نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد حجم المسام في المبيضين مثقف للفئران الصغار دون تقطيع المسلسل. استخدام الجهاز كاملة الفلورة والأنسجة المقاصة، تمزيقها المادية يتم استبداله بتقطيع الضوئية. هذا الأسلوب من إعداد العينة والتصور يحافظ على سلامة الجهاز ويسهل الآلي التقدير الكمي للخلايا المحددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البحوث في مجال البيولوجيا الإنجابية الثدييات غالباً ما ينطوي على تقييم الصحة العامة المبايض والخصيتين. على وجه التحديد، في الإناث، وغالباً ما يتم تقييم اللياقة البدنية المبيض بتصور والتحديد الكمي للمسام وبويضات. نظراً لأن المبيض أنسجة ثلاثية الأبعاد معتمة، النهج التقليدية تتطلب مشقة تشريح الأنسجة إلى مقاطع المسلسل العديد من أجل تصور خلايا في جميع أنحاء الجهاز كامل. وعلاوة على ذلك، لأنه عادة ما يستتبع القياس الكمي بهذا الأسلوب سجل مجموعة فرعية فقط من أقسام مفصولة بقطر تقريبي البويضات، عرضه لعدم دقتها. هنا، هو وصف بروتوكول يستخدم بدلاً من ذلك إزالة الأنسجة الجهاز كله وتلطيخ الفلورة من المبايض الماوس وضع تصور للمسام وبويضات. ومقارنة بالأساليب التقليدية، هذا البروتوكول مفيد لتصور خلايا داخل المبيض لأسباب عديدة: 1) المبيض لا تزال سليمة في جميع أنحاء عينة التحضير والتجهيز؛ 2) يمكن فحص المبايض صغيرة، وصعبة للقسم، بسهولة؛ 3) يتحقق القياس الكمي الخلوية أكثر سهولة ودقة؛ و 4) الجهاز كله تصويرها.
المقدمة
من أجل دراسة تكوين الخلوية والسمات المورفولوجية المبايض الثدييات، العلماء غالباً ما تعتمد على التجارب في فيفو متبوعاً بتلوين إيمونوهيستولوجيكال المبايض البارافين المضمنة. أكثر مؤخرا رغم ذلك، ثقافة الجهاز المبيض كله قد ثبت أن بديل فعال لدراسة وظيفة المبيض1،2،،من34 لأن هذه التقنية يمكن أن يقترن بالتصور أفضل و أدوات القياس الكمي. تقليديا، تحليلاً مورفولوجيا المبيض يعتمد على إعادة بناء هيكل المبيض ثلاثي الأبعاد من مقاطع المسلسل البارافين مضمن، ولكن، بالإضافة إلى كونها شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، متسلسل تقطيع الأنسجة البارافين مضمن لا ضمان إعادة البناء السليم للجهاز، وكثيراً ما فقدت أقسام أو أمر بسوء في العملية.
بالإضافة إلى التحديات التقنية المرتبطة بتقطيع المسلسل، وهناك أيضا اختلافات في الأساليب المستخدمة بشكل روتيني لتقدير أرقام جريب كل المبيض5،6. تباين المنهجية المستخدمة حاليا ويضعف التحليل التلوي لاحتياطي المبيض عبر الدراسات5،7. على سبيل المثال، يمكن أن تختلف أرقام جريب من المقالات والبحوث المختلفة بالوقت أو أكثر بين الإعمار إنمائية مماثلة ضمن سلالة معينة6. هذه الاختلافات الكبيرة في التحديد الكمي جريب المبلغ عنها يمكن أن يؤدي إلى الارتباك وعرقلت إجراء مقارنات عبر الدراسة. تجريبيا، يؤديها النهج التقليدية لتحديد مقدار جريب من مقاطع المسلسل العد المسام عدد محدد سلفا من المقاطع (مثلاً كل الخامسة، العاشرة، أو قسم آخر). ينشأ تقلب في تهم المسام باستخدام هذا النهج ليس فقط من التواتر في المقاطع التي يتم عدها، بل أيضا من الاختلافات في سمك الفرع، والخبرة التقنية في توليد مقاطع المسلسل5،6. بالإضافة إلى قابليته، عيب آخر لتقطيع الأنسجة التقليدية أن تقطيع المبايض صغيرة من صغار الحيوانات تنطوي على تحديات خاصة وتعتمد اعتماداً كبيرا على اتجاه الأنسجة8.
