يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

السريع في فيفو تقييم لقدرات توليد الخلايا اللمفية T السامة للخلايا Adjuvant في لتطوير اللقاحات

7.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57401

⸱

يونيو 19, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vaccinology and Applied Microbiology, Helmholtz Centre for Infection Research

في هذه المقالة

ملخص

نحن الحاضرين هنا تطبيق لتقنية مناعية قياسية (كفسي الملون OT--أنا انتشار) تهدف إلى رصد سرعة توليد اللمفاويات T السامة للخلايا بوساطة adjuvant (CTL) المجراة في. هذا تقدير سريع لقدرات CTL مفيد لتطوير لقاحات وقائية ضد العوامل الممرضة داخل الخلايا، فضلا عن لقاحات السرطان العلاجية.

الملخص

تقييم لقاحات الوحدة الفرعية الحديثة يكشف عن أن جيل تحييد الأجسام المضادة مهم لكنه غير كاف لتحديد adjuvant. ولذلك، هناك حاجة ماسة في المواد المساعدة مع قدرات المناعية تنشيطية كل خلطيه والخلوية التي تكون قادرة على تعزيز استجابات الخلايا الليمفاوية (CTL) T السامة للخلايا. وهكذا، رصد المؤمنين من المرشحين adjuvant حمل الصليب-فتيلة وتعزز بعد إنشاء CTL يمثل خطوة حاسمة في تطوير اللقاحات. هنا نقدم طلبا لأسلوب يستخدم سيينفيكل على حدة (OT--أنا) خلايا T لرصد الصليب-عرض نموذج مستضد ovalbumin (OVA) في فيفو حضور المرشحين adjuvant مختلفة. ويمثل هذا الأسلوب إجراء اختبار سريع لتحديد المواد المساعدة مع قدرات فتيلة عبر أفضل. انتشار CD8+ تي الخلايا هي إشارة أثمن من فتيلة الصليب وهو أيضا يعتبر ربط العرض التقديمي عبر المستحثة adjuvant. ويمكن تقييم هذه الميزة في مختلف أجهزة المناعة مثل العقد الليمفاوية والطحال. مدى جيل CTL يمكن أيضا رصدها، مما يعطي أفكاراً حول طبيعة محلية (استنزاف العقدة الليمفاوية أساسا) أو استجابة على نطاق المنظومة (العقد الليمفاوية البعيدة و/أو الطحال). يسمح هذا الأسلوب أيضا العديد من التعديلات لاختبار العقاقير التي يمكن أن تمنع محددة العرض التقديمي عبر مسارات، ويوفر أيضا إمكانية استخدامها في سلالات مختلفة من الفئران التقليدية والمعدلة وراثيا. وباختصار، ستكون مفيدة لمختبرات اللقاحات في الصناعة أو في الأوساط الأكاديمية أن تطوير أو تعديل المواد الكيميائية لبحوث اللقاحات وتطوير التطبيق الذي نحن الحاضرين هنا.

