يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المؤتلف الكولاجين أنا ميكروكاريرس الببتيد لتوسيع الخلية وإمكانية استخدامها كنظام إيصال خلية في مفاعل حيوي نموذج

7.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57363

⸱

فبراير 7, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

في هذه المقالة

ملخص

ونقترح وضع بروتوكول توسيع خلية على ميكروكاريرس ماكروبوروس واستخدامها كنظام التسليم بمفاعل حيوي نضح البذور مصفوفة أنسجة ديسيلولاريزيد. نحن تشمل أيضا تقنيات مختلفة لتحديد انتشار الخلايا وقدرتها على البقاء للخلايا المزروعة في ميكروكاريرس. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر وظيفة الخلايا بعد الثقافات مفاعل حيوي.

الملخص

هندسة الأنسجة حقل واعدة، ركزت على وضع حلول لزيادة الطلب على الأنسجة والأعضاء فيما يتعلق بأغراض الزرع. عملية لتوليد مثل هذه الأنسجة معقد، ويشمل مجموعة مناسبة من أنواع الخلايا المحددة والسقالات والمنبهات الفيزيائية أو الكيميائية الحيوية لتوجيه نمو الخلايا وتمايزها. ميكروكاريرس تمثل أداة جذابة لتوسيع نطاق الخلايا في المكروية (3D) ثلاثي الأبعاد، نظراً لأنها توفر أعلى سطح لنسب حجم وتقليد أكثر عن كثب الوضع في فيفو مقارنة بالأساليب التقليدية ثنائية الأبعاد. الأوعية الدموية، توفير الأوكسجين والمغذيات إلى الخلايا، وضمان التخلص من النفايات، يشكل لبنة هامة عند توليد هندسة الأنسجة. في الواقع، تفشل معظم ثوابت بعد يتم زرعها بسبب تفتقر إلى دعم الأوعية الدموية. في هذه الدراسة، نقدم على بروتوكول لتوسيع نطاق الخلية البطانية على المؤتلف ميكروكاريرس المستندة إلى الكولاجين تحت ظروف ديناميكية في قارورة غزل والمفاعلات الحيوية، ونشرح كيفية تحديد في هذا الإعداد خلية السلامة والأداء الوظيفي. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقترح أسلوب لإيصال خلية لأغراض الأوعية الدموية دون كتيبة إضافية الخطوات اللازمة. وعلاوة على ذلك، نحن نقدم استراتيجية لتقييم الأوعية الدموية خلية المحتملة في مفاعل حيوي التروية في مصفوفة بيولوجية ديسيلولاريزيد. ونحن نعتقد أن استخدام أساليب عرض يمكن أن يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة تستند إلى خلية لمجموعة كبيرة من الأنسجة هندسة تطبيقات في الممارسة السريرية.

المقدمة

مشكلة عامة في تطبيقات هندسة الأنسجة تسفر عن كتلة خلايا عالية مع النمط الظاهري التفريق الصحيح في الموقع لحاجة. وبدأ تطبيق ميكروكاريرس لمعالجة هذه المسألة في عام 1967 مع تزايد أهمية حتى الآن في مجالات مثل هندسة الأنسجة العظام لجيل على نطاق واسع للجلد والعظام والغضاريف والاوتار1. يسمحون بالتعامل مع ثقافات ملتصقة بطرق مماثلة لتلك الثقافات تعليق2 بتوسيع نطاق الخلايا في عبارة ثلاثية الأبعاد (3D) ركائز. وبالتالي تجربة الخلايا على إمدادات المواد الغذائية متجانسة وتفاعلات الخلية-مصفوفة أن تؤدي إلى تحسين صيانة في فيفو3،4 التمايز الذي كثيرا ما تفقد على مر الزمن في 2D النهج5. نسبة السطح إلى الحجم أعلى-مما يؤدي في النهاية الخلية أعلى غلة6،7، ارتفاع الغاز والمغذيات أسعار الصرف مقارنة بنظم ثابتة8، إمكانية تنظيم ورهنا بالثقافة البدنية المحفزات9، والقدرة على الارتقاء بعملية التوسع في7 هي زيادة المزايا. العديد من الميزات مثل القطر، وكثافة، المسامية، تهمة السطحية، والتصاق خصائص10،11 التمييز المختلفة المتاحة تجارياً الصغرى-والكلى-الناقلين. ومع ذلك، واحدة من الميزة الرئيسية هو إيصالها المحتملة ميكروتيسويس للموقع عيب أو الطلب.