البروتوكول أدناه يصف أسلوب1 ثقافة مبيض تستخدم بشكل روتيني ولكن يحسن إلى حد كبير على التقدير الكمي جريب التقليدية عن طريق استبدال تمزيقها المادية مع أنسجة تطهير وتمزيقها الضوئية باستخدام مجهر [كنفوكل]8 ،9. مسح استخدام الغمر الأنسجة (بدون الحاجة لنضح transcranial أو التفريد) في اليوريا والسوربيتول-يستند إلى نظام الحل (مثلاً، ScaleS(0)10) ثبت متوافق مع إيمونوستينينج ويسمح للحد من مسح وقت دون المساس بعمق للتصوير. أساليب أخرى تم الإبلاغ عنها (مثلاً، ScaleA2،من810، سيدب11، كليارت12و ClearT212) أما أكثر تستغرق وقتاً طويلاً أو عدم السماح بالدقة البصرية متعمقة للعينة. تقطيع الضوئية مفيد لأنه أقل كثيفة العمالة ويحتفظ الجهاز هيكل ثلاثي الأبعاد7،8. فائدة أخرى من هذا النهج هو أن إعداد العينات التي لا تتطلب الكواشف باهظة التكلفة لإزالة الأنسجة، ويمكن أن تجري بسهولة نسبية.
على وجه التحديد، البروتوكول وصف قد الأمثل المبايض الماوس المستزرعة في يوم الولادة خمسة لكن أجريت على المبايض بدءاً من يوم الولادة 0-10. الأسلوب يجعل استخدام نظام الثقافة المبيض الذي تولي الأنسجة بالطبع للغشاء الذي كان هو مثقف، تسهيل التعامل مع الجهاز والتلاعب. يمكن استخدام نظام الثقافة ووصف للحفاظ على اكسبلانتيد المبايض لمدة تصل إلى 10 أيام وتقييم ظروف تجريبية مختلفة كيف قد تتداخل مع بقاء البويضات13. تتم باستخدام الصورة غير التجارية تجهيز الحزمة فيجي-إيماجيج14 إجراء التقدير الكمي ووصف ويمكن أن تجري في معظم أجهزة الكمبيوتر الشخصية. وعلاوة على ذلك، الصور المستخدمة للقياس الكمي يمكن أن يتاح على نطاق واسع للمجتمع العلمي، مما يسمح للتحليل التلوي مستقبلا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جامعة كورنيل "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) وافق جميع الأساليب الموصوفة هنا، تحت بروتوكول عام 2004-0038 لهيئة الأركان المشتركة.
1-إعداد الصكوك وثقافة وسائل الإعلام
- مسح منطقة عمل نظيفة مع التبييض 10% والسماح التبييض تبقى على سطح منطقة العمل لمدة 5 دقائق على الأقل. بعد 5 دقائق، قم بإزالة المبيض الزائد مع مناشف ورقية نظيفة و 70% إيثانول (EtOH). تنظيف مجهر تشريح دقيق مع 70% EtOH.
ملاحظة: من المهم أن تكون مساحة العمل على الأقل شبه معقم لتفادي تلوث ثقافات الجهاز. - التفاف الملقط نظيفة ومقص مع منشفة ورقية مبللة ب 70% EtOH حتى وقت الاستخدام.
