مقالة منهجية

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

7.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57518

⸱

أبريل 30, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم أسلوب هندسة الجينوم من C. ايليجانس باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر-Cas9 وقوالب إصلاح يعتمد التماثل.

الملخص

يكرر المتناوب اينتيرسبيرسيد بانتظام متفاوت المسافات (كريسبر)-كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (Cas9) نظام الدفاع المناعي التكيفي بدائية يختارهم كأداة قوية لهندسة الجينوم حقيقية النواة الدقيقة. وهنا نقدم طريقة سريعة وبسيطة باستخدام الكشف دليل واحد تشيميريك (سجرنا) وكريسبر-Cas9 ريبونوكليوبروتينس (رنبس) لتوليد الطفرات الجينوم في C. ايليجانسكفاءة ودقة. يصف لنا خط أنابيب لاختيار الأهداف سجرنا وإصلاح موجه التماثل (HDR) قالب تصميم، إلى كريسبر-Cas9-رنب والتسليم واستراتيجية التنميط التي تمكن من تحديد هوية قوية وسريعة من الحيوانات تم تحريرها بشكل صحيح. نهجنا لا يسمح بتوليد السطحية وتحديد نقطة الجينوم المطلوب الحيوانات المسخ فحسب، بل أيضا يسهل الكشف عن الآليلات إينديل معقدة أخرى في حوالي 4-5 أيام مع الكفاءة العالية وفحص خفض عبء عمل.

المقدمة

جذريا حولت التطورات التكنولوجية الحديثة وتسريع القدرة على الضبط مهندس الجينوم. على وجه الخصوص، النظام كريسبر-Cas9، الذي يعتمد على اندونوكليسي الموجهة بالحمض النووي الريبي Cas9 لحمل فاصل حبلا مزدوجة (جهاز تسوية المنازعات) قرب تسلسل الهدف الفائدة، قد استخدمت على نطاق واسع دقة هندسة الجينوم الأغلبية من طراز الكائنات المستخدمة في بحوث الطب الأحيائي1،2،،من34. إلى حد كبير، وقد مقفلة استخدام كريسبر-Cas9 الجينوم التحرير حتى في الأنواع الصعبة مثل ايليجانس جيم-5. بغض النظر عن الأنواع، تولد الطفرات مع الجينوم كريسبر-Cas9 على أساس تحرير النظام يعتمد على ثلاثة عناصر أساسية: 1) Cas9 اندونوكليسي, 2) دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) الذي يوجه اندونوكليسي Cas9 إلى تسلسل مستهدفة، ومستخدم 3) تصميم إصلاح موجه التماثل (HDR) قالب يحتوي على edit(s) المطلوب لمصلحة2.

وهناك العديد من الطرق التي يمكن استخدامها لإدخال استهداف سجرنا و Cas9 نوكلاس داخل الخلايا بما في ذلك بلازميد، والجيش الملكي النيبالي، والفيروسية على أساس التسليم أساليب6. في الآونة الأخيرة، برز التسليم المباشر من قبل الرصاصية سجرنا-Cas9 ريبونوكليوبروتينس (رنبس) كأداة قوية وفعالة في الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد تحرير7. التسليم المباشر من قبل الرصاصية كريسبر-Cas9 "رنبس" له العديد من المزايا المتميزة، إلا وهي: 1) رنبس تجاوز الحاجة إلى النسخ الخلوية وسرعة مسح الترجمة، 2) رنبس، التي قد تزيد من خصوصية بتخفيض الوقت المتاح ل إيقاف المستهدفة الانقسام، و 3) رنبس يحتوي على لا عناصر أجنبية في الحمض النووي/الحمض النووي الريبي التي تلتف الأخذ بتسلسل غير أصلية في مجال المجين المضيف من خلال التكامل عشوائي. معا، هذه السمات يحتمل تقديم انفجار لم تدم طويلاً لتحرير كريسبر على الهدف مع التقليل من الآثار خارج الهدف.

