءمة هذا النهج وصف الشبكة الشعرية.

Introduction

فهمنا للمشيمة النامية وعن الأمراض، محدودة إلى حد كبير، الاستدلال على العلاقات المكانية بين الزوائد المتاخمة والشعيرات الدموية الواردة المستمدة من أقسام النسيجي. في هذه الدراسة، تناولنا هذه المسألة بوضع الوسائل اللازمة لتوليد اﻷداءات ثلاثية الأبعاد (3D) للشبكات الشعرية المشيمة البشرية التي تصلح لإجراء تحليلات لميزات الشبكة الشعرية (مثل المنطق التفريعي، صلابة). للقيام بذلك جمعنا بين تلطيخ إيممونوفلوريسسينت مع اثنين من المنتجات إزالة الأنسجة التجارية، فيسيكول-1 وفيسيكول-2 (المشار إليها أدناه كحل-1 والحل-2).

المشيمة البشرية مجمع واسعة من الأوعية الدموية التي تقع في مجال التفاعل بين الدم إينتيرفيلوس الأم والجنين النامي. تمتد خارجاً من أن الإدراج في لوحة المشيمة، الحبل السري وفروع في شبكة من الشرايين والاوردة التي تتشعب لتغطية سطح المشيمة مع وضع شبكة الأوعية الدموية. تحقق غاياتها ثم تخترق أسفل الداخلية أو عمق القرص المشيمة حيث يخضع لعدة أجيال أكثر التفريع وينتهي في الزوائد الطرفية وشبكاتها الشعرية الواردة، الموقع لتبادل الغازات، المواد الغذائية، والأيضية النفايات بين دم الأم والجنين.

الإهانات إلى شبكة الشعيرات الدموية المشيمية خلال التنمية عواقب دائمة على صحة الجنين والرضع حديثي الولادة و الكبار الناشئة ^1،،من²³. ونظرا للأمراض المرتبطة بالحمل مثل الإجهاض، وتقييد النمو داخل الرحم، ^4،السكري مقدمات الارتعاج والأمهات^5،6 هناك قيمة عالية على وضع أساليب لقياس و توصيف الشبكات الشعرية فيلوس المشيمة. حاجز رئيسي أن شبكات الأوعية الدموية المشيمية تشمل طائفة واسعة من النطاق. يمكن أن تكون شبكات الأوعية الدموية السطحية كبيرة كما 4-5 مم في القطر. الشعيرات الدموية فيلوس المحطة الطرفية يتم بناء على أمر من 10-20 ميكرومتر في القطر؛ تحتوي المشيمة على أكثر من 300 كيلومتر من الأوعية الدموية ⁷. وفي الوقت الحاضر، هناك تقنيات سهلة الاستخدام وسريعة القليلة التي يمكن التقاط هذه النهايات من حجم السفينة. وحتى الآن، يمكن أن يصبح سوى عدد صغير من الزوائد بالفحص المجهري. على سبيل المثال، جيركوفسكا et al. ركز على الزوائد المشيمية في الأجل، الجمع بين الفحص المجهري [كنفوكل] مع أقسام الضوئية المسلسل على 1 ميكرومتر فترات تم الحصول عليها من 120 ميكرومتر سميكة الأقسام؛ لا توجد بيانات عن عدد العينات التي درست ولا إحصاءات قدمت ⁸. وحددت هياكل الشعرية، وملامح من الزوائد والشعيرات الدموية كانت مرسومة باليد، مع وسم تصديرها لتحليل الصور. بينما الكتاب مناقشة المترتبة على نتائجها "شبكة الأوعية الدموية فيلوس المتزايد"، هذه الاستنتاجات إشكالية عندما فقط "مصطلح" (36 + الأسبوع الحملي العمر) درس الأنسجة. وبالمثل، مايو كلينيك etلام وبيرس et al. تعتمد على الأنسجة من نفس الفئة العمرية، لهذه المحاكاة لنقل الدم تدفق والأكسجين، ولكن تحليلاتها محدودة لمدة قليلة فقط، الزوائد الطرفية ^9،10 . كما طبق ستيريولوجي لدراسة هيكل السفن فيلوس. ولكن مرة أخرى، انصب التركيز عموما على الحمل فيما بعد تسليم الرضع قوبلن مع واحد أو أكثر الحمل مضاعفات ^11،12.

