يمكننا وصف بروتوكول لرسم خرائط التوزيع المكاني للنشاط الأنزيمي للإنزيمات التي تولد نيكوتيناتميدي الأدنين وأميد النيكوتنك (NAD(P)H) + H + في عينات الأنسجة مباشرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
رسم الخرائط الأيض: رصد النشاط نازعة لاكتات مباشرة في الأنسجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعيين النشاط الأنزيمي في الزمان والمكان أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي لسلوك الخلية في أنسجة طبيعية والمرض. فحوصات النشاط الأيضي في الموقع يمكن أن توفر معلومات عن التوزيع المكاني لنشاط التمثيل الغذائي داخل أنسجة. نحن نقدم هنا بروتوكولا مفصلاً لرصد نشاط إنزيم لاكتات نازعة في عينات الأنسجة مباشرة. لاكتات نازعة محدداً هاما لما إذا كان سيتم تحويل الجلوكوز المستهلكة للطاقة عن طريق تحلل الهوائية أو اللاهوائية. يتم توفير محلول يحتوي على لاكتات وند لقسم أنسجة مجمدة. سيتم تحويل الخلايا ذات النشاط العالي لاكتات نازعة لاكتات المقدمة إلى بيروفات، بينما في نفس الوقت تحويل توفير نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD) إلى NADH وبروتون، التي يمكن الكشف عنها استناداً إلى الحد من نيتروتيترازوليوم الأزرق إلى فورمازان، الذي هو تصور ترسبات زرقاء. يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لمراقبة نشاط نازعة لاكتات في الجلد الماوس. تطبيق هذا البروتوكول، وجدنا أن النشاط نازعة لاكتات مرتفع في الخلايا الجذعية هادئة الشعرة داخل الجلد. وكشف تطبيق البروتوكول على الخلايا الجذعية الجنينية الماوس مثقف تلطيخ أعلى في استزراع الخلايا الجذعية الجنينية من الخلايا الليفية الجنينية الماوس. كشف تحليل للشريان الاورطي الماوس طازجة معزولة تلطيخ في خلايا العضلات الملساء عمودي للشريان الاورطي. يمكن استخدام المنهجية المقدمة إلى خريطة مكانياً نشاط الإنزيمات التي تولد بروتون في الأنسجة المجمدة أو الطازجة.
المقدمة
فهم المواقع داخل الأنسجة التي يكون للإنزيمات مرتفعة أو منخفضة النشاط أمر ضروري لفهم التنمية وعلم وظائف الأعضاء. كثيرا ما تستخدم مستويات نسخة أو البروتين كالأمهات البديلات للنشاط الأنزيمي. وفي حين يمكن أن تكون مثل هذه الدراسات مفيدة، أنها لا توفر المعلومات التي يمكن أن تكون حاسمة بالنسبة لتحديد نشاط إنزيم في، مثل التعديلات بوستترانسلاشونال، ووجود البروتين المجمعات، أو الترجمة للانزيم سوبسيلولار. عندما يتم قياس النشاط الأنزيمي مباشرة، فإنه غالباً ما رصد في ليساتيس البروتين المتجانس التي لم تعد تحتوي على معلومات حول الخلايا الفردية داخل الخليط أو التوزيع المكاني للخلايا مع نشاط عالية أو منخفضة داخل أنسجة.
نحن نقدم هنا بروتوكول مفصل لرسم خرائط ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع التجارب التي وصفت بموافقة "اللجنة رعاية الحيوان" في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس.
1-إنشاء شرائح جلد الماوس المجمدة
- Euthanize الفئران وفقا لسياسة المؤسسة.
ملاحظة: اتباع سياسة مؤسسية للملابس الواقية. يجب أن يوافق جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات "لجنة رعاية الحيوان المؤسسية". - إزالة الشعر الماوس مع المتقلب شعر الحيواني.
- جعل شقوق في الجلد باستخدام مقص. استخدام الملقط، رفع الجلد بعيداً عن الماوس. باستخدام مقص، قص المقطع الجلد بعيداً.
