Method Article

بيرفوسابل شبكة الأوعية الدموية مع نموذج أنسجة في جهاز موائع جزيئية

DOI:

10.3791/57242

⸱

April 4th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Micro Engineering, Kyoto University, 2Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول يصف كيفية مهندس شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في كروي. هو استنباط المكروية المحيطة كروي للحث على الأوعية والاتصال كروي ميكروتشانيلس في جهاز موائع جزيئية. الأسلوب يسمح نضح كروي، وأسلوب الذي طال انتظاره في الثقافات ثلاثي الأبعاد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كروي (إجمالي متعددة الخلايا) يعتبر نموذجا جيدا للأنسجة الحية في جسم الإنسان. وعلى الرغم من التقدم الكبير في الثقافات كروي، تظل شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في الماغنيسيوم تحديا حاسما للثقافة الطويلة الأجل اللازمة لصيانة وتطوير وظائفها، مثل التعبيرات البروتين و morphogenesis. ويقدم البروتوكول بطريقة جديدة لدمج شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل داخل كروي في جهاز موائع جزيئية. للحث على شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في كروي، تسترشد براعم الأوعية متصلة ميكروتشانيلس إلى كروي باستخدام عوامل الأوعية من الليفية الرئة البشرية المستزرعة في كروي. براعم الأوعية بلغ كروي، اندمجت مع خلايا البطانية مثقف شارك في كروي، وشكلت شبكة الأوعية الدموية مستمرة. ويمكن أن نتخلل شبكة الأوعية الدموية الداخلية كروي دون أي تسرب. يمكن استخدام شبكة الأوعية الدموية شيدت كذلك كطريق للإمداد بالمواد المغذية، وإزالة النفايات، ومحاكاة دوران الدم في الجسم الحي. الأسلوب الذي يوفر منصة جديدة في ثقافة كروي نحو خلاصة أفضل من الأنسجة الحية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحول من ثقافة (ثنائي الأبعاد) أحادي الطبقة إلى ثقافة ثلاثي الأبعاد هو بدافع الحاجة إلى العمل مع نماذج الثقافة التي تحاكي مهام الخلوية الحية الأنسجة1،،من23. ركائز بلاستيكية مسطحة والصلب يشيع استخدامها في خلية ثقافة لا يشبه معظم بيئات خارج الخلية في جسم الإنسان. وفي الواقع، تبين العديد من الدراسات أن هندسة الأنسجة على حدة إعادة إنشاء ثقافة ثلاثي الأبعاد والرموز الميكانيكية والكيميائية الحيوية والاتصالات خلية خلية، التي لم تحترم في الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد4، 5،6،،من78.

الكلية متعددة الخلايا أو كروي، واحد من التقنيات الواعدة لتحقيق هذه الثقافة ثلاثي الأبعاد9،10. خلايا تفرز المصفوفة خارج الخلية (ECM)، ويمكن أن تتفاعل مع الآخرين في كروي. على الرغم من أن بعض الهندسة الحيوية الأخرى النهج11،12،،من1314، مثل خلية التراص، بنجاح إجراء نسخ متماثل تعقيد المكانية للجسم البشري، وهذه النهج فقط اثنين أو ثلاثة أنواع الخلايا لسهولة التحليل والتركيز على وظيفة واحدة فقط من الأجهزة المستهدفة. على النقيض من ذلك، يتعرض لبيئات ثقافة مختلفة اعتماداً على مواقعها في كروي بسبب العرض غير متجانسة من المواد المغذية والأكسجين، وباراكريني و autocrine إشارات الجزيئات في كروي الخلايا في الماغنيسيوم. هذه الميزة من الماغنيسيوم يحاكي جزئيا في فيفو شرط الثقافة وتمكين الخلايا في الماغنيسيوم لإنشاء أنسجة أكثر تعقيداً بكثير، وتنظيم هيكل في المختبر من تلك المزروعة في التراص الأنسجة9، 15 , 16-لاحظ أن وظيفة الخلايا في كروي ليست موحدة بسبب البيئة غير متجانسة في كروي إذا كروي يتكون من نوع واحد من الخلايا،. في السنوات القليلة الماضية، يسمح الثقافات كروي الخلايا الجذعية pluripotent الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا)، التي يسببها (إيبسكس) أو الخلايا الجذعية المقيم في الأنسجة تقليد في فيفو متواليات الإنمائية وإعادة إنشاء أجهزة مصغرة مثل الدماغ17، الكبد18والكلى19،20.