حتى وقت قريب، الفحص المجهري [كنفوكل] اقتصر على التصوير إلى أعماق الأنسجة من 100-200 ميكرون بسبب امتصاص إثارة والانبعاثات من الأسفار ب الأنسجة السطحية ¹³ . على الرغم من إزالة الأنسجة والأنسجة ثلاثية الأبعاد قد وصفت على نطاق واسع في الأدب، وهناك أساليب عديدة لانسجة تطهير العديد غير صالحة للاستخدام مع الأنسجة بشكل عام، كما أنهم لا رجعة فيه الضرر مورفولوجيا الخلوية من خلال هايبرهيدريشن لإزالة الدهون أو البروتينات. ولذلك، من غير الممكن للتحقق من أن هذه النتائج إرشادية للأنسجة نفسها ولا التحف من تجهيز بينما الأنسجة لدينا عملية مسح تقنية عكسها قادرة على التحقق من صحة ضد الأنسجة التقليدية. إزالة الأنسجة عموما ينطوي على إحدى الطرق الرئيسية الثلاث: 1) مطابقة موحدة للانكسار (RI) لمكونات الأنسجة بغمر في حلول مطابقة ري، الذي يزيل بعثرة الخفيفة التراكمية تسبب من لينسينج بسبب استمرار تقلب ري منخفضة (cytosol) ومكونات ري (بروتين/الدهون) عالية؛ 2) إزالة مكونات المادة الدهنية عن طريق التضمين في المائية واستخدام التفريد/نشر لإزالة مكونات الدهون؛ 3) توسيع هيكل البروتين للسماح بزيادة تغلغل المذيبات لتشجيع التوحيد ري ¹³/تمسخ. في حين أن هذه النهج يمكن أن تجعل الأنسجة شفافة وتسمح بتمثيل ثلاثي الأبعاد للمؤشرات الحيوية توليد، هذه تمثيلات ثلاثية الأبعاد ذات قيمة السريرية مشكوك فيها كما أنها تشكل تحديا لتحديد ما إذا كانت هذه الصور يدل على خصائص الأنسجة أو أنسجة تطهير العملية. من ناحية أخرى، نظراً للأنسجة لدينا مسح عكسها يمكن تطبيق معيار النسيجي و/أو إيمونوهيستوتشيميستري للنسيج نفسه تقييم ما إذا كانت التعديلات الهامة سريرياً.

تقدم هذه الدراسة تحليلاً لعينات فيلوس القاصي 47 التي تم الحصول عليها من إجمالي 23 سريرياً العادية والانتخابية إنهاء الحمل بين 9-23 إتمام أسبوعا من الحمل والشحنتين العادي المدى الكامل. وقد مكن الفلورة وسم تروفوبلست والجهاز إجراء تحليل كمي والآلي من تغييرات في شبكات الأوعية الدموية فيلوس وتعقيدها.

مع هذا البروتوكول، ونحن عزل وتحليل الزوائد الطرفية وشبكاتها الشعرية على نطاق لا يمكن سابقا. وسيحدد هذا النهج، عند تطبيقها على تطوير شبكة فيلوس والشعرية عبر الحمل تلك الخصائص التي هي الأساس لولادة طفل سليم. عند تطبيقها على دراسات لحالات الحمل معقدة، فإنه سيوضح أيضا عند وكيفية تعديل الأمراض المشيمية الأشجار فيلوس والشبكات الشعرية أنها غمد، وكيف هذه تؤثر على رفاه الجنين.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية لمعهد الدولة لنيويورك "البحوث الأساسية" في لجنة أخلاقيات البحوث البشرية العاهات الخلقية.

1. تشريح شجرة فيلوس

1. شطف الفورمالين الثابتة أنسجة المشيمة مع الفوسفات مصقول المالحة (PBS)¹⁴ لإزالة في الفورمالين ووضعه في طبق بتري في مرحلة مجهر التشريح. استخدام المبضع، والملقط غرامة لندف أنسجة المشيمة بعيداً لتحديد موقع الأشجار فيلوس (الهياكل المتفرعة ثريدليكي الأبيض). تشريح بقطعة من شجرة زغابة (طويلة عدة مم) ونقل الأنسجة PBS ~ 1 مل تحتوي على أنبوب الصغرى.

