مقالة منهجية

صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين

DOI:

10.3791/57765

⸱

مايو 24, 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حويصلة متشابك (SV) ركوب الدراجات هو الآلية الأساسية للاتصالات بين الخلايا في نهايات الخلايا العصبية. امتصاص صبغ FM وإطلاق سراح هي الوسيلة الأساسية للمعايرة الكمية SV إندو-والرقابة. هنا، نحن نقارن جميع أساليب التحفيز محرك FM1-43 ركوب الدراجات في المشبك نموذج الوصلات العصبية العضلية (NMJ) المورفولوجية .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم الأصباغ FM لدراسة دورة حويصلة متشابك (SV). هذه المسابر amphipathic تحتوي على رأسه ماء وذيل مسعور، جعلها للذوبان في الماء مع القدرة بشكل قابل للعكس الدخول والخروج غشاء دهني بليرس. هذه الأصباغ ستيريل نسبيا غير الفلورية في وسط مائي، ولكن أسباب الإدراج في المنشور الخارجي من غشاء البلازما > زيادة 40 س في الأسفار. في نهايات الخلايا العصبية، يتم استيعابه الأصباغ FM خلال SV الالتقام، الذين يتم الاتجار بهم داخل وبين تجمعات SV، وتم إصدارها مع الرقابة SV، توفير أداة قوية لتصور presynaptic مراحل كبيرة. يعتبر نموذج الجينية الأولية وضع المشبك جلوتاماتيرجيك والدالة المورفولوجية الوصلات العصبية العضلية (NMJ)، حيث صبغ FM التصوير قد استخدمت على نطاق واسع لقياس ديناميات SV في طائفة واسعة من الظروف المسخ. المحطة الطرفية متشابك NMJ يتم الوصول إليها بسهولة، مع مجموعة جميلة من boutons متشابك كبيرة مثالية لتطبيقات التصوير. هنا، يمكننا مقارنة وعلى النقيض من ثلاث طرق لتحفيز المورفولوجية NMJ محرك تعتمد على نشاط امتصاص صبغ FM1-43/الإفراج عن: 1) حمام تطبيق عالية [ك+] ديبولاريزي الأنسجة العضلية، 2) شفط العصب المحرك الكهربائي التحفيز ديبولاريزي الأعصاب presynaptic الطرفية، و 3) تستهدف التعبير المحورة وراثيا من المتغيرات تشانيلرهودوبسين للسيطرة المكانية، وحفز الضوء على ديبولاريزيشن. كل من هذه الأساليب على مزايا وعيوب لدراسة تأثيرات الطفرات الوراثية المتعلقة بدوره SV في المورفولوجية NMJ. وسوف نناقش هذه المزايا والعيوب لمساعدة اختيار النهج التحفيز، جنبا إلى جنب مع منهجيات محددة لكل استراتيجية. بالإضافة إلى تصوير فلوري، يمكن أن تكون الأصباغ FM فوتوكونفيرتيد إلى إشارات إلكترون كثيفة تصور استخدام مجهر إلكتروني (TEM) لدراسة آليات دورة SV على مستوى ultrastructural. نحن نقدم المقارنات من [كنفوكل] والمجهر الإلكتروني التصوير من أساليب مختلفة من التحفيز NMJ المورفولوجية ، للمساعدة في توجيه اختيار النماذج التجريبية المقبلة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت تتميز جميل المورفولوجية اليرقات الوصلات العصبية العضلية (NMJ) جلوتاماتيرجيك المشبك نموذج لدراسة تشكيل المشبك والدالة مع طائفة واسعة من الاضطرابات الوراثية1. المحطة الطرفية العصبون يتكون من فروع إكسون متعددة، كل مع العديد من بتونس متشابك الموسع. هذه varicosities رحيب (تصل إلى 5 ميكرومتر في القطر) تحتوي على جميع الأجهزة كبيرة، بما في ذلك الحويصلات جلوتاماتيرجيك موحدة متشابك (SVs; ~ 40 نانومتر في القطر) في محمية سيتوسوليك وسهولة يمكن نشرة برك2. قفص الاتهام هذه الحويصلات في غشاء البلازما presynaptic الانصهار الموقع النشط المناطق (المزرعة)، حيث يتوسط الرقابة الإفراج العصبي الغلوتامات السكك-الاتصالات متشابك. وفي وقت لاحق، SVs يتم استردادها من غشاء البلازما عن طريق إعادة تدوير قبله، وتشغيل أو كلاثرين بوساطة الالتقام (CME) لدورات متكررة exo/الالتقام. المورفولوجية NMJ يسهل الوصول إليها ومناسبة تماما لعزل ووصف SV دورة طفرات على السواء. استخدام شاشات الجينية إلى الأمام، أدت الطفرات الرواية إلى تحديد الجينات الجديدة الحاسمة ل دورة SV3. وعلاوة على ذلك، أدت عكس النهج الوراثية بدءاً من الجينات معروفة بالفعل لاستيضاح SV دورة آليات جديدة من خلال الوصف الدقيق للمسخ ركوب الدراجات تعمل4. المورفولوجية NMJ مثالي تقريبا كإعداد متشابك تجريبية لتشريح آليات SV الالتقام والرقابة عن طريق أساليب بصريا حويصلة المسار الدراجات خلال كبيرة.