وعلى الرغم من التقدم الكبير في تقنيات ثقافة كروي، استزراع الماغنيسيوم كبيرة لفترة طويلة لا يزال يمثل مشكلة. في نسيج ثلاثي الأبعاد، تحتاج الخلايا يكون مقره داخل 150-200 ميكرون من الأوعية الدموية بسبب العرض المحدود من الأوكسجين والمواد المغذية21. شبكات الأوعية الدموية داخل كروي ضرورية لإيجاز تبادل المواد بين الدم والأنسجة في الجسم الحي. ولتحقيق ذلك، شارك مثقف خلايا بطانية مع هدف خلايا22،،من2324 المجموعات الأخرى أو الناجمين عن التفريق بين الخلايا pluripotent في CD31-إيجابية الخلايا20. ومع ذلك، لا تملك هياكل شبيهة بسفينة المبلغ عنها نهايات مفتوحة لومينا إمدادات الأوكسجين والمواد المغذية إلى مركز كروي. لتقليد دور الأوعية الدموية لتغذية الخلايا في ثقافة ثلاثي الأبعاد، يجب تطوير شبكة الأوعية الدموية مفتوحة وبيرفوسابل في كروي.

وخلال السنوات القليلة الماضية، ذكرت بعض المجموعات البحثية في ميدان ميكرونجينيرينج أساليب بناء شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل، تشكلت عفويا في جهاز موائع جزيئية باستخدام عوامل الأوعية من الخلايا كوكولتوريد تنتجها الخلايا الليفية25 ،26. هذه الشبكات والأوعية الدموية مورفولوجيا مماثلة لنظرائهم في فيفو ويمكن تشكيلها بالعوامل البيئية، وجعلها مناسبة لمحاكاة وظائف الأوعية الدموية في ثقافة كروي. والغرض من هذا البروتوكول بناء شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في كروي استخدام منصة موائع جزيئية27. يتم تعديل الجهاز موائع جزيئية من الجهاز تم الإبلاغ عنها سابقا25 حيث يمكن إدراجها كروي. طريق توجيه إفراز الأوعية من الخلايا تنتجها الخلايا الليفية في كروي إلى خلايا بطانية في ميكروتشانيلس، براعم من ميكروتشانيلس أناستوموسيد مع كروي الأوعية وشكلت شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل. هذا الأسلوب يسمح تسليم مباشر لمجموعة واسعة من المواد، مثل الجزيئات الفلورسنت والخرز مقياس ميكرومتر في المناطق الداخلية من كروي، الذي يوفر الإطار لثقافة الأنسجة الطويلة الأمد مع شبكات الأوعية الدموية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تلفيق العفن الجهاز موائع جزيئية

