يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحقيق في تجنيد البروتين للحمض النووي آفات استخدام الليزر 405 نانومتر الصغرى-التشعيع

9.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57410

⸱

مارس 20, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

دراسة حركية إصلاح تلف الحمض النووي يتطلب نظاما للحث على الآفات في المناطق شبه نووية محددة. يصف لنا طريقة لإنشاء فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل المترجمة استخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر مزودة بليزر 405 نانومتر وتوفير إجراءات التشغيل الآلي التحديد الكمي للقوى المحركة لعوامل الإصلاح في هذه الآفات.

الملخص

استجابة تلف الحمض النووي (DDR) يستخدم عدد كبير بروتينات لكشف والإشارات، وإصلاح الحمض النووي آفات. تحديد هذه الاستجابة أمر بالغ الأهمية لفهم آليات صيانة الجينوم. دراستهم منذ التعيين والصرف من البروتينات في الآفات ديناميكية للغاية، يتطلب القدرة على توليد ضرر الحمض النووي على نحو سريع ومحدد مكانياً. هنا، نحن تصف إجراءات لحمل محلياً تلف الحمض النووي في الخلايا البشرية باستخدام متاحة عموما المسح الضوئي ليزر [كنفوكل] مجهر مجهزة بخط ليزر 405 نانومتر. تراكم الصيانة الجينوم يمكن تقييم العوامل في المشارب الليزر الفلورة (إذا كان) أو في الوقت الحقيقي باستخدام البروتينات معلم مع الصحفيين الفلورسنت. استخدام هيستون فوسفوريلاتيد H2A. X (γ-H2A.X) والنسخ المتماثل البروتين A (الجيش الوطني الرواندي) كعلامات، الأسلوب يوفر القرار كافية تميز العوامل المعينين محلياً من تلك التي انتشرت في الكروماتين المجاورة. كذلك نقدم البرامج النصية المستندة إلى إيماجيج لرصد كفاءة الحركية من البروتين ريلوكاليزيشن في الحمض النووي تلف المواقع. تبسط هذه التحسينات إلى حد كبير دراسة ديناميات التسريح وإعادة الإدماج.

المقدمة

الخلايا تتعرض باستمرار للمصادر الداخلية والخارجية لتلف الحمض النووي التي تهدد سلامتهم الجينوم. التسريح وإعادة الإدماج هو فرقة من إشارات المسارات التي كشف، وإشارة، وإصلاح آفات الحمض النووي للحفاظ على استقرار المجين. في الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل فواصل (دسبس)، يحدث التسريح وإعادة الإدماج أساسا على اثنين من منصات التكميلية: γ-H2A.X-المسمى الكروماتين ومنطقة الحمض النووي (سدنى) واحد-الذين تقطعت بهم السبل ريسيكتيد عادة مغلفة بالملزمة ssDNA مجمع الجيش الوطني الرواندي1،2.

الأشعة فوق البنفسجية-الليزر الجزئي-تشعيع الخلايا قبل توعية مع thymidine التماثلية 5-برومو-2 ' ديوكسيوريديني (بردو) أو صبغ الحمض النووي تريهيدروتشلوريدي (بيت، هويشت 33342) إيثوكسيد بيسبينزيميدي يخلق مزيجاً آفات الحمض النووي بما في ذلك (فواصل واحد-الذين تقطعت بهم السبل SSBs) ودسبس التي تحظى التسريح وإعادة الإدماج مترجمة في كل من الكروماتين و ssDNA منصات3،4. الأعمال السابقة أظهرت أنه يمكن التمييز التوظيف عوامل الصيانة الجينوم لهذه المنصات مميزة اثنين في جهاز تسوية المنازعات استخدام الطاقة العالية من الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر (335-365 نانومتر) جنبا إلى جنب مع لو2،5. مجاهر مجهزة بأجهزة الليزر هذه مكلفة كما أنها تتطلب ليزر ذات طاقة عالية ومكرسة أهداف نقل الأشعة فوق البنفسجية-أ يجعلها الآن أقل انتشارا في الأوساط الأكاديمية والمستحضرات الصيدلانية من المسح الضوئي الليزر مجاهر [كنفوكل] مع 405 نانومتر الليزر خطوط. دراسة البروتين التوظيف وتبادل في المواقع الدقيقة المشع تنتفي أيضا بتحليل الصورة اليدوية الشاقة المطلوبة لوصف السلوك الديناميكي لعوامل الصيانة الجينوم.