- ملء كريومولد مع تجميد كاشف مركب (انظر الجدول للمواد).
- مكان الجلد المقاطع إلى كريومولدس مليئة باستخدام الملقط إبرة الآنف. توجيه الج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أننا قد أبلغوا نتائج لفحوصات في الموقع النشاط في الماوس الجلد20. كما هو موضح في الشكل 3، لاحظنا أعقبت ارتفاع مستويات النشاط نازعة لاكتات في الخلايا الجذعية جريب الشعر في قاعدة الشعرة عند الإجراءات الموصوفة أعلاه. هذه النتائج كانت تؤكده الأسفار تنشيط الخلية الفرز للجلد للخلايا الجذعية جريب الشعر ويؤكد النشاط ارتفاع اللاكتات نازعة في حجرة الخلايا الجذعية مع النشاط فحوصات على خلايا تم فرزها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لرصد نشاط نازعة لاكتات أو غيرها الإنزيمات الاستقلابية التي تولد NADH أو نادف، في أنواع الخلايا المختلفة داخل أنسجة أو في أجزاء مختلفة من الأنسجة على مر الزمن. لاكتات نازعة إنزيم مهم لفهم بيولوجيا الخلايا الجذعية والأورام، والقدرة على مراقبة نشاط نازعة لاكتات في الخلايا المفردة من المرجح أن توفر معلومات هامة عن وظيفة هذا الإنزيم.
واحد الميزة الهامة لهذا البروتوكول بالمقارنة مع المنهجيات الأخرى هو أن القدرة على رصد النشاط الأنزيمي، بدلاً من مجرد وفرة البروتين، ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.
شكر وتقدير
وكان HAC الباحث ميلتون هاء كاسل مؤسسة ألن ريتا (http://www.ritaallenfoundation.org). تم تمويل هذا العمل بالمنح إلى HAC من معهد المعهد الوطني ل R01 العلوم الطبية العامة GM081686، R01 AR070245، الوطنية العامة (العلوم R01 GM0866465، إيلي & اديثي مركز واسع للطب التجديدي وبحوث الخلايا الجذعية الطبية روز التلال وغابا Hal جوائز)، تأثير مركز الصحة/جامعة كاليفورنيا كتسي المعاهد الوطنية للصحة منحة UL1TR000124، بمجتمع اللوكيميا اللمفاوية، "المرأة كانتور آيريس" جوائز من مركز السرطان الشامل يونسون أهلا وسهلا و HAC. وأيد البحث عنها في هذا المنشور المعهد الوطني للسرطان من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم P50CA092131. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أدوات | لجمع الجلد من الفئران التي تم القتل رحيم | ||
| Tissue-tek cryomold 25 مم × 20 مم × 5 مم | Fisher Scientific | NC9511236 | لتجميد جلد الفأر |
| Tissue-Tek O.C.T. مركب | فيشر NC9638938 العلمي | لتركيب | |
| التبريد دلو الثلج | فيشر سيانتيفيك | 07-210-106 | |
| الجاف | |||
| شريحة التصاق البوليسين | فيشر Scientific | 12-545-78 | |
| 4٪ فورمالين | فيشر Scientific | 23-245-684 | مخفف في |
| ملحي مخزن لفوسفات الماء ، درجة الحموضة 7.4 | |||
| دوامة | |||
| قاعدة تريس | فيشر Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | سيجما ألدريتش | N7004 | |
| فينازين ميثوسلفات | سيجما ألدريتش | P9625 | |
| نيتروتيرازوليوم كلوريد أزرق | سيجما ألدريتش | N6876 | |
| ليثيوم L-lactate | سيجما ألدريتش | L2250 | الركيزة |
| 37 درجة ؛ حاضنة C (أو حاضنة زراعة الأنسجة) | |||
| البرازيلي! وصمة عار مضادة | Anatech | 861 | مضاد وصمة عار |
| تصاعد متوسطة | مختبرات ناقلات | H-5000 & nbsp ؛ | |
| زلات الغطاء للشرائح | مجهر | ||
المراجع
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan syste....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
