نقدم هنا طريقة تجريبية لاختبار دور البلازميدات multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اختبار دور البلازميدات Multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والبلازميدات multicopy وفيرة جداً في بدائيات النوى ولكن دورها في تطور البكتيريا ما زالت غير مفهومة. ونحن مؤخرا أظهرت أن الزيادة في عدد نسخ الجينات كل خلية يقدمها والبلازميدات multicopy يمكن أن تسرع تطور الجينات المرمزة بلازميد. في هذا العمل، نحن نقدم نظام تجريبي لاختبار قدرة والبلازميدات multicopy لتعزيز التطور الجيني. باستخدام أساليب بسيطة في مجال البيولوجيا الجزيئية، نحن تشييد نظام نموذج حيث يمكن إدراجها جينات مقاومة للمضادات الحيوية في MG1655 الإشريكيّة القولونية ، في الكروموسوم أو في بلازميد multicopy. نحن نستخدم نهج تجريبي تطور لتنتشر سلالات مختلفة تحت التركيزات المتزايدة للمضادات الحيوية ونقيس بقاء السكان البكتيرية على مر الزمن. يتم اختيار الجزيء المضادات الحيوية والجينات المقاومة حيث أن الجينات يمكن أن يمنح فقط المقاومة من خلال الحصول على الطفرات. ويوفر هذا النهج "الإنقاذ تطورية" طريقة بسيطة لاختبار إمكانات والبلازميدات multicopy لتعزيز اكتساب المقاومة للمضادات الحيوية. في الخطوة التالية للنظام التجريبي، تتسم الأسس الجزيئية للمقاومة للمضادات الحيوية. تحديد الطفرات مسؤولة عن الحصول على مقاومة المضادات الحيوية نستخدم العميق تسلسل الحمض النووي للعينات التي تم الحصول عليها من شعوب بأكملها والحيوانات المستنسخة. أخيرا، لتأكيد دور الطفرات في الجينات قيد الدراسة، إعادة بناء عليها في الخلفية الأبوية واختبار النمط الظاهري مقاومة للضغوط الناجمة عن ذلك.
المقدمة
المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا هي مشكلة صحية رئيسية1. على مستوى أساسي، انتشار المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا المسببة للأمراض مثال بسيط للتطور بالانتقاء الطبيعي2،3. ببساطة، استخدام المضادات الحيوية يولد التحديد لسلالات مقاومة. ولذلك، هو مشكلة رئيسية في علم الأحياء التطوري، لفهم العوامل التي تؤثر على قدرة سكان الجرثومي تتطور المقاومة للمضادات الحيوية. انتقاء التجارب قد برزت بوصفها أداة قوية جداً للتحقيق في علم الأحياء التطوري من البكتيريا، وقد أنتج هذا الحقل رؤى لا يصدق في طائفة واسعة من المشاكل التطورية4،،من5....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تشييد النظام التجريبي ترميز الجينات المقاومة للمضادات الحيوية
ملاحظة: هنا استخدمت MG1655 كولاي السلالة المستفيدة من بلازميد أو كروموسوم ترميز الجينات المقاومة للمضادات الحيوية. يتم ترميز الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في الكروموسوم أو بلازميد multicopy في عبئا اسوي خلاف ذلك (الشكل 1).
-
إدراج الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في λ بالعاثية التكامل الموقع (أتتب)20 من الكروموسوم MG1655.