وهنا نعرض أن توعية قبل الخلايا مع وصمة عار الحمض النووي بردو أو بيت متبوعاً باستخدام التشعيع الصغير 405 نانومتر ليزر في مجهر [كنفوكل] مشتركة تتيح رصد ديناميات عامل صيانة الجينوم في الآفات الحمض النووي. يسمح استخدام γ-H2A.X أو مفارز الجيش الوطني الرواندي معقدة كعلامات منصة جنبا إلى جنب مع التراص z لزيادة عمق الحقل و deconvolution لتحسين القرار المجرب تميز العوامل التي يعينون محلياً إلى دسبس من تلك التي امتدت إلى المجالات الكروماتين الكبيرة المحيطة بالآفة الأولية. ويساعد هذا التصنيف الفرعي وفقا للمكونات النووية داخل متميزة صقل الأدوار المحتملة للبروتينات أونتشاراكتيريزيد المعينين للمواقع الدقيقة المشع. وعلاوة على ذلك، نحن نقدم البروتوكولات مريحة والأمثل خطوط الأنابيب لسرعة تحليل ديناميات عوامل الصيانة الجينوم باستخدام برمجيات المصدر المفتوح فيجي (توزيع إيماجيج)6،،من78. هذه التحسينات على أساليب الصغرى-التشعيع الحالية تقديم الدراسة للتسريح وإعادة الإدماج الممكنة في تقريبا أي إعداد مختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-توعية قبل الخلايا

  1. 24 ساعة قبل التجربة الصغرى-التشعيع، البذور 40,000 الخلايا U2OS كل بئر في 1 x DMEM التي تحتوي على 10% FBS في الثقافة 8-بئر الشرائح مع قيعان ميكرومتر سميكة 170 ساترة تشبه الزجاج/البوليمر لضمان نفاذية القصوى 405 نانومتر أشعة الليزر وتصوير ممتاز مع المسح الضوئي ليزر مقلوب مجهر [كنفوكل]. في حالة استخدام ميكروسليدي 8-جيدا، استخدام 500 ميليلتر من وسائل الإعلام أو الحلول كل جيدا لجميع العلاجات اللاحقة وخطوات الغسيل من البروتوكول.
    ملاحظة: سبب بهم مورفولوجيا مسطحة، خلايا U2OS التقيد الجيد، ونواة كبيرة، تيسير الكشف عن البروتين التوظيف في المواقع الدقيقة المشع ولكن يمكن استخدام أنواع الخلايا ملتصقة الأخرى حسب الحاجة. تكون الخلايا وينبغي من الناحية المثالية حوالي 80% المشع كونفلوينسي وقت تشعيع الصغيرة زيادة العدد الخلايا في التجربة. قد يؤدي التقاء عالية جداً في دورة الخلية التعديلات التي يمكن التشويش مسارات إصلاح محددة مثل جزئ المتجانسة التي تجري خلال مراحل دورة الخلية9S و G2.
  2. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5% CO2، وثم توعية قبل الخلايا مع (الخطوة 1.3) بردو أو (الخطوة 1، 4) بيت (هويشت 33342).
    ملاحظة: لمراقبة التوظيف حية من بروتين اهتمام (POI) للآفات الحمض النووي، ترانسفيكت أو ترانسدوسي بلازميد الحمض النووي تحمل مزيجاً بين بروتين فلوري و 24 البوي ح بعد البذر الخلية. 24 ساعة بعد-transfection/توصيل، قبل توعية والصغرى-تشعيع الخلايا لرصد تجنيد البوي في مواقع تلف الحمض النووي في الوقت الحقيقي.
  3. لزيادة عدد دسبس المتولدة عن المعرض إلى 405 نانومتر الليزر، إضافة 10 ميكرون من بردو لوسائط الإعلام عن 24 ساعة قبل الصغرى-التشعيع. قبل الصغرى-التشعيع، استخدام ميكروبيبيتي، شطف الخلايا مرتين مع المتوسطة دون الفينول الحمراء لضمان التعرض القصوى من الخلايا إلى 405 نانومتر الليزر.
  4. وبدلاً من ذلك، يعامل الخلايا لمدة 15 دقيقة مع بت في 10 ميكروغرام/مل في وسيلة مناسبة في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية. بعد العلاج، شطف مرتين مع المتوسطة دون الفينول الأحمر قبل الصغرى-التشعيع.

