مقالة منهجية

أسلوب الرواية بلازميد الحمض النووي إيصالها إلى الماوس المثانة أوروثيليوم انهانسر

8.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57649

⸱

مايو 3, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف لنا طريقة جديدة لإيصال بلازميد الحمض النووي في خلايا urothelial الماوس المثانة في فيفو عن طريق قسطرة مجرى البول وانهانسر. يوفر طريقة سريعة وملائمة لتوليد نماذج الماوس أصلي من أمراض المثانة.

الملخص

نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) قيمة للغاية في الكشف عن رواية رؤى البيولوجية في آليات بدء وتطور البشرية من الأمراض مثل السرطان. الفئران المحورة وراثيا والشرطي بالضربة القاضية قد استخدمت مرارا ل overexpression الجينات أو الاجتثاث في أنسجة محددة أو الخلية أنواع فيفو. ومع ذلك، يمكن توليد نماذج الماوس germline تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. ومكنت التطورات الأخيرة في تحرير تكنولوجيات وجدوى توفير والبلازميدات الحمض النووي من خلال العدوى الفيروسية الجينات السريع توليد نماذج سرطان الماوس أصلي غير germline للعديد من الأجهزة. المثانة هو جهاز الذي كان من الصعب لناقلات الأمراض الفيروسية للوصول، بسبب وجود طبقة glycosaminoglycan تغطي أوروثيليوم. هنا، يمكننا وصف طريقة جديدة وضعت في مختبر لتقديم والبلازميدات الحمض النووي بشكل فعال في أوروثيليوم المثانة الماوس في فيفو. عن طريق تقطير إينترافيسيكال من بلازميد الدنا بكاج-التجارة والنقل وانهانسر من المثانة جراحيا المكشوفة، نظهر أن يمكن تسليمها بلازميد الحمض النووي على وجه التحديد إلى الخلايا urothelial المثانة لتعبير عابر. لدينا أسلوب يوفر طريقة سريعة وملائمة أوفيريكسبريشن وضربه قاضية للجينات في المثانة الماوس، ويمكن تطبيقها على بناء جيمس سرطان المثانة وغيرها من أمراض الجهاز البولي.

المقدمة

نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) تضطلع بدور أساسي في توسيع معارفنا حول التنمية الحيوانية والجينات وظائفها في فيفو، وآليات المرض التقدم1،2. وتوضع جيمس Germline تقليديا بطريقتين. الأول هو إنشاء الفئران المعدلة وراثيا عن طريق الحقن برونوكليار من الحمض النووي بلازميد متبوعاً بزرع zygotes في الإناث بسيودوبريجنانت. والآخر هو توليد تدق-/نوك-في الفئران باقترانها مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية ووضع التركيبات. الشرطي بالضربة القاضية للجينات في نوع النسيج أو الخلية المحددة لمصلحة ينطوي على تربية الآليلات المهندسة وراثيا مع لجنة المساواة العرقية وفلكس مواقع لأجيال متعددة. العملية كلها يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، لا سيما إذا كان الهدف لاستهداف جينات متعددة الأنسجة على وجه التحديد. مؤخرا، طبقت تكنولوجيات تحرير الجينات مثل مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) على عدة أجهزة من الفئران للحث على التعديلات الخاصة بالانسجة الوراثية للسرطان أصلي النمذجة3، 4،5،،من67 أو الطفرات المرض الصحيح في الموقع8،9. في هذه الدراسات، تم تسليم ناقلات جرنة عادة عن طريق العدوى أدينوفيرال أو لينتيفيرال للجهاز أو حقن الوريد ذيل هيدرودينامية. والسهولة النسبية لتوصيل المكونات كريسبر إلى الرئتين والكبد تحسنت كثيرا الراحة والكفاءة للسرطان النمذجة في هذه الأجهزة مقارنة بنماذج الماوس Cre-لوكس أساس التقليدية.