تسمح مجموعة من علامات مضيئة التعقب البصرية من الحويصلات أثناء ركوب الدراجات الديناميات، ولكن أكثر تنوعاً FM صبغ النظير الذي يتم تصنيعه أولاً قبل ماو، واو، وآخرون. 5-هيكلياً، تحتوي على صبغات FM رأسه ماء وذيل محبتين متصلاً من خلال عصابة عطرية، مع منطقة الوسطى منح الخواص الطيفية. ستيريل هذه الأصباغ التقسيم عكسية في الأغشية وليس 'التقلب المفاجىء' بين منشورات الغشاء وحتى لا تكون ابدأ حرة في سيتوسول، وهي أكثر بكثير من الفلورسنت في أغشية من المياه5. عكسها الإدراج إلى بلير دهن يؤدي زيادة محاطاً fluorescence6. في نهايات الخلايا العصبية، تتكون كلاسيك FM صبغ تجارب وضع العلامات للاستحمام إعداد متشابك مع الصبغ أثناء ديبولاريزينج التحفيز لتحميل صبغة عن طريق الالتقام SV. صبغ خارجي ثم جرفت ويلقي القبض عليه في دورة SV في حل خالية من الكالسيوم في المسابقة للصورة المحملة نهايات7. جولة ثانية من التحفيز في حمام خالية من صبغة مشغلات إطلاق سراح وزير الخارجية من خلال الرقابة، عملية التي يمكن اتباعها من قبل قياس انخفاض كثافة الأسفار. ويمكن السكان SV من حويصلة واحدة لحمامات السباحة التي تحتوي على مئات حويصلات كمياً رصد6،7. وقد استخدمت الأصباغ FM لتشريح وتعتمد على نشاط تعبئة متميزة وظيفيا SV برك، ومقارنة قبله وتشغيل مقابل CME ركوب8،9. تم تعديل الأسلوب لكل على حدة بالانزيم أثارت، دورة متشابك عفوية ومصغر الأنشطة (مع معدات حساسة للغاية للكشف عن تغييرات صغيرة جداً الأسفار والحد من فوتوبليتشينج)10. فحوصات يمكن تمديدها إلى مستوى ultrastructural قبل فوتوكونفيرتينج إشارة FM الفلورية إلى تسمية وحدة إلكترون كثيفة لانتقال الميكروسكوب الإلكتروني11،،من1213،14 .

تاريخيا، كانت الاستعدادات الاستحمام متشابك في تركيزات عالية من البوتاسيوم (يشار إليه فيما يلي "عالية [ك+]") الأسلوب المفضل للتحفيز لحمل SV ركوب الدراجات؛ ديبولاريزينج بدءاً من الضفدع اتروبين NMJ5، إلى مثقف القوارض الدماغ الخلايا العصبية هيبوكامبال15، إلى المورفولوجية جلوتاماتيرجيك NMJ النموذجي16،17. هذا النهج [ك+] عالية بسيط، يتطلب أي معدات متخصصة، وهو وبالتالي الوصول إلى معظم المعامل، ولكن قيود لتطبيق وتفسير البيانات. أسلوب أكثر بكثير من الناحية الفسيولوجية مناسبة لاستخدام الشفط الكهربائي التحفيز الكهربائي للعصب4،،من512. هذا النهج محركات نشر إمكانات العمل لحفز مباشرة للعصب بريسينابتيك المحطة الطرفية، ويمكن مقارنة النتائج مباشرة إلى فحوصات الكهربية كبيرة وظيفة13،14، 15، لكن يتطلب معدات متخصصة وتحديا تقنيا أكثر بكثير. ومع ظهور أوبتوجينيتيكس، استخدام تشانيلرهودوبسين الخلايا العصبية التحفيز على مزايا إضافية، بما في ذلك سيطرة الزمانية المكانية للتعبير قناة باستخدام نظام Gal4/UAS ثنائي20. هذا النهج هو من الناحية التقنية أسهل بكثير من التحفيز الكهربائي الشفط ويتطلب شيئا أكثر من مصدر ضوء LED رخيصة جداً. وهنا، نحن نوظف تصوير FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) بيريدينيوم dibromide) لكل مقارنة وهذه ثلاثة أساليب التحفيز المختلفة في المورفولوجية NMJ: عالية بسيطة [ك+ ]، تحدي النهج تشانيلرهودوبسين الكهربائية وجديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-اليرقات الغراء تشريح