2-مايكرو-تشعيع الخلايا

  1. حدد مجهر [كنفوكل] مناسبة المسح الضوئي الليزر.
    ملاحظة: أجريت التجارب المقدمة هنا على نظام مجهر مجهزة 50 ميغاواط 405 نانومتر ليزر خط وهدف نفط 63 × 1.4 فتحه عددية. لتوليد دسبس، كانت الخلايا الدقيقة المشع في 1 X التكبير المسح الضوئي في 1,024 x 1,024 بكسل والميدان (بيكسل ميكرومتر 0.21 في 63 X التكبير) وفي وضع أحادي الاتجاه في المايكروثانيه 8/بكسل. طاقة الليزر المستخدمة كانت 25 في المائة و 80 في المائة لبيت-بردو-قبل-توعية والخلايا، على التوالي. لمساعدة المستخدمين في تكوين النظام الخاص بهم، وتم قياس طاقة الليزر الهدف بعد على نظام عرض استخدام مقياس طاقة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. القياسات التي تناظر 2.6 ميغاواط و 7.0 ميغاواط لبيت-بردو-قبل-توعية والخلايا، على التوالي.
  2. قم بتشغيل المجهر ودائرة البيئة.
    1. تعيين الدائرة إلى 37 درجة مئوية مع 5% CO2 قبل أن توضع العينات في حاضنة المسرح لتجنب الضغوط غير الضرورية إلى الخلايا وضمان متجانسة الإدماج حركية عبر التجارب.
  3. حدد الحقل (الحقول) مع الخلايا موزعة جيدا وضبط التركيز وتسجيل موقفهم لتيسير اقتناء الصورة بعد البروتوكول إذا. الحصول على صورة واحدة على الأقل التي ستكون بمثابة نقطة مرجعية ضرر قبل رصد حركية البروتين التجنيد بعد التشعيع الصغرى.
    ملاحظة: كما يمكن استخدام السفن الثقافة الشبكية لتسهيل توطين الخلايا الدقيقة المشع في الخطوات اللاحقة.
    1. للتجارب إذا كان استخدام الخلايا المسمى بيت، ضبط التركيز على الخلايا باستخدام الليزر 405 نانومتر في قوة الليزر أدنى كاف لتصور الخلايا تفاديا لضرر الحمض النووي لا مبرر لها.
      1. تجنب استخدام الفلورية ويديفيلد لضبط التركيز على الخلايا الملطخة ببيت كما سوف تحفز ضوء الأشعة فوق البنفسجية المنبعثة من المصباح تلف الحمض النووي في مواقع مضيئة.
    2. في حالة استخدام الخلايا المسماة بردو، ضبط التركيز باستخدام التباين التدخل التفاضلية (DIC) أو تصوير المرحلة-التباين بالنظر إلى الميزات الفرعية النووية مثل نوكليولي.
    3. إذا كان استخدام الخلايا معربا عن النقاط المهمة المسماة فلوريسسينتلي، حدد المستوى البؤري مع كثافة fluorescence الممثل.