المقدمة

السامة للخلايا تي اللمفاويات (CTL) حمل اللقاحات هي التدخلات العلاجية الرئيسية التي تم وضعها لمكافحة أنواع معينة من السرطان1. CTL أيضا هامة للقاحات وقائية ضد العوامل الممرضة داخل الخلية2. وعلاوة على ذلك، CTL هي إحدى آليات الدفاع المناعي القليلة نشطة وظيفيا في السكان خطر مثل الولدان3،4 منهم تعتمد أيضا على CTL لمكافحة العدوى الحياة المبكرة5. وفي هذا الصدد، اللقاحات ضد الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) التي تم تطويرها مع أخرى الأعشاب التي لا تثير استجابات CTL (الشب) أدت إلى فشل كامل اللقاح مما يؤدي إلى مضاعفات خطيرة على الإصابات في الرضع6. يمكن عكس هذه الآثار السلبية للتطعيم من CD8+ استجابة الخلية تي7. وقد أثبتنا سابقا أن السيتوكينات الرئيسي (النوع الأول من تداخلين) حظيت ببعض مشجعا من الانترفيرون الجينات (اللدغة) يضع ضروريان للردود CTL التي تولدها هذه المواد8، في جزء منه عن طريق قياس انتشار ت-أنا تي الخلايا بعد التطعيم، واستخدام هذه النتائج كما لوحظ قدر من CTL يحفز القدرات في تمديد مواعيد التطعيم9. قياس انتشار OT--أنا CD8+ تي الخلايا في ماوس المتلقية C57BL/6 نوع البرية (WT) بصبغ إستر (CFSE) سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين التخفيف تقدير قدرة adjuvant لقاح لتوليد قوي الصليب-فتيلة سيينفيكل، (الببتيد المناعية المهيمنة من أوفالبومين، البويضات). أشكال مختلفة من هذه التقنية تستخدم على نطاق واسع لتقييم انتشار OT-أنا CD8+ وخلايا CD4 بعد التمديد الثاني+ تي الخلايا. على سبيل المثال، قد استخدمت في غياب السيتوكينات مختارة (كو الفئران) أو لقياس فعالية لقاح بعد استدعاء مستضد في وزن الحيوانات. نحن وضع بروتوكول قصيرة (التجربة 4 أيام) الذي بعد نقل السلبي الملون كفسي OT-أنا CD8+ تي الخلايا، تحصين (الليبي) تحت الجلد تتكون من جرعة واحدة من 50 ميكروغرام البويضات خالية من الذيفان وتستكمل مع اختبار المواد المساعدة ويدار (الشكل 1). متابعة نتائج 48 ساعة بعد التطعيم يوفر دليلاً موثوق بها من قدرة adjuvant على توليد استجابات CTL. بهذه الاستراتيجية، من الممكن لتقييم فاعلية الاستجابة المناعية المحلية في العقدة الليمفاوية تجفيف بعد التحصين، فضلا عن مدى الاستجابة بقياس نشاط CTL في الطحال (أو العقد الليمفاوية البعيدة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وكانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من الخلفية C57BL/6. وأبقى كل الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض. جميع التجارب التي أجريت وفقا لمعياري لقانون حماية الحيوانات الألمانية (تيرشج بجبل. أنا S 1105؛ 25.05.1998) ووافقت عليها "اللجنة ساكسونيا السفلي" في "أخلاقيات التجارب الحيوانية" ومكتب الدولة (انخفاض ساكسونيا الدولة مكتب لحماية المستهلك وسلامة الأغذية)، تحت رقم تصريح 33.4-42502-04-13/1281 و 162280.

1. كفسي تلطيخ من OT--أنا تي الخلايا ونقل التبني

ملاحظة: OT--أنا الفئران هي ترانسجينيكالي التي تم إنشاؤها من الحيوانات التي تعبر عن مستقبلات خلية تي (تكر) مع α ثابت وسلاسل β معا تعترف الببتيد المناعية المهيمنة من البويضات، سيينفيكل10،11. كنتيجة لذلك، قد هذه الفئران عدد كبير إلى حد كبير من CD8 الخاصة سيينفيكل+ تي الخلايا (97%)12 عند مقارنة بالفئران العادية أو تلقيح البويضات (≤ 1 ٪)13.