ملاحظة: قد تختلف أدوات تشريح مثالية وفقا للعمر/حجم المبيض. يتم الحصول على أفضل النتائج من استخدام واحد حاد الصغرى تشريح مقص، هما خير نصيحة الملقط (أما رقم 5 أو 55) وواحدة مايكرو تشريح قزحية مقص. - في أنبوب مخروطي، جعل 50 مل من وسائط الثقافة المبيض والدافئة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- لجعل المبيض الثقافة المتوسطة4، الملحق 1 × وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى (MEM) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 25 مم (حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 4 (حبيس)، 100 وحدة/مل البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين B (مثلاً 45 مل MEM، 5 مل حرارة إبطال FBS و 1.25 مل هيبيس 0.5 مل من الأسهم x 100 البنسلين، ستربتوميسين، والامفوتريسين ب).
- إعداد لوحات وإدراج قبل ثقافة المبيض.
- في غطاء زراعة الأنسجة، إضافة 1 مل من المبيض الثقافة المتوسطة إلى طبق استنبات الأنسجة 35 ملم.
- نقع قبل إدراج غشاء مع المتوسط الثقافة. إضافة وسائط كافية، عادة حوالي 0.55 مل الواحد جيدا، إلى لوحة زراعة الأنسجة الناقل 24-جيدا، ومكان ثقافة خلية إدراج في البئر. تأكد من أن يلامس الغشاء الإدراج وسائط الإعلام.
- إعداد عدد لوحات 35 ملم والآبار مع إدراج ثقافة الخلية وفقا للعدد المتوقع من المبايض في التجربة. وضع لوحات 35 ملم يحتوي على 1 مل من وسائط الثقافة ولوحة الحامل 24-جيدا التي تحتوي على وسائط الثقافة ويدرج في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، وحاضنة2 O الغلاف الجوي.
- ترتيب لوحة الساخن بجوار نطاق التشريح وتعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. تبقى 37 درجة مئوية، 5% CO2 وحاضنة2 O الغلاف الجوي بالقرب من الغرفة تشريح.
2-تشريح المبيض وثقافة الجهاز
ملاحظة: يمكن تشريح المبيض في درجة حرارة الغرفة طالما تعرض لدرجة حرارة غير المثالية الحد الأدنى.
- Euthanize الفئران الإناث في يوم ما بعد الولادة 5، بقطع الرأس، في وقت واحد.
ملاحظة: يجب أن تجري القتل الرحيم وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC الحالي في مرفق حيث يتم إجراء البحث. - رش الحيوان مع 70% EtOH. مكان الحيوان على رأس منشفة ورقية جافة تحت مجهر التشريح. ضع طبق استنبات الأنسجة 35 ملم تحتوي على وسائط الثقافة المبيض قريبة من مجهر التشريح.
- بالملقط أو تشريح الجزئي قزحية مقص، جعل شق من خلال الجلد من الحيوان وفي تجويف البطن، باستخدام الحذر لا إلى خفض في الأمعاء. دفع الأمعاء خارج تجويف البطن وتحديد مكان المبايض. استخراج المبايض ووضعها في طبق استنبات الأنسجة 35 ملم تحتوي على وسائط الثقافة.
- مرة واحدة وقد تم تشريح المبيض من الحيوان، قم بزيادة التكبير مجهر التشريح من أجل تصور أفضل المبايض وأي أنسجة المرفقة. مع تنظيف الملقط تلميح جيد، وإزالة جميع الأنسجة غير المبيض، مثل بورصة والأنسجة الدهنية. احرص على الاحتفاظ المبايض سليمة عند إزالة الأنسجة غير المبيض المرفقة.
- متى المبايض معزولة، وضع الزوج في إدراج ثقافة الخلية قبل غارقة بليت 24-جيدا الناقل (الرجوع إلى الخطوات 1.4.2 و 1.4.3) وضبط مستوى الصوت على المديين المتوسط والتأكد من أنها كافية لإبقاء الجهاز رطبة (دون تماما غمر عليه).
تنبيه: كن حذراً لا لكزه ثقب في الغشاء لإدراج ثقافة الخلية عند نقل المبيض. - مكان اكسبلانتيد الأجهزة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، وحاضنة2 O الغلاف الجوي.
- كرر الخطوات من 2.1-2.6 حتى يتم تشريح المبايض كل حيوان ووضعها في خلية ثقافة إدراج لوحة 24-البئر الذي يحتوي على مستنبت المبيض.