  1. مزيج دقيق 10 أجزاء من سيليكون الاستومر قاعدة مع جزء 1 من سيليكون الاستومر علاج عامل من مجموعة الاستومر (جدول المواد).
  2. معطف كوفيرسليبس الزجاج 22 × 22 ملم مع الاستومر وعلاج على صفيحة ساخنة في 75 ˚C لعدة ساعات (حتى لم يعد مثبت للمس).
  3. ضع ساترة واحد زجاج الاستومر المغلفة في قاعة تشريح الزجاج plexi مصنوعة خصيصا (الشكل 1، أسفل) تحضيرا لتشريح اليرقات.
  4. إعداد الماصات الغراء من زجاج البورسليكات الشعرية استخدام ساحبة ميكروليكترودي قياسية للحصول على الاستدقاق المرجوة وتلميح الحجم.
  5. كسر قبالة رأس ميكروبيبيتي، وفي الطرف الآخر بلطف، وإرفاق 2 متر أنابيب بلاستيكية مرنة (1/32 "قطرها الداخلي، معرف 3/32" خارج القطر، القطر الخارجي؛ 1/32 "الجدار؛ جدول المواد) مع الفم المناسب (نصيحة ماصة P2).
  6. ملء حاوية صغيرة (0.6 مل ايبندورف أنبوب cap) بحجم صغير (~ 20 ميليلتر) الغراء (جدول المواد) تحضيرا لتشريح اليرقات.
  7. ملء الدائرة مع المحلول الملحي (في مم): 128 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل 4 مجكل2، كاكل 12, 70 السكروز وحمض 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (حبيس) الرقم الهيدروجيني 7.2.
  8. إضافة جسم البيروكسيديز (HRP) فجل الحصان المضادة مترافق إلى أليكسا فلور 647 (مكافحة-HRP:647؛ وتمييع 01:10 من مخزون 1 ملغ/مل) لوضع العلامات NMJ presynaptic الطرفية أثناء تشريح21،22.
  9. استخدام الرسام ما يرام (حجم 2)، إزالة تجول الطور ثالث من القنينة الغذاء ووضعه على الزجاج غطاء الاستومر المغلفة.
  10. ملء نصيحة ميكروبيبيتي الزجاج مع كمية صغيرة من الغراء باستخدام ضغط الهواء السلبي التي تم إنشاؤها عن طريق الفم مع المرفقات (الخطوة 1، 5).
  11. موقف يرقة الظهرية الجانب الأعلى مع الملقط والصمغ إسقاط الرأس ساترة الاستومر المغلفة مع صغيرة من الغراء باستخدام ضغط الهواء الإيجابي عن طريق الفم.
  12. كرر هذا الإجراء مع نهاية الخلفي لليرقة، مع التأكد من أن يتم تمدد الحيوان مشدود بين المرفقات الغراء اثنين.
  13. استخدام مقص (شفرات 3 مم؛ الجدول للمواد)، جعل قطع أفقي (~ 1 مم) في مؤخرة وقطع عمودي على طول خط الوسط الظهرية.
  14. برفق باستخدام الملقط غرامة (#5، الجدول للمواد)، إزالة الظهرية القصبة الهوائية والأمعاء، والدهون في الجسم والأجهزة الداخلية الأخرى التي تغطي العضلات.
  15. كرر الإجراء الالتصاق اللوحات جدار الجسم أربعة، والتأكد على امتداد الجدار الجسم بلطف أفقياً وعمودياً.
  16. رفع الحبل البطني العصب (فنك) باستخدام الملقط، قطع الأعصاب الحركية بعناية مع المقص، ومن ثم إزالتها تماما فنك.
  17. يستبدل المحلول الملحي تشريح Ca2 +-مجاناً المالحة (نفس المحلول الملحي تشريح أعلاه دون كاكل2) لوقف SV ركوب الدراجات.