      ملاحظة: تجنب الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية جداً من نقطة مهمة قد تؤدي الترجمة artifactual overexpression قوية. بالإضافة إلى ذلك، حدد الخلايا التي تعبر عن البوي على مستويات مماثلة (مختارة من الحيوانات المستنسخة مستقرة ينصح بشدة لتقليل الاختلافات في مستويات التعبير والتوظيف البوي).
  4. تكوين المجهر للخطوة الصغيرة-التشعيع استخدام الفلورية-الانتعاش بعد _module فوتوبليتشينج (فراب) للنظام.
    ملاحظة: المعلمات الأكثر أهمية لأخذها في الاعتبار عند وضع نظام المجهر لتجارب التشعيع الصغرى: إنتاج الطاقة من 405 نانومتر الليزر، عدد مرات التكرار (أي عدد المرات التي سوف تذهب الليزر عبر نفس إحداثيات)، عدد وحدات البكسل والميدان (في 63 X التكبير والقرار 1,024 x 1,024، 1 بيكسل = 0.21 ميكرومتر)، ويسكن في المرة الواحدة لكل بكسل. وكل هذه العوامل سوف تؤثر على كمية الطاقة التي تواجه الخلايا وهكذا مقدار ونوع ما من الحمض النووي الضرر الذي تم إنشاؤه (انظر مناقشة لزيادة الجرعة الأمثل المعلومات).
  5. استخدام الوحدة النمطية فراب نظام المجهر، مايكرو-تشعيع الخلايا.
    ملاحظة: في معظم النظم الصغيرة-تشعيع الخلايا متعددة يمكن أن يؤديها في حقل واحد كبقع أو خطوط/المستطيلات (عادة 1-2 ميكرومتر واسعة). عند إجراء تصوير العيش من البروتينات يسمى فلوريسسينتلي فورا بعد الضرر، والحد الجزئي-التشعيع لعدد صغير من الخلايا كل حقل لأنه سيؤدي إلى الوقت الذي استغرقه الصغرى-تشعيع كل خلية تحريض المتأخر للتسريح وإعادة الإدماج. هذا مهم خاصة عند رصد البروتينات التي يعينون بسرعة إلى آفات الحمض النووي.
  6. بعد الصغرى-التشعيع، وضع مرة أخرى على الشرائح المتعددة جيدا أو لوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 للمدة المطلوبة قبل تجهيز العينات لحالة (القسم 5) أو الشروع فورا في تصوير لايف (الفرع 3).
    1. وكخطوة أولى، إصلاح الخلايا في غضون دقائق قليلة، وحتى بضعة ساعات تشعيع بعد للبروتوكول إذا. اعتماداً البوي، قد تختلف حركية التوظيف. عادة، سيتم ترجمة سريعة جداً للآفة البروتينات التي المرتبطة الكروماتين في دسبس و SSBs وتتم إزالتها في بعض الأحيان داخل 5 دقيقة. سيتم توظيف في نقاط زمنية لاحقة متى انخرطت إليه استئصال بعض العوامل مثل تلك التي تجمع في سدنا والبقاء هناك لمدة ساعة (انظر الشكل 1 والمرجع4).