  1. تصميم نمط الجهاز موائع جزيئية باستخدام البرمجيات المتاحة تجارياً (Clewin5 أو 2016 أوتوكاد، إلخ.). للحصول على وظيفة Clewin5، راجع دليل المستخدم (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
    ملاحظة: يتوفر ملف التصميم في التكميلية الملف 1.
  2. قم بنقل ملف تصميم لمولد نمط مايكرو وتحميل الأداة مع قناع كروم مغلفة بمقاوم الضوء الإيجابية.
  3. كشف مقاوم الضوء الإيجابية في مجال نمط استخدام مولد نمط مايكرو.
  4. وضع الواقي الضوئي إيجابيا باستخدام المطور (جدول المواد) وشطف القناع بالمياه (دي).
  5. استخدام تنميش الكروم (جدول المواد)، أحفر الكروم في منطقة مكشوفة حيث تمت إزالة الواقي الضوئي إيجابية. شطف القناع بالماء دي.
  6. إزالة المتبقية مقاوم الضوء على قناع باستخدام الأسيتون.
    ملاحظة: قناع الشفافية يمكن أن تكون بديلاً لقناع Cr.
  7. تعد رقاقة سيليكون نظيفة (4 بوصة، و P(100))، وتدور معطف هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  8. سوفتباكي همدس لمدة 5 دقائق في 120 درجة مئوية وباردة الرقاقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. سبينكوات مقاوم الضوء السلبية (جدول المواد) في 500 لفة في الدقيقة ل 10 s و 1,200 لفة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: حالة طلاء تدور ينبغي أن تسفر عن الطبقات مقاوم الضوء مع سماكة حوالي 100 ميكرومتر في الرقائق بعد الطباعة التصويرية.
  10. بريبكي مقاوم الضوء السلبية لمدة 45 دقيقة في 95 درجة مئوية وباردة ويفر لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. تحقق من شدة الضوء الأشعة فوق البنفسجية في كل تجربة وحساب وقت التعرض لجرعة تعرض إجمالي الطاقة في 250 ميغاواط/سم2. ضع النبائط (الخطوة 1، 1، 1-6) على يفر وتعرضها لضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  12. بوستباكي مقاوم الضوء السلبية لمدة 1 دقيقة عند 65 درجة مئوية و 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. السماح ليفر تهدئة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  13. وضع الطبقة مقاوم الضوء السلبية لمدة 15 دقيقة في حمام المطور (جدول المواد) الأولى و 2 دقيقة في الحمام الثاني. شطف يفر في حمام الايزوبروبانول (IPA) أول 10 s وفي حمام أصد الثانية لمدة 10 ق.
  14. هاردباكي مقاوم الضوء السلبية لمدة 30 دقيقة في 200 درجة مئوية وباردة الرقاقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  15. قياس سمك طبقة سلبي مقاوم الضوء باستخدام التعريف سطحية.
  16. مكان يفر في مجفف متصلاً بمضخة فراغ وإضافة 200 ميليلتر من silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). قم بتشغيل المضخة لمدة 10 دقائق، ثم إيقاف تشغيله والحفاظ يفر في مجففة ح 4.

2-الخطوات تصنيع وتجميع طبقات PDMS

  1. يلقي البوليمر بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) قبل (قاعدة PDMS: علاج عامل = 10:1 (w/w)) وديغا في فراغ غرفة ح 2.
  2. علاج PDMS عند 80 درجة مئوية في فرن تنفيس الهواء بين عشية وضحاها.
  3. تقشر PDMS من رقاقة السيليكون.
  4. لكمه ثقوب 1A-3B (الشكل 1) وثقافة كروي جيدا. استخدام لكمه قطرها 2 مم الثقوب 1A--3B، ويبلغ قطرها 1 ملم لكمه كروي جيد.
  5. تنظيف لوح PDMS وزلة غطاء زجاج (24 ملم × 24 مم) مع شريط لاصق، مرارا وتكرارا الشائكة وتقشير قبالة الشريط. ثم علاج لوح PDMS مع الهواء بلازما 40 s (40 ميغاواط، 50 sccm).
  6. السندات لوح PDMS على كشف غطاء الزجاج بطرد أي فقاعات الهواء من السطح بين لوح PDMS وكشف الغطاء وعلاج عند 80 درجة مئوية على الأقل 12 ح.

3. إعداد كروي

ملاحظة: في الدراسة، والبروتين الفلورسنت الأحمر الإعراب عن السرة البشرية الوريد خلايا بطانية (RFP-هوفيكس) وإذ تعرب عن البروتينات الفلورية الخضراء هوفيكس (التجارة والنقل-هوفيكس) تستخدم في كروي وميكروتشانيلس، على التوالي، للتمييز بين أصل هوفيكس بعد تشييد شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل. إذا ليس هناك حاجة إلى أصل هوفيكس، هوفيكس غير مسمى بما فيه الكفاية للتجربة.