  1. عزل CD8 يمكن تتبعها الخلايا+ ر من ت-أنا الفئران التعبير عن اليل خاصة اللمفاويات T Thy1 (Thy1.1):
    1. Euthanize OT 6-9 أسابيع من العمر--أنا الفئران باستنشاق أول أكسيد الكربون2 متبوعاً بخلع عنق الرحم14. تشريح الطحال والغدد الليمفاوية الرئيسية (أزواج الاربية وابطي وعنق الرحم فقط) بقطع الجلد مع المقص الجراحي، فصل الجلد من الجسم بالمساعدة من كماشة الجراحية والملقط ووضعها في أطباق بتري (60 × 15 ملم) التي تحتوي على كل 100 ميكرومتر المسامية مش كأس للإفراج عن طحن وخلايا الأنسجة.
    2. المحافظة على أطباق بتري (مع كوب واحد مش كل) في 3-5 مل من إكمال ربمي المتوسطة (RPMI 1640، 10% v/v FCS، 100 البنسلين U/mL، ستربتوميسين 50 ميكروغرام/مل) أبقى على الجليد.
    3. الهريس الأجهزة مع المساعدة من المكبس المحاقن أو صك مماثل عقيمة (قطع السابقة غير مطلوبة) وجمع تعليق وحيد الخلية الناتجة في أنابيب الطرد المركزي 15 مل.
    4. الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية. تغسل الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة بالطرد المركزي وفي الكريات الحمراء من الطحال بإعادة تعليق بيليه في 1 مل/الطحال من كلوريد الأمونيوم المخزن المؤقت (ACK العازلة، متوفرة تجارياً). احتضان الخلايا لمدة 1.5 دقيقة على الجليد وبعد ذلك تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة بالطرد المركزي (كما فعلت من قبل).
    5. إعادة تعليق بيليه في الأنبوب نفسه في 1 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.2) التي تحتوي على 5% الجنين البقري مصل للعزل المغناطيسي.
  2. لإجراء العزل المغناطيسي، تابع إلى الانتقاء السلبي من CD8+ تي نشر البروتوكولات15أو الخلايا باستخدام مجموعة أدوات عزل مغناطيسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. القيام بتلوين كفسي، العد الأول عدد CD8+ تي الخلايا التي تم الحصول عليها من الأراضي المحتلة--أنا الفئران باستخدام عداد الآلي خلية (عداد الجسيمات). 1-5 × 107 خلايا/مل في وحدة تخزين مل 1-5 مع 5 ميكرومتر كفسي في برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق على 37 درجة مئوية، ومحمية من الضوء في أنبوب صقر 15 مل وصمة.
  4. إخماد تلطيخ كفسي بإضافة نفس الحجم (1:1) من مصل الدم البقري الجنين إلى الخلايا، واحتضان لهم لمدة دقيقة 7 إضافية عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء. تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مرتين.
  5. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية. تعيين عدد الخلايا إلى 3-5 × 107 خلايا/مل من برنامج تلفزيوني من أجل حقن 3-5 × 106 خلايا/الماوس في 100 ميليلتر عن طريق الوريد (رابعا) عن طريق الوريد الذيل.
  6. لإجراء حقن الوريد الذيل، شل الفئران في ريسترينيرس المناسبة. الحارة بمنطقة الظهر وذيل الفئران بالحقن باستخدام مصباح الضوء الأحمر، وضعت بين 20 إلى 25 سم بعيداً عن الفئران لمدة 1-3 دقيقة للسماح للذيل المنطلق توسع الأوعية.
    ملاحظة: وهذا يساعد على سهولة كشف الوريد والإدارة تعليق خلية.
  7. ضمان (باليد توضع بين الفئران والمصباح) أنه ليس جداً الساخنة للفئران وعندما الأوردة الذيل تكون مرئية بوضوح، المضي قدما بالحقن. حقن الخلايا في الوريد الذيل الأفقي أو الظهرية استخدام حقنه 1 مل مع إبرة قياس 2516.

2-التحصين (خالية من إندو البويضات +/-Adjuvant)

  1. مكان الفئران زرعها مع OT-الخلايا (الخطوة 1، 7، الشكل 1) في تشكيل غرفة تخدير، وإدارة إيسوفلوراني في الأكسجين آلة تخدير14.
  2. عندما يكون الماوس نائماً تماما تحت التخدير، إخراجه من الدائرة ويحلق فرو الماوس على المنطقة على مدى السطحية عضلة (الأفقي أسفل الظهر) باستخدام جهاز تشذيب شعر كهربائية، من أجل القيام حقن نظيفة مع عرض جيد لمجال التطبيق.
  3. حقن 50 ميليلتر من اللقاح، الليبي في منطقة حلق باستخدام إبرة قياس 25.