لتطبيقات التكنولوجيا ميكروكارير في هندسة الأنسجة العظام، ونحن يتضح في تقرير سابق12 الإنتاج ميكروكارير جديدة نوع تشكل الكولاجين المؤتلف أنا الببتيد (الحزب الشيوعي الثوري، المتاحة تجارياً سيلنيست). يسمح هذا ميكروكارير الجديدة GMP متوافقة مع زيادة حجم الإنتاج سقالة والخلية، حسب الحاجة لإيصال خلية في سيناريو سريرية. وفي هذا السياق، ضبط الاستقرار سقالة ومعدل التدهور، والخصائص السطحية من خلال الاختيار السليم لوضع استراتيجية مناسبة crosslinking يسمح بتكييف هذه التقنية للتطبيق المحدد أو خلية نوع من الفائدة أو استهداف الأنسجة13. على وجه الخصوص، العمالة المحتملة لهذا ميكروكارير كنظام توصيل خلية القابلة لحقن للتطبيق العلاجي14 يجعلها مثيرة للاهتمام لا سيما في إعداد سريرية.

في هذه الورقة، ونحن لذلك توضيح تثقيف إجراءات العزل وتوسيع البشرية المشتقة من نخاع العظم stromal الخلايا الوسيطة (هبمسكس) والجلد microvascular غشائي الخلايا البشرية (هدميكس) في المؤتلف الكولاجين-أنا-تعتمد على أساس الببتيد ميكروكاريرس، وإعدادها للتسليم في إعداد سريرية. وعلاوة على ذلك، يمكننا وصف بروتوكولات إضافية مفيدة للحفاظ على بقاء الخلية على غرس.

بقاء الخلية بعد زرع في الواقع يعتمد بشدة على الأوعية الدموية15،،من1617، مما يضمن تبادل الأوكسجين والمغذيات ويسهل التخلص من النفايات. المفاعلات الحيوية تشكل نهج واحد للتغلب على التحديات الأوعية الدموية في هندسة الأنسجة، والمحافظة على بقاء الخلية، من خلال نضح للثقافة المتوسطة وبالتالي توفير الأوكسجين والمغذيات18. نحن هنا، لتوضيح أسلوب في المختبر لتقييم القدرة على الهجرة من الخلايا البطانية ميكروفاسكولار من ميكروكاريرس RCP بيوماتريكس وقدرتها على الإسهام في حيثياته الأوعية الدموية والأوعية. هذا بيوماتريكس هو جزء ديسيلولاريزيد من صائم الخنزير يسمى بيوفاسك (سقالة Vascularized البيولوجية)، غنية بالكولاجين والايلاستين ومع الحفاظ على هياكل الأوعية الدموية، الذي يشتمل تغذية شريان و الوريد استنزاف19 قد تم تطبيق لغرس قضايا20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هبمسكس كانت معزولة من رأس عظم الفخذ من هشاشة العظام المرضى الذين يخضعون لجراحة استبدال رأس عظم الفخذ. الإجراء الذي أنجز تحت موافقة "لجنة الأخلاقيات المحلية" من جامعة ويرزبيرج والمستنيرة للمرضى. خلايا بطانية microvascular الأولية كانت معزولة من خزعات القلفة من المانحين الأحداث. المناطة بهم القانونية المقدمة كاملة المستنيرة في الكتابة. تمت الموافقة على الدراسة من المجلس المحلي للاخلاقية من جامعة ويرزبيرج (التصويت 182/10).