  1. ذوبان الجليد في طلب تقديم العروض-هوفيكس (3.0 × 105 خلايا/فيال) والرئة البشرية تنتجها الخلايا الليفية (حلف) (6 × 10 1.0 خلايا/فيال) وإضافتها إلى 10 مل متوسطة لخلايا تنتجها الخلايا الليفية، وخلايا بطانية على التوالي (جدول المواد). الثقافة لهم في طبق 100 ملم في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 2-3 أيام دون المتلاقية RFP-هوفيكس وهلفس. وسيؤدي هذا الإعداد الماغنيسيوم ~ 200.
  2. فصل في طلب تقديم العروض-هوفيكس وهلفس من الأطباق مع 2 مل من 0.05% التربسين-يدتا والتوقف عن رد فعل التربسين مع 4 مل دميم المحتوية على مصل الدم البقري الجنين 10% (v/v) (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1% (v/v).
  3. بعد الطرد المركزي في ز x 220 لمدة 3 دقائق، إزالة المادة طافية، وريسوسبيند بطلب تقديم العروض-هوفيكس وهلفس في المتوسط بطانية إلى تركيزات الخلية النهائية عند 2.5 × 104 و 1.0 × 105 خلايا/مل، على التوالي.
  4. بلطف إضافة 200 ميليلتر من تعليق خلية (خلايا 5,000 لطلب تقديم العروض-هوفيكس) وخلايا 20,000 هلفس كل بئر في صفيحة 96-جيدا مع سطح ملزمة منخفضة للغاية.
  5. احتضان لوحة 96-جيدا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 2-4 أيام.
    ملاحظة: نظراً للقطر كروي يعتمد على الفترة الثقافة وعدد الخلايا الأولية في لوحة 96، حسنا، فإنه يمكن التحكم بهذين المعيارين.

4-خلية البذر في الجهاز موائع جزيئية

ملاحظة: اصطلاح تسمية الثقوب والقنوات وكروي جيدا وأثبتت في الشكل 1. نحدد اليوم 0 يوما عند الانتهاء من حصاد خلية في الجهاز موائع جزيئية. ويرد في الشكل 2التخطيطي للجداول الزمنية التجريبية.