يمكننا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة لإدخال تغييرات الجينوم الخاصة بالموقع في C. ايليجانس. ويشمل هذا البروتوكول تستهدف سجرنا وتصميم قالب واحد اليغنوكليوتيد الذين تقطعت بهم السبل (سودن) تقرير التنمية البشرية، وإلى رنب سجرنا-Cas9 والتسليم، واستراتيجية الوراثي لتحديد الحيوانات تم تحريرها بشكل صحيح لا لبس فيه. باستخدام هذه الاستراتيجية، ليس فقط يمكن استرداد التغييرات المطلوبة الخاصة بالموقع، ولكن يمكن أيضا استرداد الطفرات إينديل غير محددة أخرى. وهكذا، استراتيجيتنا تصاريح توليد سلسلة الاليلي استخدام استراتيجية واحدة، حيثما مونو الاليلي، استقصاء المعلومات الجينية على حد سواء، ويمكن أن تتولد طفرات إينديل في الجيل1 و.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الإجراءات التجريبية ورعاية الحيوان يتبع المبدأ التوجيهي من المعاهد الوطنية للصحة والرعاية المؤسسية الحيوان واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ميشيغان. استخدام حلول خالية من رناسي و "الماصة؛" نصائح طوال البروتوكول. تنظيف مساحة العمل والماصات وأنابيب، وأجهزة الطرد المركزي مع الحل "تطهير رناسي" اتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد).

1-سجرنا اختيار الهدف

  1. باستخدام مستعرض ويب، افتح صفحة ويب: http://crispor.tefor.net8
    1. مدخل ~ 60 قاعدة أزواج (bp) لتسلسل المرافقة التحرير المنشود لمصلحة (أي 30 بي بي 5 'و 3' لتحرير المطلوب).
    2. حدد الجينوم ايليجانس كاينورهابديتيس من القائمة المنسدلة.
    3. حدد "عزر المتاخمة بروتوسباسير" (20 شركة بريتيش بتروليوم-نج-SpCas9، SpCas9-HF1، eSPCas9 1.1) من القائمة المنسدلة.
    4. انقر فوق إرسال. في صفحة النتائج، اختر تسلسل الهدف المرتبة الأعلى الأقرب إلى التحرير للفائدة. إذا كان هناك لا المواقع المستهدفة المناسبة ضمن تسلسل الإدخال bp 60 ترافقه، توسيع سلسلة استعلام ما يصل إلى 100 شركة بريتيش بتروليوم (أي 50 بي بي أي من جانبي المطلوب تحرير).
  2. من مصدر متاح، مثل سينثيجو، الحصول على سجرنا هدف 20-مير مع المواصفات التالية: نمول 3؛ أية تعديلات.
  3. عند استلام، الطرد المركزي سجرنا المجففة بالتبريد التي تحتوي على أنبوب في > ز س 12,000 لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 60 ميليلتر من TE نوكلاس خالية للأنبوب، وإعادة تعليق بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً من 15-20 مرة باستخدام ماصة P200. يكون التركيز النهائي 50 ميكرومتر.

2-التماثل-توجه إصلاح قالب تصميم

  1. تصميم يتضمن قالب HDR سودن: 1) تحول اهتمام و 2) موقع فريد من نوعه في إطار قيود endonuclease 3) طفرة صامت واحد أو كليهما من فئة الخدمات العامة ضمن التسلسل بام نج 4) 50 بي بي 5 '3' التماثل الأسلحة والمرافقة الطفرة الأولى والأخيرة. (الشكل 1) 9 , 10.
    1. إذا لم يكن ممكناً الطفرة في التسلسل بام نج، استحداث الطفرات الصامتة 5-6 ضمن تسلسل الاعتراف الهدف سجرنا لمنع انشقاق سجرنا وساطة قالب تقرير التنمية البشرية سودن.
  2. من مصدر متاح، مثل إيدتدنا، الحصول "اليغنوكليوتيد أولترامير الحمض النووي" مع المعلمات التالية: مقياس: نمول 4؛ صياغة: لا شيء؛ تنقية: الملحي القياسي.
  3. عند استلام، الطرد المركزي سودن المجففة بالتبريد التي تحتوي على أنبوب في > ز س 12,000 لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بلطف إعادة تعليق سودن بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر في ddH نوكلاس خالية2س من بيبيتينج صعودا وهبوطاً من 15-20 مرة باستخدام ماصة P200.

3-تصميم التنميط الإشعال

  1. تصميم كتاب تعيين المرافقة بتعديل الجينوم لتوليد ~ 400-700 بي بي بكر أمبليكون11.
  2. تحسين ظروف ركوب PCR لإنتاج أمبليكون واحدة ومحددة11.

