يصف لنا طريقة جديدة لإيصال بلازميد الحمض النووي في خلايا urothelial الماوس المثانة في فيفو عن طريق قسطرة مجرى البول وانهانسر. يوفر طريقة سريعة وملائمة لتوليد نماذج الماوس أصلي من أمراض المثانة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
أسلوب الرواية بلازميد الحمض النووي إيصالها إلى الماوس المثانة أوروثيليوم انهانسر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) قيمة للغاية في الكشف عن رواية رؤى البيولوجية في آليات بدء وتطور البشرية من الأمراض مثل السرطان. الفئران المحورة وراثيا والشرطي بالضربة القاضية قد استخدمت مرارا ل overexpression الجينات أو الاجتثاث في أنسجة محددة أو الخلية أنواع فيفو. ومع ذلك، يمكن توليد نماذج الماوس germline تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. ومكنت التطورات الأخيرة في تحرير تكنولوجيات وجدوى توفير والبلازميدات الحمض النووي من خلال العدوى الفيروسية الجينات السريع توليد نماذج سرطان الماوس أصلي غير germline للعديد من الأجهزة. المثانة هو جهاز الذي كان من الصعب لناقلات الأمراض الفيروسية للوصول، بسبب وجود طبقة glycosaminoglycan تغطي أوروثيليوم. هنا، يمكننا وصف طريقة جديدة وضعت في مختبر لتقديم والبلازميدات الحمض النووي بشكل فعال في أوروثيليوم المثانة الماوس في فيفو. عن طريق تقطير إينترافيسيكال من بلازميد الدنا بكاج-التجارة والنقل وانهانسر من المثانة جراحيا المكشوفة، نظهر أن يمكن تسليمها بلازميد الحمض النووي على وجه التحديد إلى الخلايا urothelial المثانة لتعبير عابر. لدينا أسلوب يوفر طريقة سريعة وملائمة أوفيريكسبريشن وضربه قاضية للجينات في المثانة الماوس، ويمكن تطبيقها على بناء جيمس سرطان المثانة وغيرها من أمراض الجهاز البولي.
المقدمة
نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) تضطلع بدور أساسي في توسيع معارفنا حول التنمية الحيوانية والجينات وظائفها في فيفو، وآليات المرض التقدم1،2. وتوضع جيمس Germline تقليديا بطريقتين. الأول هو إنشاء الفئران المعدلة وراثيا عن طريق الحقن برونوكليار من الحمض النووي بلازميد متبوعاً بزرع zygotes في الإناث بسيودوبريجنانت. والآخر هو توليد تدق-/نوك-في الفئران باقترانها مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية ووضع التركيبات. الشرطي بالضربة القاضية للجينات في نوع النسيج أو الخلية المحددة لمصلحة ينطوي على تربية الآليلات المهندسة وراثيا مع لجنة المساواة العرقية وفلكس مواقع لأجيال متعددة. العملية كلها يمكن أن تكون مكلفة وتست....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع الإجراءات الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية والأنظمة من "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كاليفورنيا سانتا كروز.
1-بلازميد وإعداد الأدوات
- لكل المثانة ترانسفيكت، وإعداد على الأقل 20 ميليلتر من بلازميد الحمض النووي (1 ميكروغرام/ميليلتر).
- إضافة 1 ميليلتر تريبان الأزرق إلى 20 ميليلتر من حل بلازميد في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. ماصة مزيج جيد.
- اﻷوتوكﻻف الجراحية جميع الصكوك وتعقيم مساحة العمل مع الإيثانول 70%. رش الأدوات الجراحية والقفازات مع الإيثانول 70% وكثيراً ما أو استخدام التعقيم حبة من زجاج عند تنفيذ الخطوات التالية للحفاظ على ظروف معقمة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وللتدليل على نجاح توصيل الجينات في أوروثيليوم المثانة، استخدمنا بلازميد15 بكاج-التجارة والنقل انهانسر. تم حقن 20 ميليلتر بلازميد والحل تريبان الأزرق عن طريق مجرى البول، وكانت تدار من النبضات الكهربائية 5. بعد 48 ساعة، ونحن تشريح المثانة الماوس ولاحظ بقع من الأسفار بروتينات فلورية خضراء تحت مجهر fluorescence تشريح، بينما سلبي التحكم في المثانة التي لم تطرأ انهانسر أظهر أي إشارة التجارة والنقل (الشكل 1A). عندما أجرينا الفلورة تلطيخ من أن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
انهانسر يعزز نفاذية غشاء الخلية، وهو عبارة عن تقنية قوية للجينات اليكتروترانسفير16. إيصال الجينات إلى القوارض الحية التي انهانسر قد استخدمت كثيرا في بيولوجيا الأعصاب الحقول17،،من1819،،من2021. تطبيقاتها المحتملة في أجهزة أخرى كثيرة لم تستكشف على نطاق واسع. على حد علمنا، لدينا الأسلوب الموصوفة هنا هو التقرير الأول لإيصال الجينات الناجحة ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أي المصالح المتنافسة.
شكر وتقدير
ونشكر الأستاذ بن تشن والدكتور تشانغ يو هوانغ كندي للمساعدة في إعداد نظام انهانسر. أيد هذا العمل منح من سانتا كروز السرطان مجموعة المزايا والمعاهد الوطنية للصحة إلى Z.A.W.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| BD 1 مل TB حقنة | فيشر | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | عالج بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الاستخدام الجراحي |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | جهاز هارفارد | 450052 | |
| Exel International Safelet IV القسطرة | فيشر Scientific | 14-841-21 | 24G ، طول 2.11 سم ، القطر الخارجي 0.045 سم |
| مقص تشريح دقيق فائق النعومة | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | عالج بنسبة 70٪ إيثانول قبل الاستخدام |
| الجراحي Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K & H حصيرة استراحة ساخنة للحيوانات الصغيرة ، 9 × 12 بوصة | أمازون | n / أ | قم بتغطية حصيرة الحرارة بالمناشف الورقية |
| مرهم العيون | فيشر | NC0849514 | |
| PBS ، pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| نصائح ماصة 200 & micro ؛ L | USA Scientific | 1111-0206 | |
| نصائح ماصة ، تناسب عالمي ؛ 0.1 إلى 10 & micro ؛ L | فيشر | 02707438 (CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | جيلسون | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | جيلسون | F144565 | |
| البلازميد CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| البلاتين tweezertrode 5 مم | جهاز هارفارد | 450489 | قطر 5 مم |
| مقص | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | علاج مع 70٪ إيثانول قبل الاستخدام الجراحي |
| سلك الخيط | Amazon | n / a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8 مم 1 مم خياطة جلدية خياطة مسطحة |
| الحبل الشريط ، سكوتش | فيشر | 19047257 | |
| Therio-gel زيوت التشحيم البيطرية | PBS صحة | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life | Technologies 15250061 | |
| V-1 سطح الطاولة نظام التخدير | VetEquip | 901806 | |
| خياطة فيكريل البنفسجي 18 "FS-2 قطع 5-0 | فيشر | NC0578475 | |
| Walgreens بوفيدون اليود 10٪ | Walgreens | 953982 | |
| مشبك الجرح | فيشر | 018045 | |
| مشبك الجرح | تطبيق فيشر | 01804 |
المراجع
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mo....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