  1. تحميل كروي 1 يوم)
    ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوة التالية على الجليد لمنع جيليشن من الكولاجين وألياف.
    1. حل الفيبرينوجين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتركيز نهائي 2.80 ملغ/مل.
    2. إعداد الكولاجين معادلتها (3.0 مغ/مل في برنامج تلفزيوني) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    3. تجمع ميليلتر 107.2 الفيبرينوجين الحل (2.80 مغ/مل) وميليلتر 8.0 معادلتها الكولاجين (3.0 مغ/مل) و 3.6 ميليلتر من أبروتينين (5 U/mL) كل فعل في أنبوب. هذا الحل هو المسمى "الحل مزيج الرئيسي" (مللي ثانية).
      ملاحظة: الحجم ما يكفي لتحميل كروي واحد. إذا كان هناك أكثر من واحد كروي، مضاعفة حجم كل عدد من الماغنيسيوم.
    4. حل ثرومبين في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 50 يو/مليلتر.
      ملاحظة: مختبرين من 50 ثرومبين يو/مليلتر (20 ميليلتر في الأنبوب) يتم تخزينها في −30 درجة مئوية وهي إذابة قبل كل تجربة.
    5. ضع لوحة 96-جيدا التي تحتوي على الماغنيسيوم داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
    6. إعداد أطباق بتري 35 ملم اثنين داخل مجلس الوزراء، مع صحن واحد على الجليد (طبق 1) وطبق أخرى في benchtop (طبق 2) السلامة الأحيائية. بيبيت 99 ميليلتر من مرض التصلب العصبي المتعدد في وسط صحن 1 (الشكل 3a) تشكل معالجة تجميعية.
    7. تقليم نصائح 2 أصفر (10-100 ميليلتر) ومسح 3 نصائح ماصة (1-100 ميليلتر) لجمع الماغنيسيوم من لوحة 96، حسنا، خلط ثرومبين مع مرض التصلب العصبي المتعدد، مجموعة دقيقة من الماغنيسيوم، حقن الماغنيسيوم في الجهاز، وحقن الوسائط في الجهاز ، على التوالي. يجب أن يكون حجم المسام من الطرف أكبر قليلاً من القطر من ثقوب 1A-3B القنوات 1 و 3 أو تناسب كروي جيدا في القناة 2 دافئ.
      ملاحظة: فيما يلي، ما لم يذكر خلاف ذلك، استخدم التلميحات ماصة قص في هذه الخطوة. تتوفر صورة نصائح قطع في الشكل 4.
    8. جمع كروي مع 100 ميليلتر من المتوسطة من لوحة 96-جيدا وإضافتها إلى طبق 2 (الشكل 3a).
    9. التقاط كروي بحجم الحد الأدنى من وسائل الإعلام من صحن 2. أثناء الضغط بيبيتور تستقيم، كروي ينبغي التحرك نحو الجزء السفلي من طرف بيبيت بالجاذبية. إخراج كروي بلمس طرف بيبيت على غضروف الحبرية مرض التصلب العصبي المتعدد في صحن 1 (الشكل 3a).
      ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات التالية 4.1.10 و 4.1.11 بسرعة.
    10. إضافة 1 ميليلتر من ثرومبين (50 U/mL) وتخلط بلطف مع تلميح بيبيت الأصفر.
    11. مع ماصة تعيين إلى 7 ميليلتر، تلتقط كروي ووضعه ببطء في البئر كروي (الشكل 3b).
    12. احتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية جيليشن الفيبرين.
    13. حقن ببطء المتوسطة غشائي من ثقوب 1A و 3A وملء القنوات 1 و 3 مع وسائل الإعلام (20 ~ 30 ميليلتر/القناة).
    14. ضع الجهاز في طبق 100 ملم مع كيمويبي رطب لمنع تبخر وسائط من الجهاز (الشكل 3 ج).
    15. ضع الجهاز في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة لإزالة الفقاعات في التفاعل بين وسائط الإعلام وفيبرينوجين.
  2. هوفيكس يوم 0) تحميل
    1. ذوبان الجليد بروتينات فلورية خضراء-هوفيكس (3.0 × 105 خلايا/فيال) وإضافتها إلى 10 مل الوسط بطانية. الثقافة لهم في طبق 100 ملم في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 2-3 أيام للوصول إلى كونفلوينسي الفرعية. صحن واحد من هوفيكس التجارة والنقل الفرعي المتلاقية ما يكفي لإعداد الأجهزة 8-10.
    2. فصل بروتينات فلورية خضراء-هوفيكس من الأطباق مع 2 مل من 0.05% التربسين-يدتا والتوقف عن رد فعل التربسين مع 4 مل دميم المحتوية على مصل الدم البقري الجنين 10% (v/v) (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1% (v/v).
    3. بعد الطرد المركزي في ز x 220 لمدة 3 دقائق، ريسوسبيند التجارة والنقل-هوفيكس في المتوسط غشائي في 5.0 × 106 خلايا/مل.
    4. حقن هوفيكس تعليق خلية في القناة الأولى من خلال ثقب 1B (20 ميليلتر في القناة).
    5. إمالة الجهاز موائع جزيئية 90°، ووضعه على الجانب واحتضان في 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة التأكد من أن هوفيكس تلتزم فيبرينوجين في القناة الثانية.
      1. تأكيد تمسك هوفيكس على فيبرينوجين. عند عدد هوفيكس التي تعلق في الواجهة بين جل والمتوسطة ليست كافية، قد قطع المفرج في جذر الأوعية الدموية بعد أيام قليلة من جهاز الثقافة (الشكل 5). في البروتوكول، ومعدل نجاح نضح > 50%.
    6. كرر الخطوتين 4-2-4 و 4.2.5 للقناة 3.
    7. خلايا الثقافة في طبق 100 ملم مع كيمويبي رطبة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 7-14 يوما.
  3. 1 اليوم ~) تبادل الوسائط
    1. تبادل نصف وسائل الإعلام في القنوات 1 و 3 كل يوم.

5-نوى تلطيخ

  1. إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني.
  2. قم بإزالة الوسائط من القنوات 1 و 3 وإضافة ميليلتر 20% 4 منهاج العمل كل قناة. ليحل محل الحل في 4% منهاج عمل بيجين، وتكرار إزالة الحل من الجهاز وإضافة 4% منهاج العمل ثلاث مرات.
  3. احتضان الجهاز عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. إزالة 4% منهاج العمل من الجهاز وغسل قنوات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. إضافة 20 ميليلتر من 10 ميكروغرام/مل صبغة الفلورسنت (جدول المواد) كل قناة وصمة عار النواة الخلوية. تبادل الحل في الجهاز، كرر إزالة الحل من الجهاز وإضافة 10 ميكروغرام/مل صبغة الفلورسنت ثلاث مرات.
  6. تخزين الجهاز في 4 درجات مئوية عن 24 ساعة.