- تغير المتوسط الثقافة المبيض كل يومين، استخدام استعد مختبرين وسائط المبيض من حمام مائي 37 درجة مئوية والشروع في الجزء 3 من البروتوكول في الوقت المطلوب التجريبية النقطة.
3-الأنسجة التثبيت
- في أنبوب مخروطي 15 مل، إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) (مثلاً، إضافة 2 مل 16% PFA الميكروسكوب الإلكتروني الصف إلى 6 مل من برنامج تلفزيوني س 1).
تنبيه: منهاج عمل بيجين هو مادة خطرة وينبغي التعامل معها تحت غطاء كيميائية. - إصلاح المبايض مثقف، دون إزالة الأنسجة من إدراج الثقافة، التي تغطي النسيج مع الحل منهاج العمل 4% الطازجة. ختم حواف اللوحة بمادة لاصقة بلاستيكية (لتجنب التبخر) ووضع العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: تجنب بغية تسهيل المناولة وسلامة الأنسجة، مما أدى إلى تشريد المبايض من إدراج ثقافة الخلية في جميع أنحاء الإجراء بأكمله. مفيدة للتعامل مع المبايض مثقف يعلق على سطح الإدراج يتم دون إتلاف أو فقدان الجهاز. - شطف الأنسجة 3 x مع 70% EtOH وأما المضي قدما إلى الخطوة 4.1 أو مخزن في قنينات التﻷلؤ مليئة 70% EtOH في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.
ملاحظة: إذا كان استخدام أنسجة اندوجينوسلي الإعراب عن البروتينات الفلورية، وتخزين العينات مع 70% EtOH قد يقلل كثيرا من الإشارات. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تشطف الأنسجة والمخزنة في برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.2% (نان3). غير أن نان3 عالية السمية ويشكل خطرا استنشاق خطيرة. جعل الحل الأسهم في غطاء الدخان والتعامل مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة مثل قفازات معطف والنتريل مختبر.
4-كله جبل الفلورة
- ضع الأنسجة الثابتة في برنامج تلفزيوني 1 x في الرايت للحد ني ح 4 قبل الخطوة permeabilization 4.3.
- إعداد حل حظر وحل بيرميبيليزيشن.
- إعداد permeabilization الحل كما هو موضح. إلى برنامج تلفزيوني 1 x، إضافة 0.2 ٪ الكحول البولي فينيل (PVA) و 0.1% الصوديوم بورهيدريد (نأبه4) الحل (من 12 wt.% حل هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) م 14) 1.5% البولي إثيلين غليكول ثالثي-أوكتيلفينيل الاثير (المنظفات غير الأيونية الفاعل). في أنبوب 50 مل مخروطية، إضافة 5 مل 10 × برنامج تلفزيوني، 0.1 غرام من بولي و 50 ميليلتر من نأبه4ميليلتر 750 من المنظفات غير الأيونية الفاعل، ثم أضف عالي النقاوة المياه تصل إلى 50 مل وتحرض جيدا في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح الخليط تماما في الحل.
- إعداد حل حظر كما هو موضح. لبرنامج تلفزيوني 1 x، إضافة الفاعل غير الأيونية 0.1% المنظفات، 0.15% من 2.5 م جليكاين الأس الهيدروجيني 7.4، مصل الماعز العادي 10%، 3% ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.2% نان3، 100 وحدة/مل البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، و 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين باء إعداد حل الأسهم 2.5 جليكاين متر بتذويب ز 93.8 من جليكاين في الماء عالي النقاوة إلى حجم 500 مل نهائي (درجة الحموضة 7.4) وحل أسهم من 10% نان3 بتذويب 5 غ في 50 مل الماء عالي النقاوة؛ ثم، في أنبوب 50 مل مخروطية إعداد حل حظر بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني x 10، 50 ميليلتر من المنظفات غير الأيونية الفاعل، ميليلتر 750 حل الأسهم جليكاين، 5 مل مصل الماعز، 1.5 غرام من جيش صرب البوسنة، 1 مل من نان3 حل الأسهم ، و 0.5 مل أسهم x 100 البنسلين، ستربتوميسين، والامفوتريسين B. إضافة الماء عالي النقاوة حتى وحدة تخزين نهائي لتصفية 50 مل وحقنه بالحل النهائي.
- إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني 1 x من القنينة ثم قم بإضافة حل permeabilization كافية لتغرق المبايض تماما. ضع العينة في حل بيرميبيليزيشن على شاكر مداري (مثلاً، نوتاتور) في درجة حرارة الغرفة ح 4.
ملاحظة: قد تختلف وقت الحضانة وفقا لسمك الجهاز. - استبدال الحل بيرميبيليزيشن بما يكفي حل حظر إلى غمر تماما المبايض. ختم القنينة بمادة لاصقة بلاستيكية وتترك الأنسجة حضانة للحد أدنى 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري.
- إعداد إضعاف جسم أساسي في عرقلة الحل وفقا لورقة البيانات الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: لاحظ أن الأجسام المضادة ليست كلها متوافقة مع وكيل التخليص. متوسط حجم كل عينة بحاجة هو ما يقرب من 750 ميليلتر.- لتقدير حجم بويضتها، استخدم TAp63 (العلامة النووي البويضيه) ومفه (العلامة هيولى الخلية الجرثومية).
ملاحظة: الأجسام المضادة التي تستخدم في الصور الفلورة الماوس المضادة-p63 وارنب المضادة-مفه). يمكن أن يكون الحل جسم الأولية المعاد 2 x أو أكثر إذا كانت مخزنة في 4 درجات مئوية بين تلطيخ البروتوكولات والتعامل معها بشكل صحيح لتجنب النمو الجرثومي.
- لتقدير حجم بويضتها، استخدم TAp63 (العلامة النووي البويضيه) ومفه (العلامة هيولى الخلية الجرثومية).
- وضع الإدراج التي تحتوي على الأنسجة في صفيحة 24-جيدا وإضافة ميليلتر حوالي 750 من حل جسم الأولية. التأكد من أن المبايض مغمورة تماما. ختم اللوحة بمادة لاصقة بلاستيكية للتقليل من التبخر وترك الأنسجة حضانة لمدة 4 أيام في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري.
- إعداد الحل الغسيل.
- إعداد الحل الغسيل كما هو موضح. جعل 1 x PBS، إضافة المنظفات غير الأيونية الفاعل بولي و 0.15 في المائة 0.2%. في أنبوب 50 مل مخروطية، إضافة 5 مل 10 × برنامج تلفزيوني، 0.1 غرام بولي، ميليلتر 75 من المنظفات غير الأيونية الفاعل والماء عالي النقاوة حتى وحدة تخزين نهائي من 50 مل.
- إزالة تمييع جسم الابتدائي وإضافة كمية سخية من الحل الغسيل. تأكد دائماً تغرق في المبيضين. السماح المبايض نقع في الحل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري.
- استبدال الحل الغسيل واحتضان على شاكر المداري ح 2 أو أكثر.
- كرر الخطوة 4.9 مرة أخرى.
- إعداد إضعاف جسم الثانوية في عرقلة الحل.
ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية التي تستخدم صبغة الفلورسنت 488 الماوس المضادة المثارة في الماعز وصبغة الفلورسنت 594 أرنب المضادة المثارة في الماعز. راجع الخطوة رقم 4، 5. بحاجة لمتوسط حجم كل عينة. - إزالة الحل الغسيل من المبايض وإضافة حل جسم الثانوية. حماية العينات من الضوء (لوحة التفاف مع رقائق الألومنيوم) وختم اللوحة بمادة لاصقة البلاستيكية لتقليل التبخر. احتضان العينات في شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
ملاحظة: مواصلة حماية العينات من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم خلال جميع الخطوات اللاحقة الحضانة. - إزالة الحل جسم الثانوية من العينات وإضافة الحل الغسيل. تبني على شاكر مداري ح 8.