3-يعيش-تصوير بروتينات يسمى فلوريسسينتلي

  1. القيام بتصوير الوقت الفاصل بين الخلايا الصغيرة المشع. للبروتينات التي يعينون بسرعة للآفات، بضع ثوان لكل إطار سيكون مثاليا، ولكن قد يكون للبروتينات التي ترجمة إلى المنطقة المتضررة في وقت لاحق(مثلاً استئصال العوامل)،الحصول على أداء كل 1-2 دقيقة حتى يتحقق من هضبة.
    ملاحظة: تقليل قوة الليزر للحصول على الصور لتجنب تبيض إلى أقصى حد ممكن وضمان أن التوظيف البروتين في مواقع الضرر لا تصل إلى الإشباع التي من شأنها الحيلولة دون إشارة التحديد الكمي ويحلل اللاحقة (انظر تحليل البيانات القسم 4). على نظام المقدم، وتم التصوير مع 63 X/1.4 نفط باستخدام وقت يسكن المايكروثانيه 8/بكسل، والقرار 1,024 x 1,024، 1 X التكبير موضوعية، وفي المتوسط من 2. ملاحظة قد تحتاج هذه المعلمات الأمثل للنظم و/أو تجارب مختلفة أخرى.
  2. الصغير-تشعيع الخلايا الموجودة في حقول إضافية حتى قياسات حركية تم الحصول عليها للخلايا 15-30. تكرار التجارب 3 مرات على الأقل في replicates البيولوجية لضمان الدقة وإمكانية تكرار نتائج من حركية التوظيف.
    ملاحظة: عند تكييف هذا البروتوكول إلى نظام [كنفوكل] محددة، قد يكون من المفيد البدء برصد حركية توظيف عامل صيانة الجينوم المعروف المسمى فلوريسسينتلي (مثلاً، 53BP1-التجارة والنقل، RPA32-التجارة والنقل، و ما إلى ذلك). استخدام التصوير العيش لتحسين الظروف الدقيقة-التشعيع سوف تسمح للمستخدم لاختبار معلمات متعددة سريعاً.

4-توظيف تحليل حركية

  1. قم بتثبيت البرنامج المساعد ميكرويرادييشن تحليل10 في برمجيات تحليل الصورة فيجي11.
  2. افتح الصور المكتسبة في فيجي. حدد "أضرار محلل" من القائمة المنسدلة الإضافات في جناح التحليل ميكرويرادييشن. اتبع المطالبات لتحديد منطقة خلفية للفائدة (ROI) (عادة 3 × 3 ميكرومتر)، ورويس المشع وغير المشع في كل خلية المشع الدقيقة.
    1. يعني استخدام رويس من نفس الحجم للتقليل من التحيز المحتمل في كثافة إشارة. للصور المكتسبة، وتشمل أيضا الإطار تشعيع سابقة واحدة على الأقل التي ستستخدم كأساس لمراقبة التوظيف في المواقع الدقيقة المشع.
    2. متى تم جمع جميع البيانات العائد على الاستثمار عبر سلسلة كاملة من الوقت الفاصل بين، احفظ الملف تم إنشاؤها بواسطة البرنامج المساعد الذي يحتوي على النتائج كملف txt (ملف محدد بعلامة جدولة) أو csv (محدد بفواصل ملف). يحتوي هذا الملف على قياسات لكثافة يعني لكل نقطة الوقت وكل عائد الاستثمار (كثافة الخلفية يعني، "يعني كثافة غير" المشع، ويعني كثافة الإشعاع).
      ملاحظة: البرنامج المساعد تلقائياً ينقص كثافة الخلفية (أناب) من شدة رويس المشع (أناs) ورويس غير المشع (أنان). كما أنه يحسب نسبة بين القيمتين (انظر الصيغة أدناه) لتصحيح فوتوبليتشينج (Irradiated/عدم-المشع).
      figure-protocol-1
      يحسب البرنامج المساعد أيضا تطبيع بين النقطة الزمنية الأولى (القيمة المعينة إلى 1) وجميع النقاط مرة أخرى لكل نواة (نسبة بالنسبة للنقطة المرة الأولى). يمكن الاطلاع على معلومات إضافية في موقع البرنامج المساعد10.
  3. الرسم البياني في إثراء النسبية يعني في المناطق الصغيرة المشع على مر الزمن وإجراء التحليل باستخدام البرنامج المساعد لكافة الخلايا الدقيقة المشع (خلايا على الأقل 15 – 30). حساب الأخطاء المعيارية للوسط لكل بيانات نقطة، وارسم لهم.
    1. تأكيد الاختلافات بين هذين الشرطين التجريبية بأداء الطالب تيفي حركية التوظيف-اختبارات لكل نقطة بيانات.