3-عزل الخلايا الليمفاوية وتلطيخ لتحليل التدفق الخلوي

  1. عزل الخلايا الليمفاوية وسبلينوسيتيس
    1. Euthanize الفئران جرى تطعيمهم باستنشاق2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    2. استخراج البعيدة وتجفيف الغدد الليمفاوية والطحال ووضعها في أطباق بتري منفصلة تحتوي على 100 ميكرومتر المسامية مش كوب للإفراج عن طحن وخلايا الأنسجة. اتبع الخطوات 1.1.2 من خلال 1.1.3.
    3. صب المادة طافية بعد الطرد المركزي، وإعادة تعليق الكريات خلية في نفس الحجم من بقايا PBS (ما يقارب 100 ميليلتر).
  2. تلوين لتحليل التدفق الخلوي
    1. في أنبوب الطرد 15 مل إعداد مزيج رئيسي الذي يحتوي على الأجسام المضادة المصبوغة في تركيزات المبينة في الجدول 1، وهكذا تسفر عن علامة x 2 تتركز ميكس المصبوغة. إعداد حجم ما يكفي من مزيج الرئيسي أن يكون 100 ميليلتر كل عينة. مزيج الخلايا ومزيج الرئيسي 1:1، واحتضان أنه عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم المصبوغة النهائية كل عينة 200 ميليلتر (100 ميليلتر من الخلية بيليه + 100 ميليلتر من جسم ميكس الرئيسي).
    2. تغسل الخلايا مرتين بالطرد المركزي كما هو موضح في 1.1.3، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني، مرتين.
    3. تعليق إعادة الخلايا الملون في 0.5-1 مل من برنامج تلفزيوني لاقتناء ونقل التعليق لأنابيب تدفق سيتوميتير. دائماً الاحتفاظ بعينات على الجليد ومحمية من الضوء.