1-عزل هبمسكس وهدميكس

  1. البشرية المشتقة من نخاع العظم stromal الخلايا الوسيطة (هبمسكس)
    1. إزالة العظام الاسفنجية من رأس عظم الفخذ باستخدام ملعقة عقيمة.
      ملاحظة: يظهر العظام الاسفنجية كمادة الحبيبية وفضفاضة داخل العظام القشرية، والتي من الصعب وجامدة. وقد يكون من الضروري شطب أجزاء من العظام الاسفنجية من العظام القشرية باستخدام مشرط.
    2. إدراج إزالة العظام الاسفنجية في أنبوبين 50 مل. يمكن أن تختلف حجم العظام الاسفنجية من 5 إلى 10 مل وفقا للبعد لرأس عظم الفخذ إزالتها أثناء جراحة استبدال مفصل الورك.
    3. المياه والصرف الصحي مع دميم-F12 (1:1 خليط من المتوسطة دميم ولحم الخنزير F12)، ملء الأنبوب مع حوالي 30 مل متوسطة.
    4. هز الأنبوب يدوياً، بطريقة طولية، 5 ثانية للسماح للخلايا الدهنية من العظام الاسفنجية. الطرد المركزي في 300 x ز و 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. نضح ماصة بلاستيكية تخرج وطبقة خلايا الدهون وما يقارب 20 مل من المادة طافية المتبقية. واسمحوا المتوسطة ما يكفي لتغطية العظام الاسفنجية.
    6. ملء الأنابيب مع 10 مل من دميم-F12 واهتز بشدة طوليا من جهة، عن 10-15 ثانية، ترك الخلايا.
    7. نقل 10-15 مل تعليق خلية مع ماصة بلاستيكية تخرج من الأنابيب إلى أنبوب 50 مل جديدة.
    8. كرر 2-3 مرات من الخطوة 1.1.6 تجميع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها حتى العظام الاسفنجية التي جمعت في أنبوب 50 مل الأبيض.
    9. نقل تعليق خلية مع ماصة بلاستيكية تخرج إلى اثنان أنابيب جديدة، تجنب يسفط بيليه الكولاجين المودعة في الجزء السفلي من الأنابيب 50 مل.
    10. أجهزة الطرد المركزي بتعليق خلية في ز 300 x و 22 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية بواسطة يسفط عليه مع تخرج ماصة بلاستيكية.
    11. إضافة 40 مل دميم-F12 10% FCS 1% القلم/بكتيريا 50 ميكروغرام/مل اسكوربات-2-الفوسفات في أنبوب ثالث. نقل 5 مل من هذا المتوسط لكل أنبوبة تحتوي على بيليه الخلية. إعادة تعليق الكريات الخلية بالخفقان الجزء السفلي من الأنابيب بشدة ونقل تعليق خلية إلى الأنبوب الذي يحتوي على المتوسط فقط.
    12. اختياري: تمييع 100 ميليلتر من تعليق الخلايا لخلية العد، وتمييع الأول 1: 100 مع برنامج تلفزيوني وثم 01:10 في تريبان الأزرق، بإضافة 15 ميليلتر لتمييع الأولى إلى 15 ميليلتر من دببس و 30 ميليلتر تريبان الأزرق للحصول دببس: تريبان الأزرق نسبة 1:1. عد الخلايا بدائرة نويباور قياسية.
    13. بذور الخلايا في 109 خلايا/175 سم2 ر-قارورة في 25 مل متوسطة كما هو موضح في 1.1.11. وبدلاً من ذلك، تقسيم تعليق خلية كاملة في عشرة تصل إلى 175 سم2 خلية ثقافة قوارير دون العد. وفي هذه المرحلة، هبمسكس لا يمكن تمييزها من الكريات الحمراء، التي يفوق عدد كبير منهم. سوف تظهر هبمسكس كمستعمرات متفرقة (1-2/قارورة) على مدى الأيام السبعة الأولى.
    14. تغيير المتوسطة بعد 4 أيام من البذر للسماح بالتفاعل بين خلايا الدم هبمسكس. وبعد تبادل المتوسطة الأولى، تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. إجراء تبادل المتوسطة بإزالة المتوسطة الثقافة مع ماصة بلاستيكية تخرج تماما والغسيل مرتين مع دببس (بإضافة 10 مل دببس إلى الخلايا ملتصقة وإزالتها تماما دببس مع ماصة بلاستيكية تخرج) وثم إضافة 20 مل من متوسطة جديدة، كما هو موضح في 1.1.11.
  2. البشرية عن طريق الجلد خلايا بطانية ميكروفاسكولار (هدميكس)
    1. علاج خزعات الجلد وعزل هدميكس وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا21. باختصار، بعد فصل الأدمة من البشرة، احتضان الأدمة في التربسين لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. وبعد وقت الحضانة، نقل الأدمة إلى طبق بتري يحتوي على مستنبت والصفر كل قطعة باستخدام مشرط. نقل تعليق الخلية التي تم الحصول عليها إلى أنبوب بلاستيكي 50 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز و 22 درجة مئوية. عد تعليق خلية باستخدام الدائرة نويباور والبذور في كثافة 1.2 × 104 خلايا/سم2. تغيير الوسط تماما كل يوم.