5-إذا كان البروتوكول

  1. إعداد الحلول إذا. إعداد الحل قبل/بعد-اكستراكشن (PBS المثلج x 1 يحتوي على 0.25% Triton X-100)، الغسيل الحل (PBS 1 x تحتوي على 0.05% توين-20)، عرقلة الحل (س 1 برنامج تلفزيوني يحتوي على جيش صرب البوسنة 3% و 0.05% توين-20)، وتثبيت الحل (بارافورمالدهيد 3% + السكروز 2% في برنامج تلفزيوني 1 x) في أنابيب البولي بروبلين مخروطية الشكل.
    ملاحظة: ميكروسليدي 8-بئر واحدة، 10 مل من محلول قبل/بعد-اكستراكشن، 50 مل من الغسيل 10 مل من محلول عرقلة الحل و 5 مل من محلول التثبيت المطلوبة.
    1. إعداد تثبيت الحل.
      1. تحت غطاء كيميائية، مزيج 400 مل الماء المقطر مزدوجة (ddH2س) مع 15 غرام بارافورمالدهيد و 30 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم N 10 في قارورة Erlenmeyer ل 1.
      2. إغلاق الحاوية، والحرارة عند 65 درجة مئوية على لوحة ساخن محرض مغناطيسي بينما إثارة لجعل بارافورمالدهيد تماما.
      3. استخدام ماصة 25 مل إضافة 50 مل 10 × برنامج تلفزيوني، وآثاره، وتصفية باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر.
      4. إضافة 10 جرام سكروز وإكمال إلى 500 مل مع ddH2o.
      5. قاسمة الحل في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل؛ تخزين في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. إعداد الأنوية تلطيخ الحل بتمييع حل أسهم 1 ملغ/مل من 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي 1:1,000 (DAPI) في برنامج تلفزيوني 1 x.
  2. باستخدام ميكروبيبيتي، بعناية قم بإزالة الوسائط من آبار شرائح مجهرية متعددة جيدا أو لوحات وتغسل فورا مع 500 ميليلتر للغسيل إذا كان الحل عن طريق تغيير الحل مرتين دون انتظار.
    ملاحظة: إذا كانت البيانات المقدمة هنا تم الحصول عليها باستخدام خلايا تزرع في شرائح مجهرية 8-البئر التي تم غسلها والمحتضنة في 500 ميليلتر من جميع الحلول. وينبغي تعديل وحدات التخزين تبعاً للحاويات ثقافة الخلية المستخدمة من قبل المجربون. بالإضافة إلى ذلك، أداء البروتوكول إذا بعناية فائقة كما يمكن بسهولة فصل الخلايا من أسفل الزجاج/البوليمر. استخدام ميكروبيبيتي لكل حل التغييرات لتقليل الخسائر في الخلية.
  3. تبني على الجليد لمدة 5 دقائق مع 500 ميليلتر من المثلج إذا كان الحل قبل/بعد-اكستراكشن ودوامه بلطف باليد ل 15 – 30 ثانية القيام باستخراج ما قبل الخطوة التي يزيل معظم البروتينات هيولى ونوكليوبلاسميك وتكبير الإشارة من الكروماتين/ العوامل المرتبطة بالحمض النووي.
  4. تغسل مرتين مع 500 ميليلتر من الحل إذا كان الغسيل.
  5. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 500 ميليلتر من الحل إذا كان التثبيت. بدلاً من ذلك، استخدم حل بارافورمالدهيد مسبقة صنع (3 – 4%) لخطوة التثبيت.
  6. تغسل مرتين مع 500 ميليلتر من الحل إذا كان الغسيل.
  7. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق في 500 ميليلتر من المثلج إذا ما قبل/بعد-اكستراكشن الحل ودوامه الشريحة بلطف باليد لتنفيذ الخطوة بيرميبيليزيشن.
  8. تغسل مرتين مع 500 ميليلتر من الحل إذا كان الغسيل.
  9. تبني على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 500 ميليلتر من الحل إذا كان حظر.
  10. إزالة الحل حظر استخدام ميكروبيبيتي واحتضان بين عشية وضحاها في دائرة هوميديفيد في 4 درجات مئوية مع 250 ميليلتر الأجسام الأولية المخفف في عرقلة الحل.
    ملاحظة: أنها ممارسة جيدة لأداء في الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية تسلسلياً لتجنب النتائج الملموسة المحتملة للتعريب المشارك. متى تم تنفيذ الضوابط المناسبة، في نفس الوقت احتضان الأجسام الأولية تسريع العملية.