ملاحظة: إذا كان المطلوب هو تلطيخ 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، إضافة 50 نانوغرام/مل من DAPI للخطوة الأولى من المياه والصرف الصحي (~ 8 ح الحاضنات). - استبدال غسالة الحل بالنسبة المياه والصرف الصحي بين عشية وضحاها.
- أثناء إعداد الحل المقاصة (انظر القسم 5)، تحل محل بين عشية وضحاها الغسيل الحل مع حل جديد وتبقى العينات على شاكر المداري عند درجة حرارة الغرفة.
5-المبيض المقاصة والتصوير
- إعداد ScaleS(0) مسح الحل.
- إعداد ScaleS(0) مسح الحل10 عن طريق إضافة الكواشف في نسبة معينة: 40% D-(-) السوربيتول (w/v)، 10% والغليسيرول واليوريا 4.3 م 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، الرقم الهيدروجيني 8.1 (مثلاً في أنبوب 50 مل مخروطية، إضافة 2.5 مل الجلسرين، 10 غم السوربيتول ، 5 مل من [دمس]، و 12 مل من اليوريا م 9 لإجمالي حجم 25 مل. مزيج الحل بعكس عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وديغا قبل الاستخدام).
- إزالة الحل الغسيل وغمر العينات في مسح الحل. للحصول على أفضل النتائج المحافظة على العينات على شاكر المداري.
- استبدال الحل المقاصة 2 × يوميا حتى يصبح شفاف (حوالي 2 أيام) من الأنسجة.
- مرة واحدة يتم مسح الأنسجة، إعداد العينة للتصوير بعناية إزالة الغشاء إدراج تحتوي على المبايض مثقف مع غرامة تلميح مشرط ووضع العينة على شريحة زجاجية.
- الشروع في تصوير العينات في مجهر قادرة على تقطيع الضوئية.
6-البويضيه الكمي
ملاحظة: هناك العديد من برامج الكمبيوتر المختلفة التي تكون قادرة على تحديد الخلايا. المبين أدناه بروتوكول البويضيه التقدير الكمي باستخدام حزمة تجهيز الصورة غير تجارية، فيجي-إيماجيج14.
- استخدام إسقاط مسطح أقصى شدتها من سلسلة الصورة Zالمكدس لعلامات محددة الخلوية للفائدة (بدون قناة DAPI)، تحويل الصورة إلى صورة 8 بت أبيض وأسود ضمن نوع في الصورة القائمة المنسدلة القائمة.
- ضمن القائمة المنسدلة صورة ، تسليط الضوء على علامة التبويب ضبط ثم ثم حدد عتبة.
- ضبط الحد الأدنى إلى مستوى أفضل ويحدد كل البويضيه الفردية يدوياً. حالما يتم تحديد المستوى، انقر فوق تطبيق لتوليد صورة أبيض وأسود. وبمجرد الانتهاء، تحديد حجم العينة التي تحدد استخدام رمز شكل بيضوي أو حر .