2-الإعداد والتعقيم قوارير زر الزيادة والنقصان، والحزب الشيوعي الثوري ميكروكاريرس ومفاعل حيوي

  1. غزل قوارير والحزب الشيوعي الثوري ميكروكاريرس
    1. يوم واحد قبل التجارب، إنشاء زر الزيادة والنقصان قوارير وإعدادهم للتعقيم من اﻷوتوكﻻف.
      ملاحظة: ترك قبعات قوارير غزل فضفاضة، وعندما يكون ذلك ممكناً، تعقيم لهم في وضع رأسي.
      1. التفاف قوارير غزل مع رقائق الألومنيوم حول قبعات الجانب بشكل منفصل من أجل تجنب التلوث أثناء إزالة التغليف. التفاف قوارير مع الطبقات 1-2 من رقائق الألومنيوم للتعقيم من أجل تقليل مخاطر التلوث بعد التعقيم.
    2. وزن الكمية المطلوبة من ميكروكاريرس ماكروبوروس RCP في 20 مل دببس.
      ملاحظة: مطلوب 30 ملغ كل قارورة زر الزيادة والنقصان. دعوهم هيدرات على الأقل 1 ح قبل التعقيم الحرارة من اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة).
  2. مفاعل حيوي التروية
    1. استخدام مفاعل حيوي النظام المذكور لإنتاج النسيج vascularized مكافئات20. مفاعل حيوي هذا يتكون من السفينة، التي وضعت في بيوماتريكس، خزان متوسطة وزجاجة ضغط.
      1. الاتصال السفينة مع الخزان المتوسطة وزجاجة الضغط من خلال أنابيب السيليكون (انظر الشكل 3). إجازة القبعات فضفاضة ووضعها في حقيبة بلاستيكية اﻷوتوكﻻف، أغلق جيدا، ووضع هذا في كيس من بلاستيك اﻷوتوكﻻف ثانية. تعقيم اﻷوتوكﻻف.

3-الثقافة هبمسكس وهدميكس على ميكروكاريرس ماكروبوروس RCP

ملاحظة: تم المسمى هدميكس المستخدمة للبذور ميكروكاريرس RCP مع طلب تقديم العروض بتوصيل لينتيفيرال. تعديل لهذا البروتوكول بعد بروتوكول منشورة سابقا5.

  1. واسمحوا ماكروبوروس RCP ميكروكاريرس تترسب في القاع وغسلها مع 10 مل من الثقافة المتوسطة. كرر 3 مرات.
  2. أغسل قوارير غزل مع 10 مل من الثقافة المتوسطة.
  3. إضافة 30 ملغ ميكروكاريرس ماكروبوروس RCP كل قارورة زر الزيادة والنقصان في 8 مل من الثقافة المتوسطة. حجته قوارير زر الزيادة والنقصان التي تحتوي على ميكروكاريرس RCP في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 30 دقيقة، قبل زرع الخلايا.
    ملاحظة: يستند هذا على الوزن الجاف التقريبي من ميكروكاريرس RCP قبل التعقيم.
  4. البذور 5 × 105 هبمسكس أو هدميكس (مرور 3) كل قارورة زر الزيادة والنقصان في 2 مل من الثقافة المتوسطة.
  5. مكان قوارير غزل على لوحة محرض وابدأ إثارة في 90 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق والباقي ل 55 دقيقة، في 37 درجة مئوية و 5% CO2، بإجمالي الحضانة ثابت/دينامية ح 1. كرر 4 مرات.
  6. إضافة 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة كل قارورة زر الزيادة والنقصان، ثم قم بتشغيل مستمر إثارة 95 لفة في الدقيقة. احتضان CO 37 درجة مئوية و 5%2.
  7. باستخدام ميكروبيبيتي أخذ عينات في أيام 1 و 4 و 7:333 ميليلتر للحمض النووي المحتوى (~ 0.5 ملغ)، 1000 ميليلتر للتحليل ووزارة شؤون المرأة (~ 1.5 ملغ) و 333 ميليلتر لتلطيخ يعيش الميت (~ 0.5 ملغ).
    ملاحظة: يستند هذا على الوزن الجاف التقريبي من ميكروكاريرس RCP قبل التعقيم.
  8. تغيير 10 مل من الثقافة المتوسطة كل يوم. لهذا، انتظر حتى ميكروكاريرس RCP تترسب في القاع ونضح بعناية فائقة 10 مل من قارورة زر الزيادة والنقصان، مع استخدام الماصة 10 مل، ثم قم بإضافة 10 مل من جديد الثقافة المتوسطة.
  9. الحفاظ الثقافات على لوحة محرض تعيين 95 لفة في الدقيقة، 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 7 أيام.