2-الخيار 1: عالية [ك+] صبغة FM تحميل

  1. من حل أسهم FM1-43 (4 ملم)، إضافة ميليلتر 1 إلى 1 مل من 90 مم حل بوكل (عالية [ك+] في المحلول الملحي التشريح) لتركيز نهائي من 4 ميكرومتر.
  2. استخدام ماصة، استبدال Ca2 +-سالين مجاناً في قاعة التصوير مع الحل صبغ FM [ك+] عالية لتحفيز امتصاص صبغ الالتقام SV.
  3. البدء فورا في جهاز توقيت رقمي لمدة محددة سلفا للسامية [ك+] ديبولاريزينج فترة التحفيز (على سبيل المثال-، 5 دقيقة؛ الشكل 2).
  4. للتأكد من إعداد يرقات صحية، ملاحظة تقلصات قوية للعضلات لمدة فترة depolarization [ك+] عالية.
  5. عند انتهاء فترة الموقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM [ك+] عالية واستبدال مع Ca2 +-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
  6. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM [ك+] عالية هو إزالتها بالكامل.
  7. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].

3-تصوير: [كنفوكل] مجهرية

  1. استخدام مجهر [كنفوكل] تستقيم مع 40 × الهدف غمر المياه إلى NMJ صورة صبغ الفلورية (يمكن استخدام المجاهر الأخرى).
  2. صورة العضلات NMJ 4 شرائح البطن 2-4 (يمكن تصويرها الأخرى نمجس) وجمع الصور باستخدام البرمجيات المناسبة (جدول المواد).
  3. استخدام ليزر زناد 633 نانومتر لإثارة HRP:647 (مع مرشح تمرير طويل > 635 نانومتر) والارجون 488 نانومتر ليزر إثارة FM1-43 (مع ممر الموجه مرشح 530-600 nm).
  4. عمليا تحديد الربح الأمثل والإزاحة لكل القنوات.
    ملاحظة: هذه الإعدادات سوف تظل ثابتة طوال بقية التجربة.
  5. تأخذ كدسة Z [كنفوكل] من خلال أسرة NMJ مختارة من أعلى علامات HRP إلى أسفل الصالة متشابك.
  6. تأخذ علما دقيقا ب NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الزائدة إلى NMJ نفس الدقيق بعد صبغ FM وتفريغ.

4. عالية [ك+] التحفيز: FM صبغ تفريغ

  1. استبدال Ca2 +-سالين مجاناً مع ارتفاع المياه المالحة [ك+] (دون صبغ FM1-43) إلى محرك الأقراص ديبولاريزيشن، الإفراج عن الرقابة وصبغ SV.
  2. البدء فورا في جهاز توقيت رقمي لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز [ك+] عالية (على سبيل المثال-، 2 دقيقة؛ الشكل 2).
  3. عند انتهاء فترة الموقت، فورا إزالة المياه المالحة [ك+] عالية واستبدال مع Ca2 +-سالين مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
  4. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان ارتفاع المياه المالحة [ك+] هو إزالتها بالكامل.
  5. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
  6. أن تكون معينة الصورة الفلورية صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

5-الخيار 2: التحفيز الكهربائي صبغة FM تحميل

  1. إعداد ماصة شفط استخدام ساحبة ميكرويليكترودي (جدول المواد) للحصول على تفتق المطلوبة وتلميح الحجم.
  2. النار-البولندية نصيحة ميكروليكترودي مع الصغرى-فورج حتى يمكن امتص عصب محرك واحد مع تناسب ضيق.
  3. الشريحة ماصة شفط على صاحب قطب كهربائي في ميكرومانيبولاتور ونعلق على أنبوب بلاستيكي طويلة مرنة والمحاقن.
  4. تعيين معلمات مشجعا (على سبيل المثال-، 15 الخامس 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة من 5 دقيقة (الشكل 2) أو 1 دقيقة (الشكل 3)).
  5. استبدال Ca2 +-سالين مجاناً على إعداد اليرقات مع أعلى المحلول الملحي FM1-43 (4 ميكرومتر؛ كاكل 1 مم2) على تلاعب الكهربية.
  6. وضع التحضير في مرحلة مجهر ورفع المرحلة حتى اليرقة وماصة شفط في التركيز (40 X غمر المياه الهدف).
  7. تمتص حلقة من قطع العصب الحركي إينيرفاتينج هيميسيجمينت المحدد مع ضغط الهواء السلبي إنشاؤها بواسطة المحاقن في مسرى شفط.
  8. اختبار الدالة القطب شفط مع دفعة قصيرة من التحفيز أثناء الرصد بصريا لتقلص العضلات في هيميسيجمينت المحدد.
  9. تحفيز الأعصاب الحركية باستخدام المعلمات المحددة (الخطوة 5.4) محرك الأقراص الالتقام SV وامتصاص صبغ FM1-43 (الشكل 2).
  10. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM1-43 هو إزالتها بالكامل.
  11. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري باستخدام البروتوكول [كنفوكل] التصوير من أعلى.
  12. تأخذ علما NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الوصول إلى NMJ نفس الدقيق بعد تفريغ صبغ FM بعناية.