أوروثيليوم المثانة حيث تنشأ معظم أورام المثانة. طبقة جليكوسامينوجليكان على سطح urothelial قمي، الذي يعمل كحاجز للانضمام للفيروسات المعدية10،11يعوق تسليم ناقلات الحمض النووي إلى urothelium المثانة لعلاج السرطان النمذجة أو الجينات. استخدمت عدة عوامل المعالجة مثل Syn3 ودوديسيل-β-د-مالتوسيدي لتعطيل هذا الحاجز وتعزيز إتش العدوى الكفاءة12،،من1314. ما إذا كانت الفيروسات المرتبطة بالغدة (آفس) يمكن أن تصيب فعالية المثانة قد لا أفيد. وعموما، سيكون من المستصوب أسلوب تسليم على أساس غير فيروسية. وهنا يصف لنا طريقة جديدة وضعت في مختبر لكفاءة تقديم بلازميد الحمض النووي ل urothelium الماوس عن طريق قسطرة مجرى البول وانهانسر. لنهجنا لا تنطوي على المعالجة الكيميائية لطبقة جليكوسامينوجليكان أو إنتاج الفيروس، فإنه إلى حد كبير يبسط إيصال والبلازميدات الحمض النووي في أوروثيليوم المثانة الماوس، وينبغي تسهيل الدراسات المختلفة في فيفو أمراض المثانة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت جميع الإجراءات الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية والأنظمة من "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كاليفورنيا سانتا كروز.

1-بلازميد وإعداد الأدوات

  1. لكل المثانة ترانسفيكت، وإعداد على الأقل 20 ميليلتر من بلازميد الحمض النووي (1 ميكروغرام/ميليلتر).
  2. إضافة 1 ميليلتر تريبان الأزرق إلى 20 ميليلتر من حل بلازميد في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. ماصة مزيج جيد.
  3. اﻷوتوكﻻف الجراحية جميع الصكوك وتعقيم مساحة العمل مع الإيثانول 70%. رش الأدوات الجراحية والقفازات مع الإيثانول 70% وكثيراً ما أو استخدام التعقيم حبة من زجاج عند تنفيذ الخطوات التالية للحفاظ على ظروف معقمة.

2-أنايسثيتيزينج الحيوان

  1. استخدام نظام تخدير أعلى جدول لتخدير الحيوان مع إيسوفلوراني. قم بتشغيل الدبابة2 س وضبط مقياس الأكسجين في التدفق إلى 1 لتر في الدقيقة.
  2. مكان ماوس C57BL/6J الإناث الكبار في قاعة التعريفي. تشغيل وضبط المبخر isoflurane إلى 3% للاستقراء. ينبغي أن يكون الماوس في التخدير داخل الحد الأدنى 2 إدارة البوبرينورفين مسكن (0.1 مغ/كغ) تحت الجلد عند إزالة الماوس من قاعة التعريفي للتسكين وقائية.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، الفئران الإناث تستخدم، كما أنها أسهل للعمل مع خلال قسطرة مجرى البول. البروتوكول يعمل أيضا للفئران الذكور، ولكن يلزم الحذر عند تنفيذ الخطوة 3.
  3. تطبيق مرهم العيون لعيون الحيوان لمنع جفاف. ضع الماوس أنايسثيتيزيد مواجهة على وسادة تدفئة مع انفها في مخروط الآنف. تشغيل تبديل الدارة الجوي السماح isoflurane الذهاب من خلال مخروط الآنف.
  4. كبح جماح الرأس ومخروط الآنف بشريط لاصق. ضبط المبخر isoflurane إلى % 2 للصيانة.
  5. كبح جماح أطرافه بشريط لاصق. إجراء اختبارات تو-قرصه للتأكد من الحيوان في التخدير العميق ويحلق ثم منطقة البطن.