4-الحمض النووي المحتوى، تحليل وزارة شؤون المرأة، ويعيش تلطيخ ميتة، وتنتشر بالانزيم

  1. محتوى الحمض النووي
    1. باستخدام ميكروبيبيتي، جمع حوالي 0.5 ملغ ميكروكاريرس من كل قارورة زر الزيادة والنقصان (الواردة في ميليلتر 333 تعليق) ونقل إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل.
      ملاحظة: يستند هذا على الوزن الجاف التقريبي من ميكروكاريرس RCP قبل التعقيم.
    2. أغسل مرة واحدة مع 1 مل دببس، ثم نضح المادة طافية.
    3. إزالة المتبقية دببس في ليوفيليزير والوزن ميكروكاريرس المجففة بالتبريد لتطبيع لاحق.
    4. تجميد عينات في-80 درجة مئوية على الأقل 6 ح.
    5. احتضان العينات عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع 300 ميليلتر غراء 5 يو/مليلتر.
    6. إنشاء منحنيات المعايرة المناسبة اتباع التعليمات manufacturer´s من الإنزيم كوانتيتيشن (مثلاً، بيكوجرين دسدنا المقايسة) طقم وإجراء قياس الإشارات الفلورسنت في 520 نانومتر مع كاشف التﻷلؤ.
  2. فحص تحليل المجهر الإلكتروني (SEM)
    1. جمع ca. 1 مغ ميكروكاريرس من كل قارورة غزل ونقل إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل.
    2. أغسل ميكروكاريرس مرة واحدة مع 1 مل دببس.
    3. إزالة دببس واحتضان في 1 مل إيثانول 70% ح 1.
    4. إزالة المادة طافية واحتضان في 1 مل إيثانول 80% ح 1.
    5. إزالة المادة طافية واحتضان في 1 مل إيثانول 90% ح 1.
    6. إزالة المادة طافية واحتضان في 1 مل إيثانول 100% ح 1.
    7. إزالة المادة طافية واحتضان في 1 مل هيكساميثيلديسيلازاني لمدة 10 دقائق.
    8. فتح الغطاء والسماح العينات الجافة بين عشية وضحاها تحت غطاء كيميائية.
    9. إصلاح العينات على الدعم المناسب والمضي قدما إلى تحليل وزارة شؤون المرأة وفقا للبروتوكولات المعمول بها.
  3. DAPI وتلطيخ لايف/قتلى
    1. في يوم 2 و 4 و 7 بعد خلية البذر في ميكروكاريرس جمع 0.5 ملغ ميكروكاريرس من كل قارورة غزل ونقل إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل. أغسل مرة واحدة مع 1 مل دببس.
    2. DAPI
      1. إصلاح العينات لمدة 10 دقائق في بارافورمالدهيد 4% ما يكفي لتغطية لهم.
      2. أغسل مرة واحدة مع 1 مل دببس.
      3. احتضان في درجة حرارة الغرفة مع الحل المصبوغة لمدة 45 دقيقة على شاكر هزاز.
      4. الكشف عن إشارة DAPI الفلورية في مجهر الأسفار مع مرشح انبعاثات 420 نانومتر، والحصول على الصور.
    3. لايف/الميت تلطيخ
      1. احتضان عينات في 500 ميليلتر حل صبغ لايف/قتيلا. تبقى العينات عند 37 درجة مئوية مدة 20 دقيقة، محمية من الضوء.
      2. أغسل مرة واحدة مع 1 مل دببس.
      3. الكشف عن إشارة fluorescence الخلايا الحية مع عامل تصفية انبعاثات 490 في شمال البحر الأبيض المتوسط، ومن الخلايا الميتة مع تصفية انبعاثات 545 نانومتر على مجهر الأسفار. الحصول على الصور.
    4. تنتشر المقايسة هدميكس
      1. ميليلتر 330 مزيج من الكولاجين R حل 0.4% وميليلتر 170 من حمض الخليك 0.1% 50 ميليلتر من المتوسط M199 في أنبوب بلاستيك 15 مل. الحفاظ على الجليد.
      2. تأخذ ملغ ~0.375 من ميكروكاريرس (250 ميليلتر) باستخدام ميكروبيبيتي. نقل إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 مل، انتظر ميكروكاريرس RCP تترسب في القاع وإزالة الوسط تماما.
        ملاحظة: يستند هذا على الوزن الجاف التقريبي من ميكروكاريرس RCP قبل التعقيم.
      3. إضافة حجم هيدروكسيد الصوديوم 0.2 N اللازمة لتحييد الخليط الكولاجين ومزجها مباشرة مع ميكروكاريرس الحزب الشيوعي الثوري.
        ملاحظة: تحديد الكمية المطلوبة من هيدروكسيد الصوديوم 0.2 N مقدما بإضافته إلى الخليط حتى تغير في الرقم الهيدروجيني (تتحول من اللون الأصفر إلى اللون الوردي)، وبعد ذلك وضع الخليط في الحاضنة لمدة دقيقة 1، يجب أن يتم بعدها تشكيل هلام.
      4. لوحة RCP جل الكولاجين ميكروكاريرس الخليط في بئر صفيحة 24-جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 30 دقيقة.
      5. إضافة ميليلتر 200 عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (مثلاً، فاسكوليفي فيجف-أم الثقافة المتوسطة). احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة.
      6. مراقبة تحت مجهر المقلوب التباين المرحلة، استخدام 10 X التكبير الكائن، والحصول على الصور.