6-الكهربائية التحفيز: FM صبغ تفريغ

  1. استبدال Ca2 +-مجاناً المالحة مع المياه المالحة العادية (بدون صبغ FM1-43) ومكان الإعداد مرة أخرى في مرحلة تلاعب الكهربية.
  2. تعيين معلمات مشجعا للتفريغ (مثلاً، 15 ت، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة 2 دقيقة (الشكل 2) أو 20 s (الشكل 3)).
  3. تمتص العصب المحرك نفسه في مسرى نفس النحو الوارد أعلاه، وحفز ثم تفعيل الرقابة SV والإفراج عن صبغ FM1-43.
  4. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الصبغة الخارجية هو إزالتها بالكامل.
  5. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
  6. التأكد من الصورة في الأسفار صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

7-الخيار 3: تشاننيلرهودوبسين تحفيز صبغة FM تحميل

  1. رفع الإعراب عن ChR2 اليرقات في الأغذية التي تحتوي على الشبكية عبر كل عامل المشارك ChR2 (الذائبة في الإيثانول؛ 100 ميكرومتر التركيز النهائي).
  2. مكان إعداد اليرقات في قاعة شبكي في مرحلة مجهر تشريح مزودة بمنفذ كاميرا.
  3. إرفاق الصمام أزرق (470 نانومتر؛ جدول المواد) مشجعا لبرمجة باستخدام كبل coaxial ومكان الصمام بمنفذ الكاميرا.
  4. وتركز شعاع ضوء LED زرقاء على تشريح اليرقات الدالة استخدام الدالة تكبير المجهر.
  5. استبدال Ca2 +-سالين مجاناً على إعداد اليرقات مع أعلى المحلول الملحي FM1-43 (4 ميكرومتر؛ كاكل 1 مم2) في مرحلة أوبتوجينيتيك.
  6. تعيين المعلمات LED باستخدام مشجعا (مثلاً، 15 ت، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة من 5 دقيقة (الشكل 2)).
  7. ابدأ تحفيز الضوء وتتبع مع جهاز ضبط وقت لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز أوبتوجينيتيك (مثلاً، 5 دقيقة؛ الشكل 2).
  8. عند إيقاف جهاز ضبط الوقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM واستبدال مع Ca2 +-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
  9. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM هو إزالتها بالكامل.
  10. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل] باستخدام بروتوكول التصوير من أعلى.
  11. تأخذ علما NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الوصول إلى NMJ نفس الدقيق بعد تفريغ صبغ FM بعناية.

8-تشانيلرهودوبسين التحفيز: صبغ FM وتفريغ

  1. استبدال Ca2 +-سالين مجاناً مع المالحة العادية (بدون صبغ FM1-43) في مرحلة مجهر تشريح مع منفذ كاميرا LED ركزت على اليرقة.
  2. تعيين معلمات مشجعا للتفريغ (مثلاً 15 الخامس، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والوقت من 2 دقيقة (الشكل 2)).
  3. ابدأ تحفيز الضوء وتتبع مع جهاز ضبط وقت لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز أوبتوجينيتيك (مثلاً، 2 دقيقة؛ الشكل 2).
  4. عند انتهاء فترة الموقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM واستبدال مع Ca2 +-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
  5. أغسل في تتابع سريع مع Ca2 +-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الصبغة الخارجية هو إزالتها بالكامل.
  6. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة2 +-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
  7. التأكد من الصورة في الأسفار صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