  11. أغسل أربع مرات لمدة 5 دقائق في 500 ميليلتر إذا الغسيل الحل مع الانفعالات لطيف (60 دورة بالدقيقة في دوار).
  12. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية مع 250 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف في عرقلة الحل في دائرة هوميديفيد.
    ملاحظة: حماية العينات من الضوء عند إضافة الأجسام المضادة الثانوية المسمى فلوريسسينتلي.
  13. أغسل أربع مرات كل منها لمدة 5 دقائق في 500 ميليلتر إذا الغسيل الحل مع الانفعالات لطيف.
  14. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 500 ميليلتر من PBS x 1 يحتوي على 1 ميكروغرام/مل DAPI وصمة عار الأنوية.
  15. تغسل مرتين مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x وترك الخلايا في 500 ميليلتر من 1 × الحل برنامج تلفزيوني للتصوير.
  16. استخدام الشرائح الشبكية أو مواقف المرحلة المسجلة، العثور على الخلايا المشع الدقيقة باستخدام علامة تلف الحمض النووي تتسم جيدا (مثلاً، γ-H2A.X، RPA32، إلخ).
  17. صورة الشرائح الثقافة المتعددة جيدا أو لوحات في جميع القنوات ذات الصلة باستخدام الإعدادات المناسبة في مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
    ملاحظة: في النظام، وقدم تم التصوير مع 63 X/1.4 نفط باستخدام وقت يسكن المايكروثانيه 8/بكسل، والقرار 1,024 x 1,024، 1 X التكبير موضوعية، وفي المتوسط من 2. ملاحظة قد تحتاج هذه المعلمات الأمثل للنظم و/أو تجارب مختلفة أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عقب الصغرى-التشعيع، والخلايا يسمح لاسترداد لفترة محددة من الزمن تبعاً لطبيعة الجينوم صيانة البروتينات1،12. ستتم معالجة دسبس نوكليسيس، الأكثر على نطاق واسع خلال مراحل دورة الخلية، لإنشاء منطقة محدودة من سدنى التي هي مغلفة بسرعة بالجيش الوطني الرواندي وأخرى عوامل الصيانة الجينوم9S و G2. هذه المنطقة ssDNA محاط الكروماتين الذي يتم تعديله على نطاق واسع أثناء التسريح وإعادة الإدماج لتنظيم التوظيف وتبادل أخرى عوام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، يسمح الليزر 405 نانومتر الصغرى تشعيع الخلايا قبل توعية مع بيت أو بردو الجيل مترجمة من آفات الحمض النووي، بما في ذلك دسبس داخل نواة الخلايا البشرية ملتصقة. الحركية للتسريح وإعادة الإدماج في هذه دسبس مماثلة لتلك التي تم إنشاؤها مع أساليب أخرى في الخلايا حقيقية النواة9،،من1819. بتر جهاز تسوية المنازعات في مواقع المشع الدقيقة يؤدي إلى توليد ssDNA التي يمكن اتباعها باستخدام جسم استهداف RPA32 أو انصهار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل بالعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الكندي الهندسية [اكتشاف منحة 5026 صباحا] وقبل جيل المقبل من "العلماء منحة دراسية" من "جمعية أبحاث السرطان" [21531 إلى صباحا]. ونحن نشكر لوسير جان-فرانسوا لتوفير مراقبة الجودة الممتازة للبرامج النصية "بيثون فيجي" والمشورة بشأن التحليل الإحصائي. ونشكر الدكتورة ستيفاني يازينسكي أ على الوصفة الحل إذا كان التثبيت. ونحن نشكر بول-لودوفيك اتييري للمساعدة في قياس قوة الليزر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أوليمبوس FLUOVIEW FV3000 مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر بالرنينبرنامج أوليمبوس
فلو فيو FV3000 (الإصدار 2.1)أوليمبوس
405 نانومتر ليزرمتماسكمصدر الإشعاع
حاضنة مجهر AIO-UNO-OLYUS-1OkolabOKO-UNO-1
60X / 1.4 زيتأوليمبوس هدف الغمر