4-إعداد مزيج حقن

  1. الطرد المركزي الكواشف 1 الجدول بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. في الترتيب المسرود، إضافة الكواشف الجدول 1 إلى أنبوب بكر نوكلاس مجاناً.
  3. مزيج دقيق من بيبيتينج برفق صعودا وهبوطاً 10 مرات مع ماصة P20.
  4. احتضان حقن المزيج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

5-حقن البروتوكول

  1. تحميل ميكروبيبيتي حقن مع حوالي نصف مزيج حقن12. حفظ المتبقي مزيج الحقن في حالة إبرة حقن السدادات أو فواصل.
  2. كسر نصيحة ميكروبيبيتي حيث أن المبادرة ~ 20-30 وتنتج حل تتدفق تدريجيا12.
    ملاحظة: أكبر قطرها نصائح تؤثر سلبا على الصحة الحيوانية وانخفاض الغلة ذرية1 و.
  3. حقن الشباب 10-15 الديدان الكبار في كلا ذراعيه جوندال إذا أمكن12. إذا لم يكن الأمر كذلك، حقن في الذراع جوندال واحدة غير كافية.
  4. السماح بحقن الحيوانات (ف0) لاسترداد ح 1-2 في درجة حرارة الغرفة على صفيحة وسائط الإعلام (NGM) نمو السلكية OP50 المصنفة 35 ملم. وفي وقت لاحق، اختيار الحيوانات0 ف حقن واحدة إلى لوحات NGM الفردية المصنفة OP50 35 مم دودة سلك البلاتين باستخدام12.

6-الشاشة ف0 لوحات و mCherry(+) واحدة و1ثانية

  1. حقن بعد يومين، تحديد ف0 لوحات تتضمن ذرية1 و الإعراب عن مشري في البلعوم باستخدام ستيريوميكروسكوبي نيون (الشكل 1، يوم 2-3). اختر لوحات0 ف الثلاث التي تحتوي على معظم الحيوانات1 mCherry(+) و.
  2. من كل مجموعة من ثلاث لوحات0 ف مختارة، واحد 8-12 mCherry(+) و1 الحيوانات لما مجموعة 24-36 mCherry(+) و1s استخدام دودة بيك (الشكل 1، يوم 2-3).
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يكون خص الحيوانات mCherry(-) من هذه اللوحات0 ف، ولكن احتمال تحديد بشكل صحيح تحرير الحيوانات الكثير أقل (الشكل 2A).
  3. السماح للموظف1و سيلففيرتيليزي ووضع البيض لمدة 1-2 يوما في درجة حرارة الغرفة.

7-واحد دودة بكر والتنميط

  1. 1-2 أيام وضع البيض، وبعد نقل s1و إلى قبعات أنبوب قطاع بكر الفردية التي تحتوي على 7 ميليلتر من "دودة تحلل المخزن المؤقت" استخدام اختيار دودة (الجدول 2و الشكل 1يوم 4-5).
  2. أجهزة الطرد المركزي أنابيب PCR بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة جلب الحيوانات إلى قاع الأنبوبة، وتجميد أنابيب في-80 درجة مئوية ح 1.
    ملاحظة: الديدان يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
  3. الديدان المجمدة في ثيرموسيكلير استخدام البرنامج التالي: عقد 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.
  4. إنشاء PCR mastermix كما هو مبين في الجدول 3.
  5. إضافة ميليلتر 21 من PCR mastermix في تنظيف أنابيب PCR ثم قم بإضافة 4 ميليلتر من تحلل دودة من الخطوة 3. كذلك استخدام ماصة مزيج وتشغيل البرنامج بكر اتباع إرشادات المصنعين (انظر الجدول المواد).
  6. تنقية PCR ردود الفعل باستخدام مجموعة نظيفة الحمض النووي والتركيز، اتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد). الوت الحمض النووي عن طريق إضافة 10 ميليلتر المياه إلى العمود بزيادة ونقصان.
  7. إنشاء mastermix إنزيم التقييد كما هو مبين في الجدول 4.
  8. إضافة 10 ميليلتر من mastermix إنزيم التقييد لكل تفاعل PCR تنظيفها واحتضانها ح 1-2 في13من 37 درجة مئوية.
  9. منفصلة هضم منتجات PCR على 1.5% [اغروس] هلام تشغيل في 120 V استخدام المخزن المؤقت تريس-خلات-يدتا (تاي) x 114.

