السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

ملخص

هنا، نقدم أسلوب هندسة الجينوم من C. ايليجانس باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر-Cas9 وقوالب إصلاح يعتمد التماثل.

الملخص

يكرر المتناوب اينتيرسبيرسيد بانتظام متفاوت المسافات (كريسبر)-كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (Cas9) نظام الدفاع المناعي التكيفي بدائية يختارهم كأداة قوية لهندسة الجينوم حقيقية النواة الدقيقة. وهنا نقدم طريقة سريعة وبسيطة باستخدام الكشف دليل واحد تشيميريك (سجرنا) وكريسبر-Cas9 ريبونوكليوبروتينس (رنبس) لتوليد الطفرات الجينوم في C. ايليجانسكفاءة ودقة. يصف لنا خط أنابيب لاختيار الأهداف سجرنا وإصلاح موجه التماثل (HDR) قالب تصميم، إلى كريسبر-Cas9-رنب والتسليم واستراتيجية التنميط التي تمكن من تحديد هوية قوية وسريعة من الحيوانات تم تحريرها بشكل صحيح. نهجنا لا يسمح بتوليد السطحية وتحديد نقطة الجينوم المطلوب الحيوانات المسخ فحسب، بل أيضا يسهل الكشف عن الآليلات إينديل معقدة أخرى في حوالي 4-5 أيام مع الكفاءة العالية وفحص خفض عبء عمل.

المقدمة

جذريا حولت التطورات التكنولوجية الحديثة وتسريع القدرة على الضبط مهندس الجينوم. على وجه الخصوص، النظام كريسبر-Cas9، الذي يعتمد على اندونوكليسي الموجهة بالحمض النووي الريبي Cas9 لحمل فاصل حبلا مزدوجة (جهاز تسوية المنازعات) قرب تسلسل الهدف الفائدة، قد استخدمت على نطاق واسع دقة هندسة الجينوم الأغلبية من طراز الكائنات المستخدمة في بحوث الطب الأحيائي^1،2،،من³⁴. إلى حد كبير، وقد مقفلة استخدام كريسبر-Cas9 الجينوم التحرير حتى في الأنواع الصعبة مثل ايليجانس جيم-⁵. بغض النظر عن الأنواع، تولد الطفرات مع الجينوم كريسبر-Cas....

البروتوكول

جميع الإجراءات التجريبية ورعاية الحيوان يتبع المبدأ التوجيهي من المعاهد الوطنية للصحة والرعاية المؤسسية الحيوان واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ميشيغان. استخدام حلول خالية من رناسي و "الماصة؛" نصائح طوال البروتوكول. تنظيف مساحة العمل والماصات وأنابيب، وأجهزة الطرد المركزي مع الحل "تطهير رناسي" اتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد).

1-سجرنا اختيار الهدف

1. باستخدام مستعرض ويب، افتح صفحة ويب: http://crispor.tefor.net⁸
   1. مدخل ~ 60 قاعدة أزواج (bp) لتسلسل المرافقة التحرير المنشود لمصلحة (أي 30 بي بي 5 'و 3' لتحرير المطلوب).
   2. حدد الجينوم ايليجانس كاينورهاب....

النتائج

الطفرات في الإنسان فائق أكسيد الفاءق 1 (SOD1) تمثل ~ 10-20% من الأسرى التصلب العضلي الجانبي، مرض الأعصاب مدمرة تؤدي دائماً إلى الشلل والموت¹⁷. الهيئة العامة للسدود البشرية-1 بروتين تقحم مصانة تقاسم تشابه هوية و 70% 55% مع البروتين الأحمق-1 C. ايليجانس (الشكل 1B). تثبت البساطة والجدوى والكفاءة للنهج القائم على "رنب" كريسبر-Cas9، نحن استهداف الجين ايليجانس جيم-الهيئة العامة للسدود-1 إدخال متغير G93A البشرية الم.......

المناقشة

نظام كريسبر-Cas9 أداة قوية وفعالة لتعديل التحديد الجينوم من طراز الكائنات الحية. هنا، علينا أن نظهر أن سجرناس تشيميريك²⁰ مقترنة بتمكين قوالب HDR سودن توليد الطفرات الجينوم في C. ايليجانسذات كفاءة عالية. الأهم من ذلك، نبدي أن التسليم رنب تنتج عالية الكفاءة التحرير عندما يتم استخدام الأسفار كعلامة اختيار المشارك، تسليط الضوء على سهولة وموثوقية تقنية.

معظم أساليب كريسبر-Cas9 لهندسة الجينوم C. ايليجانس تعتمد على خلفيات وراثية محددة أو استراتيجيات كريسبر co.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
CRISPRevolution sgRNA  EZ كيت	سينثيجو إنك.		الخيميريك sgRNA
خالية من Nuclease TE	Synthego Inc.	مزود بمجموعة sgRNA مجموعة EZ
من Nuclease المياه	Synthego Inc.	مزود بمجموعة sgRNA مجموعة EZ
4 nmole Ultramer DNA Oligo	Integrated DNA Technologies		ssODN HDR قالب
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS	تقنيات الحمض النووي المتكاملة	1078728	بروتين Cas9
pCFJ90 & nbsp ؛	Addgene	19327	Pmyo-2 :: mCherry Marker Plasmid
KCl	Sigma	P5405
HEPES	Sigma	H4034
DNA Clean & amp المكثف	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start عالي الدقة 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
زجاج البورسليكات الزجاجي Micropipettes	أدوات	Sutter BF100-78-10	OD: 1.0 مم. معرف: 0.78 مم
Trizma Hydrochloride	Sigma	T5941
MgCl2< / sub>	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap محلول إزالة التلوث	فيشر Scientific	AM9780

خالية