5-بيوماتريكس البذر وبدء نظام مفاعل حيوي هدميكس

  1. يوم واحد قبل البدء في ثقافات مفاعل حيوي، قطع بيوفاسك المفتوحة (بيوماتريكس) طوليا على الجانب أنتيميسينتيريك وإصلاحه في إطار سبق تطهيرها البولي (انظر الشكل 3 ألف، باء).
    ملاحظة: بيوفاسك بيوماتريكس التي تم الحصول عليها من شريحة ديسيلولاريزيد جيجونال الخنزير، أعد كالسابق نشر21.
    ملاحظة: كما لا يمكن تعقيمها الإطار البولي بالحرارة، وتطهير ذلك بالحضانة 20 دقيقة في حمام سونيك (40 كيلو هرتز) متبوعاً بالحضانة 3 مرات في الإيثانول 70% لمدة 25 دقيقة. ثم، يغسل الإطار 3 مرات مع دببس العقيمة.
    1. وضع نظام الإطار بيوماتريكس في 100 مم طبق بيتري وملئه مع عامل نمو غشائي الأوعية الدموية + 1% "البنسلين والستربتوميسين" (القلم/بكتيريا).
    2. حجته بيوماتريكس التي تفرخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  2. بعد فصل وفرز الخلايا، حقن 10 × 107 هدميكس في 1000 ميليلتر للثقافة المتوسطة عن طريق المفرج الحفاظ عليها من بيوماتريكس، مع استعمال المحاقن 2 مل.
    ملاحظة: حقن ميليلتر ~ 700 من خلال مدخل الشرياني و ~ 300 ميليلتر من خلال منفذ الوريد.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 3، للسماح لمرفق خلية.
  4. شغل نظام مفاعل حيوي مع 350 مل من الأوعية الدموية غشائي عامل النمو + 1% القلم/بكتيريا واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  5. ضع الإطار داخل السفينة لمفاعل حيوي. قم بتوصيل pedicles الشرياني والوريدي السفينة.
  6. بدء التروية بربط نظام مفاعل حيوي لمضخة تمعجية. تعيين الضغط في 10 ± 1 مم زئبق والسعة.
  7. زيادة ضغط تدريجي كل ساعة حتى وصلت إلى 100 مم زئبق للضغط، والسعة ±20.
  8. الحفاظ على نظام مفاعل حيوي لمدة 7 أيام في ظل هذه الظروف في 37 درجة مئوية و 5% CO2.