- تضخيم المناطق bp طوله 500 في كلا الجانبين من الموقع الصبغية attB PCR. استخدام النوكليوتيد و يبهك (5 '-ككتجتاككجتاكاجاجتات-3') وأتتب-R (5 '....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في أعمالنا السابقة، وكان التحقيق في تطور β-lactamase الجينات بلوختيم-1 نحو منح المقاومة ceftazidime سيفالوسبورين الجيل الثالث12 . تم تحديد هذه الجينات لأنه، على الرغم من أن لا يمنح تيم-1 مقاومة سيفتازيديمي، الطفرات في بلوختيم-1 يمكن توسيع نطاق النشاط تيم-1 يتحلل السيفالوسبورينات مثل ceftazidime29. الطفرات في الإنزيمات المقاومة للمضادات الحيوية مثل β-lactamases أو امينوغليكوزيد تعديل الإنزيمات مما يؤدي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقدم بروتوكول جديد يجمع بين البيولوجيا الجزيئية وتطور تجريبية وعميق تسلسل الحمض النووي تهدف إلى التحقيق في دور البلازميدات multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو يجمع بين التقنيات من مختلف المجالات، جميع الوسائل اللازمة لتطوير ذلك بسيطة، ويمكن أن يؤديها في مختبر الميكروبيولوجيا عادية. الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي على الأرجح بناء سلالات النظام النموذجي وتعمير الطفرات لوحظ بعد تطور التجريبية (التي يتم تنفيذها باستخدام نفس الأسلوب الدقيق). ومع ذلك، نظام الجمعية م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
هذا العمل وأيده دي معهد الصحة كارلوس الثالث (دي "خطة الحكومي" أنا + د + أنا 2013-2016): منح CP15 00012، PI16-00860، وسيبير (CB06/02/0053)، شاركت في تمويله "الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية" '' طريقة لتحقيق أوروبا '' (سيطلب). جاي معتمد من قبل البرنامج Atracción de talento حكومة منطقة مدريد (2016-T1/بيو-1105) وأنا + "اكسسيلينسيا د" للاسباني دي وزارة الاقتصاد، اندستريا y كومبيتيتيفيداد (BIO2017-85056-P). ASM معتمد من قبل على "ميغيل سيرفيت زمالة" من معهد دي السعود كارلوس الثالث (MS15/00012) شاركت في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي "الاستثمار في المستقبل" (كلية العلوم التربوية) وسيطلب.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| كوفيت التثقيب الكهربائي | سيجما ألدريتش | Z706078 | |
| NanoDrop 2000 / 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | تحديد جودة الحمض النووي لقياس نسب الامتصاص 260 نانومتر / 280 نانومتر و 260 نانومتر / 230 نانومتر |
| حاضنة | Memmert | UF1060 | |
| حاضنة (شاكر) | كول بارمر المحدودة | SI500 | |
| مزود الطاقة الرحلان الكهربائي | BioRad | 1645070 | هلام الرحلان الكهربائي |
| غرفة الرحلان الكهربائي | BioRad | 1704405 | الرحلان الكهربائي هلام الاغاروز |
| الماصات | Biohit | 725020 ، 725050 ، 725060 ، 725070 | |
| ماصات | متعددة القنواتBiohit | 728220 ، 728230 ، 728240 | |
| قارئ الألواح Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| حلقات التلقيح | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| لوحات 96 بئر | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB أجار | فيشر العلمية | BP1425-500 | |
| Phusion بوليميراز | ثيرمو فيشر العلمي | F533S | |
| جيبسون الجمعية | نيو إنجلاند بيولابيس | E2611S | |
| إنزيمات Resctriction | Fermentas FastDigest | ||
| المضادات الحيوية | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | طقم استخراج البلازميد |
| معالج طقم تنقية الحمض النووي الجيني | طقم استخراج | Promega | A1120 |
| DNeasy Blood & أطقم الأنسجة | Qiagen | 69506 | مجموعة استخراج gDNA |
| أكواطف التثقيب الكهربائي | أطباق Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| ألواح 96 بئر (-80 & ordm; تخزين C) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | القياس الكمي لتركيز الحمض النووي |
| Agarose | BioRad | 1613100 | الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز |
| 50x TAE عازلة | BioRad | 1610743 | الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز |
| T4 عديد النوكليوتيدات كيناز | ثيرمو فيشر العلمي | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | ثيرمو فيشر العلمي | EL0014 |
المراجع
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- M....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