4-التدفق الخلوي

  1. دائماً ما قبل تصفية عينات الخلايا باستخدام مرشحات 70-100 ميكرومتر.
  2. إعداد عناصر تحكم مفردة المصبوغة التعويض فلوروفوريس بالتفصيل في الجدول 1 (الخرز أو الخلايا).
    ملاحظة: ينبغي أن يؤديها في سيتوميتير أو تحليل البرمجيات17،،من1819 التعويض وتطبيقها على جميع العينات.
  3. اتبع هذه الاستراتيجية النابضة هو مبين في الشكل 2. بإيجاز، بوابة السكان في الارتفاع مبعثر الأمام مقابل منطقة المبعثر إلى الأمام (الشكل 2A)، ومرة أخرى الجانب مبعثر واسعة مقابل الجانب مبعثر المنطقة (منطقة أفريقيا جنوب الصحراء، الشكل 2) بغية استبعاد doublets.
  4. بوابة السكان من الشكل 2B بالتآمر BV 650 (السيارات-الأسفار) مقابل فيتك (CFSE) من أجل تميز كفسي الحقيقي الملون الخلايا من الخلايا السيارات-الفلورسنت عالية. وتشمل الخرز أو خلايا ملطخة بجسم مترافق إلى 650 بي إلى ضوابط التعويض. يستخدم هذه الأرض (الشكل 2) من 650 بي مقابل فيتك للبوابة في الأراضي المحتلة--أنا كفسي الملون الخلايا.
  5. بوابة السكان من الشكل 2 ج Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1-) مقابل APC (CD8) لتمييز الخلايا المشتقة من المانحين مقابل الفئران المستفيدة.
    ملاحظة: الخلايا المستمدة من OT--أنا الفئران المانحة هي Thy1.1+ (CD90.1)، بينما تكون الخلايا المستمدة من الفئران (C57BL/6، المتلقي) WT Thy1.2+ (CD90.2) (الشكل 2D). لدى بعض المختبرات OT--أنا الفئران في خلفية Thy1.2 ووزن (C57BL/6) في Thy1.1. وفي هذه الحالة يجب عليك استخدام جسم مضاد ضد Thy1.2 للعبارات--أنا خلية النابضة.
  6. إعادة بوابة CD8 الخلايا+ من السكان Thy1.1+ بالتآمر على بوابة تضم 450 BV (CD4) مقابل APC (CD8) (الشكل 2E).
  7. عرض السكان بوابات في 2E الشكل باستخدام عرض الرسم بياني CD8+ الخلايا تظهر كفسي (فيتك، قناة 530/15-الليزر الأزرق-)، بوابة السكان انتشرت بكثافة من 102 تصل إلى المستوى حيث السكان تحكم غير المجزأة هي (كثافة ~ 105، اعتماداً على كفاءة تلطيخ كفسي وإعداد cytometer تدفق التيار الكهربائي) (الشكل 2 واو).
  8. جعل بوابة إضافية (غير معروضة في الشكل 2) رسم فيتك مقابل L/D علامة (450/20 قناة والليزر الأشعة فوق البنفسجية) بغية تقييم الخلايا الميتة بالتوازي مع تقييم الانتشار.
  9. الحصول على مالا يقل عن 5000 الأحداث لعناصر التحكم التعويض ومن العينات في سيتوميتير تدفق أحداث 10.000 (البوابة الإلكترونية، الشكل 2). تشغيل في سيتوميتير في التدفق المنخفض أو المتوسط (لا تتجاوز معدلات التدفق من أحداث 20.000/s).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من أجل اختبار علاجات استخدام مجموعة مختلفة من المواد المساندة (ADJ1 و ADJ2)، قمنا بتقييم قدرة توليد CTL بقياس انتشار العبارات المنقولة أدوبتيفيلي--أنا CD8+ تي الخلايا بالتدفق الخلوي (الشكل 2). لهذا، نحن سابقا الملون الخلايا المعزولة من استنزاف الليمفاوية والطحال (الجدول 1). عن طريق قياس انتشار CD8+ تي الخلايا في الغدد الليمفاوية والطحال، كنا قادرين على تأكيد قدرة توليد CTL أعلى من ADJ2 في استنزاف الليمفاوية (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