6-إضافة لطلب تقديم العروض-هدميكس بيوماتريكس

  1. 330 مزيج ميليلتر من محلول الكولاجين R 0.4% وميليلتر 170 من حمض الخليك 0.1% 50 ميليلتر من المتوسط M199 في أنبوب صقر 15 مل. الحفاظ على الجليد.
  2. تأخذ ميكروكاريرس RCP من قوارير زر الزيادة والنقصان. إزالة المتوسطة الثقافة تماما.
  3. إضافة حجم هيدروكسيد الصوديوم 0.2 N اللازمة لتحييد الخليط الكولاجين ومزجها مباشرة مع ميكروكاريرس الحزب الشيوعي الثوري.
  4. إضافة خليط ميكروكاريرس RCP جل الكولاجين في التجويف بيوماتريكس. السماح جيليشن لمدة 30 دقيقة.
  5. في موازاة ذلك، تغيير وسيلة مفاعل حيوي عن طريق إزالة الوسط تماما ثم قم بإضافة 350 مل قبل الطازجة، استعد، عامل نمو غشائي الأوعية الدموية + 1% القلم/بكتيريا.
  6. الاتصال مفاعل حيوي لمضخة تمعجية والضغط على ±20 100 ملم زئبق والسعة.
  7. تغيير كل 7 أيام في المتوسط.
  8. الاحتفاظ مفاعل حيوي في الثقافة لمدة 21 يوما.

7-تحليل و read-outs الثقافات مفاعل حيوي

  1. إعداد العينات
    1. قطع بيوماتريكس مفاعل حيوي وإزالته من الإطار البولي.
    2. قص القطعة التي تم الحصول عليها إلى 6 أقسام: 2 ل MTT، 2 البارافين التضمين/تلوين و 2 للتحليل ووزارة شؤون المرأة.
  2. تضمين البارافين
    1. وضع المقاطع في طبق بتري وتغسل مع دببس ما يكفي لتغطية لهم. تجاهل في دببس.
    2. إصلاح المقاطع في بارافورمالدهيد 4% بين عشية وضحاها.
    3. إعداد أشرطة الكاسيت لتضمين البارافين والقيام بذلك وفقا للبروتوكولات القياسية.
    4. إعداد المقاطع في كتل البارافين وقطع عينات من 3 ميكرومتر لتلطيخ ح & ه، مع استخدام مبضع.
  3. ح & تلطيخ ه
    1. وصمة عار امهاء الأقسام وفقا للبروتوكولات القياسية32.
  4. فحص تحليل المجهر الإلكتروني (SEM)
    1. وضع المقاطع في طبق بتري وتغسل مع دببس ما يكفي لتغطية لهم. تجاهل في دببس.
    2. إصلاح الأبواب مع glutaraldehyde 4.75 في المائة بين عشية وضحاها.
    3. تنفيذ سلسلة الجفاف مع زيادة تركيزات من الإيثانول 50%-100%.
    4. تغطية المقاطع مع هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) 10 دقيقة تجاهل همدس المستخدمة وإضافة همدس الطازجة.
    5. السماح بالمقاطع إلى الجافة بين عشية وضحاها تحت غطاء الدخان ثم قم بإعداد العينات للتصوير.
  5. بروميد 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)
    1. خلط الكاشف MTT مع عامل نمو الأوعية الدموية غشائي، بتركيز 1 ملغ/مل.
    2. احتضان الفروع في حل MTT لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    3. مراقبة هياكل الأوعية الدموية وخلايا المصنف ميكروكاريرس الميكروسكوب أو تحت مجهر مشرق الميدانية، للكشف عن خلايا أيضي نشطة. الحصول على الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 1A، حصلنا على عدد كبير من الخلايا قابلة للتطبيق على ميكروكاريرس RCP بعد 7 أيام للثقافة، يحدده تلطيخ يعيش الميت. وتأكدت هذه النتائج بتحليل وزارة شؤون المرأة، التي لوحظت ميكروكاريرس المستعمر تماما حول المسام، جزئيا أوفيرجرووينج لهم (الشكل 1B). من ناحية أخرى، أسفرت التجارب فيها خلايا تم لا بالتساوي المصنف عدة ميكروكاريرس فارغة. تتميز التجارب الفاشلة شكل غير طبيعي ارتفاع عدد الخلايا الميتة التي ينبغي أن لا يكون أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