2. تلوين إيمونوفلوريسسينت

1. مع ماصة، إزالة برنامج تلفزيوني واستبدل ببرنامج تلفزيوني جديد. اسمحوا الوقوف لمدة 10 دقيقة مع دوامات عرضية. كرر مرة أخرى.
   ملاحظة: هذه الخطوة وكل الخطوات الأخرى تتم في درجة حرارة الغرفة فيما عدا الحضانة جسم الأولية.
2. استخدام ماصة، إزالة واستبدال برنامج تلفزيوني مع برنامج تلفزيوني 0.1% تريتون X100 + 2% الماعز المصل (برنامج تلفزيوني-تي-فئة الخدمات العامة) بيرميبيليزي الربط غير محددة الأنسجة وكتلة الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 30 دقيقة.
3. استبدال برنامج تلفزيوني-تي-ع مع برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل الماعز 2%، على حد سواء الماوس [مونوكلونل] مكافحة--CK7 وارنب المضادة-CK7.
   1. احتضان الأنسجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   2. إزالة الأجسام المضادة المتبقية بالغسيل مع برنامج تلفزيوني-فئة الخدمات العامة لمدة 10 دقائق مع دوامات عرضية.
   3. إزالة برنامج تلفزيوني-فئة الخدمات العامة، واستبدال مع برنامج تلفزيوني-فئة الخدمات العامة التي تحتوي على كلا الماعز الماوس المضادة مفتش مقرونا انبعاث الخضراء (520 nm) fluorophore والماعز الأرنب المضادة مفتش مقرونة انبعاث الأشعة تحت الحمراء (652 nm) فلوروفوري.
   4. قم بإزالة الأجسام المضادة بتكرار الخطوة 2، 1.
   5. تخزين الأنسجة إيمونولابيليد في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

3-توضيحاً للأنسجة

1. تغسل العينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في فترات بعد 10 دقائق.
2. يذوي الأنسجة عن طريق إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة والاستعاضة عنه بنسبة 50% إيثانول (يمكن استخدام الميثانول كذلك). احتضانها للحد الأدنى 10 استبدال طازجة 50% إيثانول واحتضانها للحد الأدنى 10 تكرار هذا مرة أخرى ليصبح مجموع إينكوبيشنز 3. كرر إينكوبيشنز مع 70%. ثم استبدال مع الإيثانول 100% واحتضان لمدة 15 دقيقة (بدلاً من الميثانول يمكن استخدامها).
3. مع ملقط غرامة ذات الرؤوس، نقل الأنسجة إلى أنبوب مايكرو جديدة تحتوي على ~ 1 مل الحل-1 ح 4.
4. مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس، نقل الأنسجة إلى طازجة اﻷنبوبية الصغيرة التي تحتوي على حل-2 ل ~ ح 4.
   ملاحظة: عند تخزينها في الظلام، الفلورة مستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 أشهر على الأقل.
5. لا تخلط مع أي محلول مائي، (مثل تصاعد المتوسطة) كما سيتم تطهير فقدت.

4-تصاعد للفحص المجهري

1. عدم تحميل الأنسجة بين شريحة زجاجية قياسية وساترة كما الأنسجة اللينة ومشوهة بسهولة.
2. يشير إلى الرقم 5ب وجبل الأنسجة في دائرة سايكس-مور على النحو التالي؛
   1. مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس مكان ساترة جولة 25-مم في الدائرة قاعدة.
   2. مع ملقط مقلوب غرامة مكان طوقا المطاط في القاعدة ساترة.
   3. مع ماصة مكان قطره (~ 40 ميكروليتر) الحل-2 في مركز ساترة.
   4. مع الملقط مقلوب غرامة نقل أنسجة قطعة من الحل-2 للهبوط في مركز ساترة.
   5. مكان ساترة ثانية على رأس طوقا.
   6. الموضوع قفل حلقة في الجزء العلوي من قاعدة ضغط كوفيرسليبس وطوقا حتى شركة.
      ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم المبالغة في تشديد أو سوف تتحطم ساترة.
   7. أدخل إبرة عيار 22 في منفذ على القاعدة، ومن خلال طوقا.
   8. ملء المحاقن 3 مل مع ~ 1.5 مل من الحل-2.
   9. جبل إبرة قياس 25 في المحاقن.
   10. أدخل إبرة حقنه بمنفذ المقابلة وعن طريق طوقا.
   11. التأكد من أن الجو في الغرفة هو التنفيس عن طريق الإبرة 25-قياس أخرى، حقن التعبئة 2and حل الدائرة بلطف.
   12. إزالة الإبر والمحاقن ووضع الدائرة على شريحة زجاجية كبيرة في مرحلة مجهر [كنفوكل].
3. وبدلاً من ذلك، قطع الآبار المخصصة من صفائح السيليكون PDMS.
   1. مع مقص قص 25.4 × 25.4 مم² قطعة من ورقة PDMS.
   2. مع مشرط قطع ~ 12.7 × 12.7 مم² جيدا في القطعة.
   3. اضغط القطعة بثبات إلى شريحة مجهر.
   4. سد البئر إلى الأعلى مع الحل-2.
   5. نقل قطعة النسيج من مايكرو-الأنبوبة إلى مركز البئر.
   6. مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس مكان ساترة على رأس البئر يكون الجزء السفلي من ساترة ترطب مع الحل-2.
   7. جبل الجمعية "سايكس مور الدائرة" مع الأنسجة في مرحلة مجهر [كنفوكل].

5-[كنفوكل] مجهرية

1. تجلب الأنسجة في الدائرة في التركيز مع هدف 10 x.
2. نقل مرحلة مجهر صعودا وهبوطاً من خلال المستوى البؤري لقياس المسافة بين أعلى وأسفل للأنسجة.
3. نقل المسرح في 2.5 ميكرون الخطوات لتجميع صورة [كنفوكل] ملف يحتوي على مجموعة من الصور عن طريق الأنسجة من أعلى إلى أسفل.

6-عكس تطهير

1. عكس تطهير بنقل الأنسجة الأنبوبة الصغيرة التي تحتوي على > 20 x حجم الإيثانول 100%. في ح 1 استبدال الفواصل مع الإيثانول 70%، ثم الإيثانول 50%، وأخيراً برنامج تلفزيوني. تخزين في 4 درجات مئوية في الظلام.
   ملاحظة: الآن عملية النسيج للتضمين القياسية البارافين، تقطيع وغذائها أو تلطيخ المناعية histochemical.

7-deconvolution

ملاحظة: للخطوات التالية، أوامر البرمجيات، وعلامات التبويب والقوائم المنسدلة بالخط المائل.

1. بدء تشغيل البرنامج deconvolution وفتح ملف الصورة.
2. أدخل المعلمات المسرودة في الإطار 'سامرص'.
   1. ل ' إدخالالمباعدة في فوكسل x و y و z الأبعاد في ميكرومتر.
   2. لكل قناة لون، حدد صبغة الفلورسنت التي تستخدم إيمونوستينينج من القائمة المنسدلة.
   3. 'طريقة'، حدد ليزر المسح [كنفوكل] من القائمة المنسدلة.
   4. 'الهدف عدسة، حدد 10 x من القائمة المنسدلة.
   5. '"المتوسطة الغمر"'، حدد الهواء من القائمة المنسدلة.
   6. انقر فوق 'تطبيق' زر.
3. انقر فوق علامة التبويب 'نديكونفولوتيو'.
4. انقر فوق '3D Deconvolution' في القائمة المنسدلة.
5. في '3D-Deconvolution' تأمين نافذة الإعدادات: 1) التكيف PSF المكفوفين، PSF 2) النظرية، 3) استخدام (الافتراضي PSF التكيفية، 10 تكرارات، الضوضاء المتوسطة)، واسم القاعدة 4).
6. انقر فوق 'زر التحقق الأخضر' بدء تشغيل البرنامج.
7. عند الانتهاء، كرر الخطوات-7.6 7.3 إعادة تشغيل البرنامج. عند الانتهاء من إعادة تشغيله للمرة الثالثة والأخيرة.
8. في 'إدارة البيانات' إطار، انقر على الملف مسبوقة ب "10-10-10-".
9. انقر فوق 'ملف' علامة التبويب، ثم انقر فوق 'حفظ باسم.
10. في إطار 'sحفظ أ' حدد '8 بت عدد صحيح غير موقعة' من '"نوع البيانات"' القائمة المنسدلة وانقر فوق على الحفظ.

8. معالجة الصورة

1. بدء تشغيل البرنامج فيجي.
   1. انقر فوق 'ملف'، انقر فوق 'مفتوحة' وحدد ملف الصورة ديكونفولفيد، وانقر فوق 'مفتوحة' زر في 'مفتوحة' نافذة.
   2. انقر فوق ' ملفالصورة/اللون/تقسيم قنوات وتحويل ألوان الصورة إلى ثلاثة ملفات جديدة تحتوي على لون واحد فقط. حفظ ملف الصورة الحمراء التي تحتوي على مجموعة الصور الشعرية فيلوس إيمونولابيليد. حذف ملفات الصور الخضراء والزرقاء.
   3. طرح fluorescence الخلفية من ملف صورة حمراء مع: 'خلفية عملية/استقطاع'.
   4. في القائمة المنسدلة تعيين نصف قطر الكرة المتداول بمقدار 10 بكسل.
   5. اترك الخيارات القائمة 4 دون رادع، وانقر فوق 'موافق'.
   6. انقر فوق 'نعم في القائمة"عملية مكدس الذاكرة المؤقتة".
   7. إزالة الأنسجة الكامنة الفلورية (أوتوفلوريسسينسي) عن طريق فتح 'الصورة/ضبط-السطوع' القائمة وضبط إعدادات الحد الأدنى والحد الأقصى، والسطوع والتباين. احرص على عدم إزالة أي من الفلورة الشعرية.
   8. تصغير المتبقية الأسفار غير ذي صلة بفتح 'الصورة/ضبط/عتبة' القائمة وضبط مربعات التمرير مثل أن يتم إبراز الفلورة الشعرية. تحقق من 'الخلفية المظلمة' مربع وانقر فوق 'تطبيق'. على 'تحويل إلى القائمة المنسدلة ثنائي' الاختيار القائمة 'خلفية سوداء' مربع وانقر فوق 'موافق'. حفظ ملف صورة بالأبيض والأسود (ثنائي) لتحليلات أدناه.

9-تحليل

1. عد الكائن وسكيليتونيزيشن.
   1. حدد ملف الصورة الثنائية التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.1.8.
   2. انقر فوق 'تحليل/OC 3D خيارات والاختيار فقط'حجم ' و'تخزين النتائج... ' مربعات القائمة المنسدلة. التأكد من أن مربع 'إظهار أرقام' غير محدد. انقر فوق 'موافق' زر.
   3. Cliجك في 'تحليل 3D كائنات العداد'. في القائمة المنسدلة، قم بتعيين '"تصفية الحجم": الحد الأدنى' إلى 5000. ضمان أن 'استبعاد الكائنات على حواف مربع غير محدد. تحقق من أن 'sالكائن، وإحصاءات و'ملخص ' يتم التحقق من مربعات. انقر فوق 'موافق' زر.
      ملاحظة: قد يستغرق هذا عدة دقائق اعتماداً على تكوين الكمبيوتر وحجم الملف.
   4. حفظ جدول الإحصاءات وملف مخطط الكائنات.
   5. حدد ملف مخطط الكائنات. انقر فوق 'سكيليتونيزي/الإضافات/هيكل عظمى 2D 3D' سكيليتونيزي الشبكة الشعرية في الملف الثنائي. انقر فوق 'ملف/حفظ باسم. حدد 'Tiff...' في القائمة المنسدلة. في حفظ كنافذة TIFF إضافة "سكيل-" إلى اسم ملف خريطة الكائن، وانقر فوق 'حفظ' زر.
   6. انقر فوق 'تحليل/الهيكل العظمى/تحليل هيكل عظمى 2D 3D'. قبول الإعدادات الافتراضية القائمة المنسدلة وانقر فوق 'موافق' زر. حفظ الجدول فرع 'المعلومات' ، ' جدولالنتائج ، وهما ملفات الإخراج (سكيل--الكائنات المسماة-الهياكل العظمية وهيكل عظمى معلم).