3-البول استنزاف وشطف المثانة

  1. تطبيق مواد التشحيم للقسطرة (24 ز، طول 2.11 سم، القطر الخارجي 0.045 سم) والتأكد من أن سطحه الخارجي مغطى تغطية كاملة.
  2. أدخل القسطرة في فتح مجرى البول، ودفع ببطء حتى يصل إلى المثانة، وهو الوقت الذي ينبغي أن تدفق البول خارجاً عن طريق القسطرة. اضغط برفق في البطن للمساعدة على استنزاف البول.
    1. تحقق إذا كانت القسطرة يتم إدراج بشكل صحيح في المثانة عن طريق مراقبة البول التلقائي التدفق الخارج. تجنب ثقب في جدار المثانة ومجرى البول، وتطبيق مواد التشحيم عدة مرات إذا لزم الأمر.
  3. تجاهل البول مع ماصة داخل دورق نفايات.
  4. "الماصة؛" ميليلتر 80 من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في نهاية القسطرة، الخارجي مع الطرف الآخر لا يزال في المثانة. إرفاق حقنه 1 مل بعناية بالقسطرة. ادفع برفق حقنه حقن برنامج تلفزيوني في المثانة. ترك بعض برنامج تلفزيوني بالقسطرة تجنب خلق فقاعات الهواء في المثانة.
  5. إزالة المحاقن. انتظر حتى برنامج تلفزيوني لاستنزاف خارج المثانة. اضغط برفق في البطن لإجلاء PBS.
  6. تجاهل برنامج تلفزيوني في القسطرة مع ماصة في الكأس النفايات.
  7. تكرار الغسيل (خطوات 3.4 3.6) برنامج تلفزيوني لمرتين أخريين.
    ملاحظة: من الضروري العمل بلطف أثناء هذه الخطوات الغسيل. تدفق الدم في القسطرة أو فشل تلقائي خارج السائل يشير عادة إلى الرصاصات من خلال مجرى البول. من المهم أيضا تجنب إدخال فقاعات الهواء، كما أنها سوف تنخفض كفاءة انهانسر.

4-بلازميد التسليم

  1. تطبيق الإيثانول 70% في البطن الماوس واستخدام مشرط لشق عمودي 1 سم لفتح الجلد البطن فوق المثانة.
  2. "الماصة؛" على الأقل 20 ميليلتر بلازميد بالإضافة إلى حل تريبان الأزرق في نهاية القسطرة الخارجي، ونعلق المحاقن.
  3. حقن الحل بلازميد في المثانة. إذا كانت المثانة يتحول الأزرق، الحقن غير ناجحة. ترك بعض السائل في القسطرة تجنب خلق فقاعات الهواء في المثانة.
  4. الاستيلاء على فتحه الاحليل الخارجية استخدام الملقط، ثم قم بإزالة القسطرة والمحاقن. استخدام سلسلة لتشديد فتحه الاحليل الخارجية. جعل اثنين من حلقات السلسلة، وثم التعادل مع عقده اثنين.
    ملاحظة: تشديد الاحليل مهم لمنع الدفق للسائل بلازميد.
  5. قم بتشغيل مولد انهانسر مع المعلمات التالية: 33V، 50 مللي وقت العمل، ووقت الفاصل الزمني 950 مللي ثانية.
  6. عقد المثانة مع ملاقط وقرصة المثانة مع قطبين. دفع دواسة القدم القيام انهانسر.
    ملاحظة: يتم تعيين النبضات الكهربائية إلى حدوث 5 مرات مع فترات قصيرة بعد كل دفع دواسة. وقد نشل الماوس في هذه العملية. تضغط على دواسة القدم أكثر من مرة واحدة ويمكن زيادة كفاءة التسليم، ولكن النبضات الكهربائية كثيرة جداً يمكن أن تضر سلامة الأنسجة أوروثيليوم.
    1. تجنب أي اتصال بين الملاقط والأقطاب، وهذا سوف يولد شرارة.