اللقاحات الحديثة هي من الناحية المثالية متميزة composedof مستضد المنقي والمواد المساعدة، مع إمكانية إضافة نظام توصيل مثل الدهنية أو جسيمات شبيهة بالفيروس، وجسيمات نانوية أو ناقلات حية. أحد جوانب رئيسية عند تصميم لقاح أن تختار adjuvant الصحيح وفقا للاحتياجات السريرية. يمكن أن يتضمن جزء من النطاق تحابي خلطيه مقابل الاستجابة المناعية الخلوية (أو كليهما)، وانتخاب محلي مقابل استجابة المناعة الجهازية (أو كليهما)، ونوع الذاكرة التي يجب أن تولد اللقاح في المجموعة السكانية المستهدفة. أحد الجوانب الهامة لتقييم adjuvant لسرعة تحديد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن مدينون للمساعدين التقنيين لدينا: Bröder شين وحاء شكارليت، الذين ساعدونا خلال الإجراءات التجريبية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بمنح الاتحاد الأوروبي (يونيب، والعقد رقم 601738، و TRANSVAC2، العقد رقم 730964)، ومنحة "رابطة هلمهولتز" (هاي-IDR). لم لا تؤثر مصادر تمويل البحوث تصميم وتوليد مخطوطة أو المقرر تقديمها للنشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BD LSR Fortessa Cell AnalyzerBDبطلب خاصالتدفق الخلوي
CFSEالمجسات الجزيئيةC34554صبغة الانتشار
MojoSort Mouse CD8 T T Cell InsulationBiolegend480007حبات العزل المغناطيسي والأجسام المضادة للاختيار السلبي لخلايا CD8 T التي لم تمسها.
LIVE / DEAD Fix Blue Cell Dead Stain Kit ، لإثارة الأشعة فوق البنفسجيةالمجسات الجزيئيةL23105علامة الخلايا الميتة
CD90.1 (Thy-1.1) الجسم المضاد أحادي النسيلة (HIS51) ، PE-Cyanine7eBioscience25-0900-82الجسم المضاد
APC المضاد للفأر CD8a الأجسام المضادةBioLegend100712الجسم المضاد
BV421 الفئران المضاد للفأر CD4BD740007المضاد
Z2 كولتر عدد الجسيمات ومحلل الحجمبيكمان كولتر9914591DAعداد الخلية. Z2 عداد الجسيمات / الخلايا الآلي
EndoGrade Ovalbumin (10 مجم)Hyglos (ألمانيا)321000Ovalbumin الذيفان الداخلي تم اختباره مجانا.
مصفاة الخلية 100 & micro ؛ m نايلونCorning352360مصفاة خلية (100 & micro; م أكواب شبكية المسام).
عينة من قواريرBeckman Coulter899366014عينة من قوارير Z2 للفئران الأوتوماتيكية
C57BL / 6 (CD90.2) Harlan(Rossdorf ، ألمانيا)أصبحت الشركة الآن Envigo
OT-I (خلفية C57BL / 6 ، CD90.1) Harlan(Rossdorf ، ألمانيا)زواج الأقارب في منشأتنا الحيوانية. الشركة التي تم طلبها الآن أنابيب Envigo
FACSفيشر (كورنينج)14-959-5أنابيب البوليسترين المستديرة
Corning Falcon أنابيب 15 ملFischer (Corning)05-527-90Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية
PBS (500 مل)فيشر (جيبكو)20-012-027Gibco PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، درجة الحموضة 7.2
مصباح أحمر (مصباح تسخين)ديرك روسمان GmbH (ألمانيا)405096مصباح تسخين داخلي (100 واط)
IsoFlo (Isoflurane)مختبرات أبوت (الولايات المتحدة الأمريكية)5260.04-05.مخدر إيزوفلوران (قارورة 250 مل).
آلة تخدير <قوية>منضدية / آلة تخدير متنقلة مع ممتص CO2 < / قوي >باركلاند V3000PKآلة تخدير إيزوفلوران.
RPMI 1640 متوسطGibco (موزع بواسطة ThermoFischer)11-875-093وسط أساسي مع الجلوتامين (500 مل) محلول
المضادات الحيوية Pen-Strept (Gibco)Gibco (موزعة بواسطة ThermoFischer)15-140-148Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL) مصل
بوبين الجنين (Gibco)Gibco (موزعة بواسطة ThermoFischer)10082147مصل بقري الجنين ، معتمد ، معطل بالحرارة ، من أصل أمريكي
ACK Lysing Buffer (100 مل)Gibco (موزعة بواسطة ThermoFischer)A1049201تحلل الدم الكامل من كلوريد الأمونيوم (ACK) ، مناسب لتحلل الخلايا الحمراء في معلقات الطحال أيضا
أطباق بتري البلاستيكيةNunc (موزعة بواسطة ThermoFischer)15034060 × 15 مم طبق بتري بلاستيكي ،
مرشح كتلة الخلايا(Sysmex)04-004-2317CellTrics® 50 مو ؛ م ، معقم
مقياس Kit الجسم القاع محلول خلية غير المعالجة

المراجع

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
  16. Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تقييم المواد المساعدةخلايا OT1 التائيةتكاثر CFSEتحليل قياس التدفق الخلويعزل العقد اللمفاويةتحضير خلايا الطحالالنقل التكيفي للخلايا التائيةمستضد الأوفالبومينمراقبة العرض المتقاطع
السريع في فيفو تقييم لقدرات توليد الخلايا اللمفية T السامة للخلايا Adjuvant في لتطوير اللقاحات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.