6-السوائل نضح من كروي

  1. إعداد كروي بعد استزراع أكثر من 7 أيام في الجهاز على 37 درجة مئوية و 5% CO2 لاستكمال مسار الأوعية الدموية المستمرة.
  2. إزالة المتوسطة من ثقوب 1A، 1B، 3A و 3B.
  3. إدخال 10 ميليلتر من 10 ميكرون حل fluorescein isothiocyanate (فيتك)-ديكستران في برنامج تلفزيوني في الثقوب 1A و 1B.
  4. رصد تدفق ميكروبيدس أو صبغ فيتك تحت مجهر مقلوب.

7-التحديد الكمي لطول برعم

ملاحظة: يتم استخدام البرمجيات 1.49 ver. إيماجيج لكل من تحليل الصورة في هذه الدراسة.

  1. وتتداخل صور أيام التجارة والنقل-هوفيكس 0، 1، 3، 5 و 7.
  2. طرح موقف نصيحة المفرج اليوم 0 من نفس الموضع في الصور التي التقطت في أيام 1 و 3, 5 و 7.
  3. تحديد نمو الأوعية الدموية غيض من موقف الجذر (الشكل 6). تم تعريف المسافة بين الحافة والأوعية الدموية والجذر كطول تنبت في هذه الدراسة (الشكل 7).

8-التحديد الكمي لزوايا الأوعية الدموية

ملاحظة: تم تعريف زاوية الأوعية الدموية كالزاوية تتألف من زاوية الأوعية الدموية والجذر ومركز كروي (الشكل 7 ج).

  1. بيناريزي صور الفلورسنت كروي كوكولتوري التي تحتوي على طلب تقديم العروض-هوفيكس وقياس موقف "centroid" بوظيفة التحليل في إيماجيج. في هذه الدراسة، يتم تعريف موقف مدروس "centroid" كمركز كروي (الشكل 6).
  2. تحديد موضع نصائح الأوعية الدموية والجذور بنفس الطريقة في الخطوة 7.
  3. قياس الزوايا والأوعية الدموية باستخدام وظيفة التحليل في برنامج إيماجيج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 التصميم والصور من الجهاز موائع جزيئية. ويضم ثلاث قنوات موازية، في القناة التي يتضمن 2 كروي جيدا. تستخدم القنوات 1 و 3 لثقافة هوفيك والقناة 2 كروي. يتم فصل كل قناة microposts المنحرف مصممة على نمط PDMS. Microposts الحيلولة دون تسرب إلى القنوات 1 و 3 من التوتر السطحي المائية في القناة 2 والسماح بتبادل المواد بين كروي وهوفيكس في ميكروتشانيلس28.