8-تحديد وتسلسل التحقق من الحيوانات المحرر

  1. فحص عينات إنزيم يهضم وجود العصابات التي تشير إلى إمكانية تحرير الحيوانات14 (الشكل 1، يوم 4-5).
    ملاحظة: تحميل عنصر تحكم N2 التعرف على الطفرات إينديل المحتملة التي يمكن ملاحظتها كالتغيرات في حجم الفرقة و/أو إنزيم التقييد غير متوقعة وغير المعقدة الهضم تباين أنماط.
  2. بعد تحديد الحيوانات المحرر المحتملة، استخدم ميليلتر 3 المتبقية من تحلل دودة وكرر الرد بكر. لا تنظيف أو تقييد إنزيم هضم تفاعل PCR بعد الانتهاء من البرنامج. تحميل رد بكر على 1% [اغروس] هلام، منفصلة واستخراج الفرقة باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل15 (انظر الجدول المواد).
  3. سانغر التسلسل16 جل استخراج الحمض النووي باستخدام F1 التمهيدي للتعرف على الحيوانات بشكل صحيح تم تحريره (الشكل 1A)
    ملاحظة: هيتيروزيجوتي سوف تحتوي على ما يلي: مضافين قمم نظراً لوجود نوع البرية وهندستها اليل.
  4. للحصول على الحيوانات متماثل من الحيوانات متخالف المحررة التي تم التحقق منها، واحد 8-12 الحيوانات2 وقم بإجراء الخطوات 7-8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الطفرات في الإنسان فائق أكسيد الفاءق 1 (SOD1) تمثل ~ 10-20% من الأسرى التصلب العضلي الجانبي، مرض الأعصاب مدمرة تؤدي دائماً إلى الشلل والموت17. الهيئة العامة للسدود البشرية-1 بروتين تقحم مصانة تقاسم تشابه هوية و 70% 55% مع البروتين الأحمق-1 C. ايليجانس (الشكل 1B). تثبت البساطة والجدوى والكفاءة للنهج القائم على "رنب" كريسبر-Cas9، نحن استهداف الجين ايليجانس جيم-الهيئة العامة للسدود-1 إدخال متغير G93A البشرية الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نظام كريسبر-Cas9 أداة قوية وفعالة لتعديل التحديد الجينوم من طراز الكائنات الحية. هنا، علينا أن نظهر أن سجرناس تشيميريك20 مقترنة بتمكين قوالب HDR سودن توليد الطفرات الجينوم في C. ايليجانسذات كفاءة عالية. الأهم من ذلك، نبدي أن التسليم رنب تنتج عالية الكفاءة التحرير عندما يتم استخدام الأسفار كعلامة اختيار المشارك، تسليط الضوء على سهولة وموثوقية تقنية.

معظم أساليب كريسبر-Cas9 لهندسة الجينوم C. ايليجانس تعتمد على خلفيات وراثية محددة أو استراتيجيات كريسبر co...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ونشكر أعضاء المختبر التسول لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وقدمت سلالات كاينورهابديتيس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). البحث في المختبر بيغ معتمد من قبل المنح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 NS094678) ورابطة ضمور العضلات (MDA382300) إلى A.A.B.

شكر وتقدير

لا يوجد أي تضارب في المصالح المتصلة بهذا التقرير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CRISPRevolution sgRNA  EZ كيتسينثيجو إنك.الخيميريك sgRNA
خالية من Nuclease TESynthego Inc.مزود بمجموعة sgRNA مجموعة EZ
من Nuclease المياهSynthego Inc.مزود بمجموعة sgRNA مجموعة EZ
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN HDR قالب
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSتقنيات الحمض النووي المتكاملة1078728بروتين Cas9
pCFJ90 & nbsp ؛Addgene19327Pmyo-2 :: mCherry Marker Plasmid
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA Clean & amp المكثفZymo ResearchD4004
Zymoclean Gel DNA Recovery KitZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start عالي الدقة 2X Master MixNew England BiolabsM0494L
Proteinase KSigmaP2308
زجاج البورسليكات الزجاجي MicropipettesأدواتSutter BF100-78-10OD: 1.0 مم. معرف: 0.78 مم
Trizma HydrochlorideSigmaT5941
MgCl2< / sub>SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap محلول إزالة التلوثفيشر ScientificAM9780
خالية

المراجع

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C elegans sgRNA HDR ssODN mCherry

مقالات ذات صلة