5-استرداد

  1. خياطة فتح البطن والجلد بخياطة جراحية معقمة ومقاطع. تطبيق اليود على الجرح.
  2. إزالة الحيوان من النظام إيسوفلوراني. إدارة مسكن البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ) تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة.
  3. إبقاء هذا الحيوان على لوحة تدفئة وإعادته إلى القفص المنزل بعد الشفاء التام. تحقق من هذا الحيوان على الأقل مرة واحدة يوميا للتنقل العادي، والشرب وتغذية السلوكيات وأي علامات على العدوى حتى الشق هو تلتئم، ثم قم بإزالة القصاصات. إدارة حقن البوبرينورفين مسكن اللاحقة إذا كان الحيوان يعرض أعراض الألم مثل تخفيض الاستمالة، وزيادة النزعة العدوانية، وحناجرهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وللتدليل على نجاح توصيل الجينات في أوروثيليوم المثانة، استخدمنا بلازميد15 بكاج-التجارة والنقل انهانسر. تم حقن 20 ميليلتر بلازميد والحل تريبان الأزرق عن طريق مجرى البول، وكانت تدار من النبضات الكهربائية 5. بعد 48 ساعة، ونحن تشريح المثانة الماوس ولاحظ بقع من الأسفار بروتينات فلورية خضراء تحت مجهر fluorescence تشريح، بينما سلبي التحكم في المثانة التي لم تطرأ انهانسر أظهر أي إشارة التجارة والنقل (الشكل 1A). عندما أجرينا الفلورة تلطيخ من أن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

انهانسر يعزز نفاذية غشاء الخلية، وهو عبارة عن تقنية قوية للجينات اليكتروترانسفير16. إيصال الجينات إلى القوارض الحية التي انهانسر قد استخدمت كثيرا في بيولوجيا الأعصاب الحقول17،،من1819،،من2021. تطبيقاتها المحتملة في أجهزة أخرى كثيرة لم تستكشف على نطاق واسع. على حد علمنا، لدينا الأسلوب الموصوفة هنا هو التقرير الأول لإيصال الجينات الناجحة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أي المصالح المتنافسة.

شكر وتقدير

ونشكر الأستاذ بن تشن والدكتور تشانغ يو هوانغ كندي للمساعدة في إعداد نظام انهانسر. أيد هذا العمل منح من سانتا كروز السرطان مجموعة المزايا والمعاهد الوطنية للصحة إلى Z.A.W.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BD 1 مل TB حقنةفيشر148232E
BuprenorphineSigmaB9275-50MG
Dumont TweezersRoboz Surgical InstrRS-5005عالج بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الاستخدام الجراحي
ECM830 SQ Wave Electroporatorجهاز هارفارد450052
Exel International Safelet IV القسطرةفيشر Scientific14-841-2124G ، طول 2.11 سم ، القطر الخارجي 0.045 سم
مقص تشريح دقيق فائق النعومةRoboz Surgical InstrRS-5135عالج بنسبة 70٪ إيثانول قبل الاستخدام
الجراحي IsofluraneVet one501017
K & H حصيرة استراحة ساخنة للحيوانات الصغيرة ، 9 × 12 بوصةأمازونn / أقم بتغطية حصيرة الحرارة بالمناشف الورقية
مرهم العيونفيشرNC0849514
PBS ، pH7.4Life Technologies10010049
نصائح ماصة 200 & micro ؛ LUSA Scientific1111-0206
نصائح ماصة ، تناسب عالمي ؛ 0.1 إلى 10 & micro ؛ Lفيشر02707438 (CS)
PIPETMAN NEO P2جيلسونF144561
PIPETMAN NEO P200NجيلسونF144565
البلازميد CAG-GFPAddgene16664
البلاتين tweezertrode 5 ممجهاز هارفارد450489قطر 5 مم
مقصRoboz Surgical InstrRS-5880علاج مع 70٪ إيثانول قبل الاستخدام الجراحي
سلك الخيطAmazonn / aMandala Crafts 150D 210D 0.8 مم 1 مم خياطة جلدية خياطة مسطحة
الحبل الشريط ، سكوتشفيشر19047257
Therio-gel زيوت التشحيم البيطريةPBS صحة353-736
Trypan Blue StainLifeTechnologies 15250061
V-1 سطح الطاولة نظام التخديرVetEquip901806
خياطة فيكريل البنفسجي 18 "FS-2 قطع 5-0فيشرNC0578475
Walgreens بوفيدون اليود 10٪Walgreens953982
مشبك الجرحفيشر018045
مشبك الجرحتطبيق فيشر01804
مشمع سلسلة

المراجع

  1. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  2. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  3. Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
  4. Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
  5. Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
  6. Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
  7. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  8. Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
  9. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
  10. Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
  11. Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
  12. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
  13. Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
  14. Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
  15. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
  16. Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
  17. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  18. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883(2008).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
  21. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239(2007).
  22. Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة