يصف لنا طريقة لتوليد جلمس-على أساس الشرطي طفرات ضربة قاضية في المنجلية استخدام تحرير الجينوم كريسبر/Cas9.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الملاريا سببا هاما للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. بسبب هذا المرض، والتي تؤثر أساسا على أولئك الذين يعيشون في المناطق المدارية وشبه المدارية، الإصابة بالطفيليات المتصورة . يمكن التعجيل باستحداث أدوية أكثر فعالية لمكافحة الملاريا عن طريق تحسين فهمنا لبيولوجيا الطفيليات المعقدة هذه. المعالجة الجينية لهذه الطفيليات هو المفتاح لفهم هذه الأحياء؛ ومع ذلك، تاريخيا جينوم المنجلية كان صعباً للتلاعب. في الآونة الأخيرة، استخدمت كريسبر/Cas9 الجينوم التحرير في طفيليات الملاريا، مما يسمح للبروتين أسهل العلامات، وتوليد كنوكدوونس البروتين الشرطي، والحذف للجينات. تحرير الجينوم كريسبر/Cas9 قد ثبت أن تكون أداة قوية للمضي قدما في مجال أبحاث الملاريا. وهنا، يمكننا وصف أسلوب كريسبر/Cas9 لتوليد جلمس-على أساس مشروط طفرات ضربة قاضية في المنجلية. هذا الأسلوب القدرة على التكيف لأنواع أخرى من التلاعبات الجينية، بما في ذلك علامات البروتين والجينات بالضربة القاضية.
المقدمة
الملاريا مرض مدمرة الناجمة عن الطفيليات الأوالي من جنس المتصورة. يسبب المنجلية، طفيلي الملاريا القاتل البشرية معظم، قرابة 445,000 حالة وفاة سنوياً، معظمها في الأطفال تحت سن خمس1. وقد الطفيليات المتصورة دورة حياة معقدة تشمل ناقل البعوض ومجموعة فقاريات. أولاً يصاب البشر عندما يأخذ بعوضة مصابة وجبة الدم. ثم، يغزو الطفيل الكبد حيث تنمو، وتتطور، ويقسم لمدة أسبوع تقريبا. وبعد هذه العملية، يتم إصدار الطفيليات في مجرى الدم، حيث أنها تخضع للنسخ المتماثل عديم في خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). نمو الطفيليات داخل كرات الدم الحمراء المسؤولة مباشرة عن الأعراض السريرية المرتبطة بالملاريا2.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
استمرار ثقافة المنجلية يتطلب استخدام كرات الدم الحمراء البشرية، وعلينا الاستفادة من الوحدات التي تم شراؤها تجارياً للدم الذي تم تجريده من كافة معرفات وتصبح مجهولة المصدر. مجلس المراجعة المؤسسية ومكتب السلامة الأحيائية في جامعة جورجيا استعرض لدينا بروتوكولات ووافق جميع البروتوكولات المستخدمة في المختبر لدينا.
1-اختيار جرنة التسلسل
- اذهب إلى تشوبتشوب (http://chopchop.cbu.uib.no/)، وحدد 'Fasta الهدف'. تحت 'الهدف'، قم بلصق زوج قاعدي 200 من 3 'نهاية الإطار القراءة المفتوحة (ORF) الجينات وزوج قاعدي 200 من بداية 3'-UTR هذا الجين. ضمن 'في'، حدد 'المنجلية' (7 3 v3.0)، وحدد 'كريسبر/Cas9' ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تخطيطي من البلازميدات المستخدمة في هذا الأسلوب، فضلا عن مثال من طفرة درع مبينة في الشكل 1. كمثال على كيفية التعرف على الطفيليات المسخ بعد تعداء، تظهر النتائج من تقارير إتمام المشروعات للتحقق من تكامل بنيةجلمس هكتار-في الشكل 2. صورة تمثيلية للوحة الاستنساخ يظهر في الشكل 3 لإثبات تغيير اللون المتوسط حضور الطفيليات. وترد النتائج من مقايسة الفلورة والتجارب الغربية النشاف في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تنفيذ كريسبر/Cas9 في المنجلية على حد سواء إلى زيادة الكفاءة وانخفض مقدار الوقت اللازم لتعديل الجينوم الطفيلي، مقارنة بالأساليب السابقة من التلاعب بالجينات. هذا بروتوكول شامل يحدد الخطوات اللازمة لتوليد طفرات مشروطة باستخدام كريسبر/Cas9 في المنجلية. بينما الأسلوب هنا موجهة خصيصا لتوليد هكتار-طفراتجلمس ، يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من الاحتياجات، بما في ذلك وضع علامات الجينات والجينات بالضربة القاضية، واستحداث الطفرات هذه الاستراتيجية.
خطوة حاسمة في وقت مبكر في هذا الب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر كانداسامي موثوجاباتي لب مجهرية جامعة جورجيا (UGA) "الطب الحيوي" للمساعدة التقنية، وخوان خوسيه لوبيز-روبيو لتقاسم والبلازميدات pUF1-Cas9 و pL6. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة أقواس، جوائز إلى D.W.C. وإلى H.M.K.، منح أموال بدء التشغيل UGA، منح من "آذار/مارس من الدايمات مؤسسة" (اسيل أوكونور كاتب جائزة البحث الباحث) إلى عين، ولنا المعاهد الوطنية للصحة (R00AI099156 و R01AI130139) إلى عين و (T32AI060546) إلى H.M.K.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | نشتري تلك المغلفة |
| فردي أسيتات الصوديوم | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | هدية من مختبر Akhil Vaidya | Ganesan et al.< / em> Mol. Biochem. باراسيتول. 2011 177: 29-34 | |
| ثقافة الأنسجة TPP 6 لوحات الآبار | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 مم أطباق ثقافة الأنسجة (12 مل لوحة) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP ثقافة الأنسجة 96 لوحات بئر | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP ثقافة الأنسجة 24 لوحات | بئر MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | نيو إنجلاند بيولوجيس | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 مل Steritop وحدة فلتر أعلى زجاجة | Millipore | SCGPU10RE | يمكنك استخدام أي حجم يناسب احتياجاتك |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2< / sub>HPO4< / sub> | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | تم إنشاؤه بواسطة Muralidharan Lab | n / a | |
| pHA-glmS | الذي تم إنشاؤه بواسطة Muralidharan Lab | n / a | |
| pUF1-Cas9 | هدية من مختبر خوسيه خوان لوبيز روبيو | غوربال <إم > وآخرون < / إم > Nature Biotech 2014 | |
| الجلوكوز | سيجما ألدريتش | G7021-1 كجم | |
| بيكربونات الصوديوم | سيجما ألدريتش | S5761-500G | |
| بيروفات الصوديوم | سيجما ألدريتش | P5280-100G | |
| هيبوكسانثين | سيجما ألدريتش | H9636-25g | |
| كاشف الجنتاميسين | جيبكو | 15710-064 | |
| ثيميدين | سيجما-ألدريتش | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | تم إنشاؤه بواسطة Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | الذي تم إنشاؤه بواسطة جل NucleoSpin Lab | ||
| وتنظيف PCR | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N / A | ستحتاج إلى تجربة بضع دفعات لمعرفة ما ستنمو الطفيليات في أفضل |
| الدم الحمراء البشرية | بين الولايات بنك الدم ، Inc | البريد الإلكتروني أو الاتصال بهم مباشرة للطلب | نحن عادة ما نستخدم |
| خط طفيلي O + الدم 3D7 | متوفر عند الطلب | N / A | |
| مرق Lysogeny (LB) | فيشر | BP1426-2 | يمكنك أن تصنع بنفسك ، ليس من الضروري استخدام هذا |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | بالضبط ، نصنع مخزونا 1000X بسعر 100 مجم / مل في الماء ونخزنه في -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | مختبر الدكتور دانيال غولدبرغ | واشنطن في سانت لويس | يمكنك استخدام التحكم في التحميل المفضل لديك للبقع الغربية. هذا هو فقط ما نستخدمه في مختبرنا |
| Rat Anti-HA Clone 3F10 ، أحادي النسيلة | من صنع Roche ، يباع بواسطة Sigma | 11867423001 | يمكنك استخدام الأجسام المضادة المفضلة لديك المضادة ل HA |
| 0.6 مل أنابيب | فيشر | AB0350 | |
| Fisher Healthcare * PROTOCOL * Hema 3 * نظام التلوين اليدوي (مثبت + محلول I و II) | Fisher | 22-122-911 | يمكنك أيضا استخدام صبغة |
| giemsaشرائح المجهر المتجمد الفاخرة من فيشرفاينز - الحجم: 3 × 1 بوصة. | فيشر | 12-544-3 |
المراجع
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