يبين

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر التقارير السابقة أن تفرز هلفس مزيج من عدة عوامل الأوعية، مثل أنجيوبويتين-1، أنجيوجينين، وعامل النمو تتمثل، تحويل عامل النمو-α وعامل نخر الورم وبعض المصفوفة خارج الخلية البروتينات29، 30. يعتمد هذا التحليل على إفراز الأوعية من هلفس في كروي كوكولتوري، وهو الحد من هذه التقنية. ولذلك، من الأهمية بمكان لتشكيل الأوعية الدموية مستقرة تعيين كروي كوكولتوري في قاع بئر بحيث يمكن أن تختصر المسافة بين كروي كوكولتوري وهوفيكس في القنوات 1 و 3. وكان طول الأوعية الدموية من ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن مقدم البلاغ أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل كان يدعمها كريست JST (رقم المنحة JPMJCR14W4)، المجتمع لتعزيز للعلوم (JSPS) كاكينهي (رقم المنحة 25600060، 16386 ك 16)، "مركز برنامج الابتكار" من يأمرون و JST، "ركز المشروع" على "تطوير التكنولوجيا التقييم الرئيسية" من اليابان وكالة التنمية، AMED، مؤسسة ميزوهو للنهوض بالعلوم والبحوث الطبية. وأيد ميكروفابريكيشن "مركز تكنولوجيا النانو جامعة كيوتو".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أوتوكاد 2017أوتوديسكأوتوكاد 2017
قناع كروم مطلي ب AZP 1350.تقنية السطحالنظيف CBL2506Bu-AZP
مولد النمط الصغيرهايدلبرغuPG101
MF CD-26 مطورRohm و haas للمواد الإلكترونية-مطور في البروتوكول 1.4
S-CleanSasaki ChemicalS-24حفر الكروم في البروتوكول 1.5
AcetonWako012-00343
رقاقة السيليكونCanosisSiJ-4
Spin CoaterMIKASA1H-D7
Hexamethyldisilazane (HMDS)طوكيو Ohka KogyoH0089
SU-8 3050MicroChem-Negativeمقاوم للضوء في بروتوكول 1.9
التعرض للأشعة فوق البنفسجيةNanometric Technology IncLA310s
SU-8 DeveloperMicroChemY020100مطور لمقاومة الضوء السلبية في البروتوكول 1.13
2-propanolWako163-04841
ملف تعريف السطحVeecoVeeco Dektak XT-S
(Trichloro (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane Sigma448931
Polydimethylsiloxane (PDMS) DowCorning Toray184W / C
Biopsy Punch (1.0mm)   ؛كاي إندستريزBP-10F
خزعة لكمة (2.0 مم)  كاي إندستريزBP-20F
نظام البلازمافيمتو ساينسكوفانس
غطاء زجاجيماتسونامي زجاجC024241
أطباق ثقافةIwaki1000-035
RFP يعبر عن الخلية البطانية الوريدية السرية البشريةالخلايا الوعائية البروتينيةcAP-0001RFP
الخلايا الليفية الرئة البشريةالطبيعية لونزاCC-2512
الخلايا البطانية المتوسطةLonzaCC-3162
مجموعات وسائط نمو الخلايا الليفيةLonzaCC-3132
DMEMThermo Fisher Scientific11965092
مصل الأبقارالجنيني ثيرمو فيشر 26140079
البنسلين الستربتومايسين محلولواكو168-23191
0.05 واط / حجم ٪ التربسين -0.53 مليمول / لتر EDTA & محلول 4Na مع الفينول الأحمرواكو204-16935
PBS (أملاح الفوسفات)تاكارا بيوT900
96 بئر لوحةسوميتومو الباكليت631-21031
1000ul رقاقةNIPPON GeneticsFG-402
200ul & nbsp ؛ رقاقةNIPPON GeneticsFG-301
10ul رقاقةNIPPON Genetics37650
CO2< / sub> حاضنةThermo Fisher النموذج العلمي370
GFP تعبر عن الخلية البطانية الوريدية السرية البشريةAngio ProteomiecAP-0001GFP
Fibrinogen من بلازما البقرSigmaF8630
البروتينين من رئة البقرSigmaA6279
الكولاجين ICorning354236
Thrombin من بلازما البقرSigmaT4648
Hoechst 33342InvitrogenH21492صبغة الفلورسنت لتلطيخ النوى في البروتوكول 5.5
محلول بارافورمالدهايدواكو163-25983
مجهر مضان مقلوبكاميرا CCD DEGITAL OLYMPUS
ORCA-R2
مجهر بيولوجي للمسح بالليزرمتحد البؤر أوليمبوسFV1000
مجهر مضان مقلوبأوليمبوسIX-83
فلوريسين إيزوثيوسيانات-ديكسترانسيجماFD70S
نمو

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
  5. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  6. Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
  8. Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  11. Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
  12. Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  17. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373(2013).
  18. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481(2013).
  19. Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  20. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  21. Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
  22. Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
  23. Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
  24. Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
  25. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  26. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  27. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  28. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  29. Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513(2013).
  30. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  31. Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
  32. Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
  33. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Perfusable Vascular NetworkMicrofluidic DeviceSpheroid CultureAngiogenic SproutsEndothelial CellsPDMS SlabFibrin GelHUVEC LoadingVascular AnastomosisFITC Dextran Perfusion

Related Articles