واحد والهدف الرئيسي من ميكروكارير هو توسيع نطاق الخلايا مع الحفاظ على التمايز بهم بغية إيصال الخلايا إلى مكان الحاجة. إدخال أسلوب تمثيل RCP ميكروكاريرس حيث كانت الخلايا قادرة على إرفاق وتتكاثر واستعمار في ميكروكاريرس مع خلية عالية الكثافة. وقد لوحظ بالعيش/الميت تلطيخ، التي تم الكشف عن أكثر من 90% خلايا قابلة للحياة بينما تم الحصول عليها إلا عدد قليل من الخلايا الميتة بعد 7 أيام ثقافات الديناميكية. وبالمثل، أكد الصور وزارة شؤون المرأة أن الخلايا تغطي كامل السطح من ميكروكاريرس بعد 7 أيام ثقافات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

البحوث المؤدية إلى هذه النتائج قد تلقت تمويلاً من الاتحاد الأوروبي السابعة إطار برنامج FP7/2007-2013 ضمن اتفاق منحة جوان 607051 (بيو-الهام). ونحن نشكر كارولين فإن سبريويل جوسينس من فوجي فيلم تصنيع أوروبا B.V.، للمساعدة التقنية أثناء التصنيع RCP، و "ستراك فيرنر" من معهد فراونهوفر "سيليكات بحوث مركز الدراسات الدولي"، للمساعدة في التحليل ووزارة شؤون المرأة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول -2-يل) -2،5-ديفينيلترازوليوم بروميد (MTT)سيرفا الكهربائي GmbH20395.01
4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولديهيدروكلوريد (DAPI)سيجما ألدريتشD9542
حمض الخليك 100٪سيجما ألدريتش533،001
الميزان التحليلي Kern EG 2200-2NMKern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphateSigma-AldrichA8960
المفاعل الحيويلهندسة الأنسجة والطب التجديدي ، فورتسبورغ ، ألمانيا
مجهر المجال الساطع Axiovert 40CCarl Zeiss AG
CellnestFujifilm
(15 مل ، 50 مل)Greiner Bio-One
محلول الكولاجين R 0,4٪Serva Electrophoresis GmbH47254.01
DMEM-F12Gibco11320-033
Dulbecco's Dulbecco's Bubbleed SalineSigma-AldrichD8537معدل ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم
Eosin 1٪Morphisto10177.01000
الإيثانول 96٪كارل Roth GmbHT171.4
مصل ربلة الساق الجنينية المشوهة (FCS)Bio& بيعFCS. ADD.0500مجهر مضان غير معطل بالحرارة
BZ-9000Keyence
HaematoxylinMorphisto10231.01000
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191درجة الكاشف ، & ge ؛ 99٪
حاضنة للمفاعلالحيوي كرسي هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، فورتسبورغ ، ألمانيا
طقم تلطيخ مزدوج الخلية الحية / الميتةFluka04511KT-F
لوحة النمام المغناطيسية2Mag80002
متوسطة 199Sigma-AldrichM065010X
قارئ Microplate
Tecan Infinite M200		Tecan
إبرة 21 جرام 16 ممVWR613-5389
غراء من البابايا لاتكسسيجما ألدريتشP4762مسحوق مجفف بالتجميد ، & 10 وحدات / مجم بروتين
بارافينكارل روث GmbH6642.6
البنسلين / الستربتومايسينسيجما ألدريتشP4333
مضخة تمعجيةإسماتيك
Quanti-iT PicoGreen dsDNA مجموعةفحص Thermo Fischer ScientificP7589
Histofix 4٪Carl Roth GmbHP087
المجهر الإلكتروني الماسح فوق 25Carl Zeiss AG
محلول هيدروكسيد الصوديوم 1.0 Nقوارير Sigma-AldrichS2770
الدوارة (25 مل)ويتون356879
1 ملVWR720-2561
قوارير زراعة الأنسجة (25 سم < سوب > 2 < / sup> ، 75 سم < سوب > 2 < / سوب > ، 150 سم < سوب > 2 < / سوپ >) TPPTechno Plastik Products AG
Trypan Blue 0.4٪Sigma-AldrichT8154
VascuLife تقنيةخلايا شريان الحياةVEGF-Mv LL-0005
كرسي أنابيب الطرد المركزي حقنة

المراجع

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025(2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23(2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460(2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885(2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986(2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

المؤتلف الكولاجين أنا ميكروكاريرس الببتيد لتوسيع الخلية وإمكانية استخدامها كنظام إيصال خلية في مفاعل حيوي نموذج
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.