Results

اﻷداءات ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها من الشعيرات الدموية في مجموعات من الزوائد الطرفية في المشيمة البشرية من العمر الحملي 8 أسابيع للتسليم الأجل كانت تحسب كمجموعات فردية والعظمية لتحليل الشبكة. هي الوحدات الوظيفية للمشيمة (الشكل 1أ) الأشجار الزوائد التي هي امتداد لسفن السطح حيث أنها قد تغلغلت حمة المشيمة (الشكل 1ب، والموسع في ج 1). وكانت قطعة من الجزء الأعلى من شجرة تشريح (

Discussion

وأقر "المجلس استعراض المؤسسية" جمع الأنسجة فيلوس المشيمية للتثبيت الفورمالين من الانتخابية إنهاء الحمل. قبل الإجراءات التي أجريت، استعراضاً موجزاً للسجل الطبي أشار إلى سن الأمهات، التكافؤ، وأكد عدم وجود أي الطبية الأساسية (مثلارتفاع ضغط الدم، والسكري ومرض الذئبة) أو الجنين (الشذوذ الهيكلي أو الكروموسومات، كان أداء النمو غير طبيعي). تم تسمية ورقة البيانات وأي من العينات التي تم جمعها فقط مع "دراسة" معرف "." وهكذا، كانت جميع العينات إزالة الألغام التي تم تحديدها قبل أن تغادر في جناح التشغيل. وقد جمعت الزوائد المرا...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
فورمالديهايد 10٪ (وزن / حجم) في عازلة الفوسفات المائية	ماكرون للكيماويات الدقيقة	H-121-08	عامل تثبيت عام ، تركيبة جاهزة للاستخدام ، توخي الحذر لأن الأبخرة سامة
شفرات مشرط	ThermoFisher Scientific	08-916-5B رقم 11
مشرط	ThermoFisher Scientific	08-913-5
ملقط دقيق	خدمات	المجهر الإلكتروني78354-119
أنبوب دقيق (1.7 مل)	PGC Scientifics	505-201
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Sigma	D8537	PBS
ماصة	VWR	52947-948	يمكن التخلص منها ، ماصة نقل 3 مل
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	تمييع إلى 0.1٪ من مصل
الماعز	Gibco	16210-064	تمييع إلى 2٪ في محلول PBS
الماوس أحادي النسيلة المضاد ل ck7 الكيراتين 7 Ab-2 (استنساخ OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
الأرنب المضاد للجسم المضاد CD31	Abcam	ab28364
انبعاث أخضر (520 نانومتر) fluorochrome   ؛	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
انبعاث الأشعة تحت الحمراء (652 نانومتر) الفلوروكروم	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
كحول الإيثانول 200 دليل	111000200 Pharmco-Aaper		تمييع إلى تركيزات أقل باستخدام PBS حسب الحاجة
Solution-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers	BellCo Glass Inc.	P / N 1943-11111
إبرة قياس 25	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide يحتاج
إلى 3 مل حقنة	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD حقنة يمكن التخلص منها
صفائح السيليكون PDMS	McMaster-Carr	P / N 578T31
مجهر متحد البؤر	Nikon Inc.		نيكون C1 المجهر متحد البؤر
البرمجيات Deconvolution	وسائل الإعلام Cybernetics		AutoQuant X22
فيجي برامج			معالجة الصور مجانا, مفتوح المصدر  البرمجيات المتاحة في https://fiji.sc
Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	المكون 1 من SelecTech H& نظام تلطيخ E
Eosin	Leica Biosystems	الكحولي 3801615	المكون 2 من SelecTech H& نظام تلطيخ E
Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	المكون 3 من SelecTech H& نظام التلوين E
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	المكون 4 من SelecTech H& نظام تلطيخ
E نظام الكشف عن الكيمياء المناعية	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	نظام الكشف عن الكموم UltraVision HRP DAB