8 شرائح ثقافة بئر على الغطاء الزجاجي (X-well)Sarstedt94.6190.802
U2OS الساركوما العظمية خط الخلية البشريةATCCHTB-96خطوط الخلايا المستقرة  
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)ThermoFisherD1306تحذير سام
5-bromo-2′-deoxyuridine ( BrdU) سيجما ألدريتش59-14-3
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتش30525-89-4تحذير
بيسبنزيميد السام H 33342 (Hoechst 33342)ThermoFisher62249
ألبومين مصل الأبقار (BSA)ThermoFisherBP1600-100
Trypsin EDTA 0.1٪ ThermoFisher15400-054
Triton X-100   ؛BioShopTRX777.100
Tween-20 ThermoFisherBP337-500
سكروز  BioShopSUC507
كاشف التعداء JetPRIME Polyplus114-07
ProLong Diamond Antifade mountant مع DAPI   ؛ThermoFisherP36962
DMEM 1X ، + الفينول الأحمرWisent   ؛319-005-CL
DMEM 1X, - الفينول الأحمرWisent319-051-CL
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Wisent 080-150
الفأر المضاد للجسم المضاد ل RPA32Abcamab21751: 500 ل IF
Rabbit المضاد ل & جاما ؛ -H2A. X الأجسامالمضادة خلية الإشارات  9718S1: 500 ل IF
Rabbit Anti-53BP1الأجسام المضادة لإشارات الخلية 4937S1: 500 ل IF
Rabbit Anti-PRP19 الأجسام المضادةAbcamab276921: 500 ل IF
الماعز المضادة للأرانب IgG Alexa Fluor 647إشارات الخلية   ؛4414S1:250 ل IF
الماعز المضادة للفأر  IgG Alexa Fluor 488 إشارات الخلية 4408S1:250 لبرنامج
تحليل الصور في فيجي مفتوح المصدر https://fiji.sc
1918-K عداد الطاقة  مع مستشعر 918D-SL-0D3نيوبورت
الموضوعي

المراجع

  1. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  2. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
  3. Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
  4. Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
  5. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
  6. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  7. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
  10. Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
  13. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
  14. Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
  15. Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
  16. Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
  17. Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
  18. Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
  19. Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
  20. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237(2015).
  21. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
  22. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  23. Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
  24. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68(2009).
  25. Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  26. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  27. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  28. Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
  29. Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

استجابة تلف الحمض النوويالمجهر البؤريهيستون H2AXبروتين التضاعف Aتحليل ImageJوحدة FRAPبروتوكول التألق المناعي
التحقيق في تجنيد البروتين للحمض النووي آفات استخدام الليزر 405 نانومتر الصغرى-التشعيع
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.