ملاحظة: فيجي-إيماجيج على خيارات مختلفة لتهذيب الصورة التي سيتم استخدامها لتحديد حجم الجسيمات. على سبيل المثال، في عملية | ثنائي علامة التبويب، وهناك الخيارات المختلفة التي يمكن استخدامها لتحسين الكشف عن ما سيتم حسابها. في الشكل 4، كانت الخيارات المستخدمة تفريد المسام أفضل أرد، متبوعاً سد الثغرات، وأخيراً لمستجمعات المياه. - إطار تحليل القائمة المنسدلة، حدد تحليل الجزيئات. تعيين المعلمات وفقا للدقة المطلوبة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتضمن هذا البروتوكول 6 خطوات رئيسية بعد تشريح المبيض، كما هو مبين في الشكل 1. الشكل 2 , الشكل 3 , الشكل 4 إبراز السمات الأكثر رواية لهذا البروتوكول، التي تشمل الاستفادة المثلى أنسجة إزالة المبيضين والأنسجة كله البويضيه الكمي استخدام فيجي-إيماجيج. ويبين الشكل 2A الصور جاهل 5 أيام بعد الولا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويتطلب دراسة استنساخ الثدييات استخدام والتحديد الكمي للخلايا المتخصصة غير قابلة بشكل روتيني لزراعة الخلايا. السابقين فيفو ثقافة أنظمة غير فعالة في الحفاظ على المبيض والمسام صلاحية1،15. خلال الثقافة المبيض، الأنسجة يتطلب مساحة أكبر لتبادل المواد الغذائية عن طريق نشر. ولذلك، الماوس 5-القديمة يوم المبايض مثالية في الحجم والشكل لثقافة الجهاز. هذا البروتوكول هو الأمثل المبايض الاحتفاظ لمدة سبعة أيام في الثقافة، ولكن يمكن تعديل طول المبيض الثقافة وفقا لمسألة ع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر ريبيكا وليامز وجوانا ديلا كروز من "تصوير BRC كورنيل" وأندرو ريكناجيل للاقتراحات المفيدة والمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل إلى المعاهد الوطنية للصحة منحة S10-OD018516 ("مرفق" كورنيل للتصوير)، و T32HD057854 إلى J.C.B. و R01-GM45415 إلى J.C.S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مقص تشريح دقيق 4.5 بوصة ، مستقيم ، نقاط حادة | Roboz | RS-5912 | مقص تشريح دقيق |
| ملقط نمط المجوهرات 4-3 / 8 بوصة ، نمط 5 | Integra Miltex | 17-305X | ملقط ذو طرف رفيع |
| مقص قزحية مايكرو 4 بوصة ، نقاط مستقيمة وحادة | Integra Miltex | 18-1618 | مقص قزحية تشريح دقيق أو مقص زنبركي |
| 1X الحد الأدنى الوسائط الأساسية (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| سيريوم الجنين البقري | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X) | Gibco | 15240062 المستخدم في الخطوة 1.3.1 | |
| 35 مم صحن صحن معالج | بزراعة الأنسجة 430165 | ||
| Nunc™ لوحة حاملة 24 جيدا لثقافة الخلية تدرج | ThermoFisher Scientific | 141006 | حجم المسام: 8 & mu ؛ م |
| بارافورمالدهيد (PFA) علوم | المجهر الإلكتروني | 15710 | محلول 16٪ |
| محلول 1X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) خلاط | Gibco | 10010023 | |
| Nutator GyroTwister & trade ؛ | Labnet | S1000-AB | شاكر ثلاثي الأبعاد |
| مصل الماعز العادي | VWR | 103219-578 | |
| مصل الأبقار (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| أزيد الصوديوم (NaN3) | محلول بوروهيدريد الصوديوم Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| (NaBH 4< / sub>) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | استخدم الحل بدلا من شكل قرص أو مسحوق |
| كحول البولي فينيل (PVA) | سيجما ألدريتش | P8136-250G | تريتون قابل للذوبان في الماء البارد |
| ؛ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | البولي إيثيلين جلايكول ثلاثي الأوكتيل الأثير |
| مرشحات حقنة | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25 مم |
| 10 مل محاقن | BD | 309695 | |
| ماوس المضاد للجسم المضاد p63 (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | التخفيف 1: 500 |
| أرنب الأجسام المضادة ل MVH | Abcam | ab13840 | التخفيف 1:600 |
| Alexa Fluor & reg ؛ الماعز المضاد للفأر 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | التخفيف 1: 1000 |
| Alexa Fluor & reg ؛ الماعز المضاد للأرانب 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | التخفيف 1: 1000 |
| 4،6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) ؛ | ثيرموفيشر العلمي | 62248 | |
| D- (-) السوربيتول | سيجما ألدريتش | 240850-100 جرام | |
| جلسرين | سيجما ألدريتش | G9012-100 مل | |
| اليوريا | سيجما ألدريتش | U5378-500G | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما ألدريتش | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | برامج معالجة الصور | ||
| ماصات نقل البلاستيك التي يمكن التخلص | VWR | 414044-034 |
المراجع
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242(2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497(2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10(2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