9-الأسفار الكمي

  1. لتحميل الصورة في "الصورة ي" (المعاهد الوطنية للصحة مفتوحة المصدر) وإنشاء إسقاط أقصى شدتها بالنقر فوق الصورة | مكدسات | المشروع Z.
  2. استخدام المضادة-قناة HRP:647، وانتقل إلى الصورة | ضبط | العتبة والشريحة شريط الأدوات أعلى حتى يتم تمييز فقط NMJ.
  3. باستخدام أداة العصا، انقر على NMJ. في حالة الانقطاع NMJ، اضغط الزر Shift وحدد جميع أجزاء.
  4. تغيير الصورة إلى القناة صبغ FM1-43 والذهاب إلى تحليل | تدبير الحصول على قياس الأسفار.
  5. كرر الخطوات من 9.1-9.4 في صورة "تفريغ" من NMJ نفسه (الجزء التي تم تحديدها، والجانب والعضلات).
  6. للحصول على النسبة المئوية للصبغة التي تم إلغاء تحميلها، تأخذ نسبة شدة الأسفار تفريغها أو تحميلها.
    ملاحظة: يمكن تعديل هذا الإجراء لتحليل الأسفار على أساس بوتون الواحدة بوتون باستخدام أما أدوات التحديد "البيضاوي" أو "يدوي". يمكن طرح الخلفية الفلورية بأخذ عينات من الأسفار العضلات. يمكن أيضا إضافة وكلاء للحد من هذه الخلفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 تدفق العمل لصبغ FM تعتمد على نشاط التصوير البروتوكول. التجربة يبدأ دائماً بتشريح الغراء اليرقات نفسها، بغض النظر عن أسلوب التحفيز المستخدمة في وقت لاحق. 1a الشكل تخطيطي ليرقة تشريح، عرض الحبل البطني العصب (فنك)، يشع الأعصاب ونمط العضلات هيميسيجمينتال المتكررة. تتم إزالة فنك والإعداد حمم في حل 4 ميكرومتر FM1-43 (الشكل 1b، الوردي). ثم هو حفز الإعداد حضور صبغ FM باستخدام واحد من ثلاثة خيار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عالية التحفيز ديبولاريزينج المالحة [ك+] هو حتى الآن أسهل من الخيارات الثلاثة لصبغ FM تعتمد على نشاط ركوب الدراجات، ولكن يرجح أن الأقل الفسيولوجية29. هذه طريقة بسيطة ديبولاريزيس كل خلية موجوداً في الحيوان الكامل، وحتى لا يسمح للدراسات الموجهة. قد يكون من الممكن تطبيق محلياً عالية الملوحة [ك+] مع ميكروبيبيتي، ولكن هذا سوف لا يزال ديبولاريزي الخلايا قبل/بوستسينابتيك واحتمال إطلاق المرتبطة المشبك1. شاغلا رئيسيا آخر هو أن ارتفاع [ك+] depolarizati...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر أعضاء مختبر برودي للمساهمات لهذه المادة. ودعمت هذا العمل MH096832 R01s المعاهد الوطنية للصحة و MH084989 إلى كيلوبايت، والمعاهد الوطنية للصحة بريدوكتورال زمالة F31 MH111144 D.L.K.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
SylGard 184 سيليكون المطاط الصناعي كيتفيشر العلميNC9644388لوضع غطاء زجاجي للتشريح
مجهر زجاجي 22x22-1Fisherbrand12-542-Bلوضع SylGard على التشريح
الألومنيوم العلوي لوحة ساخنة نوع 2200ThermolyneHPA2235Mلعلاج
غرفة تشريح الزجاجPlexi N / AN / Aاليدوية
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتWPI1B100F-4لصنع الماصات الدقيقة للشفط والغراء
أداة مجتذب مجتذبالقائمة على الليزر P-2000لصنع الماصات الدقيقة للشفط والغراء
Tygon E-3603 شركةالمختبرية.TET-031Aللفم والماصة شفط
طرف ماصة P2الولايات المتحدة الأمريكية العلمية1111-3700لماصة الفم
0.6 مل غطاء أنبوب EppendorfFisher Scientific05-408-120يستخدم لوضع الغراء للتشريح
Vetbond 3MWPIvetbondالغراء المستخدم في تشريح
كلوريد البوتاسيومفيشر ScientificP-217Forsaline
كلوريد الصوديومMillipore SigmaS5886للمحلول
الملحي كلوريد المغنيسيومفيشر ScientificM35-500للمحلول الملحي
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتMillipore SigmaC7902للسكروز الملحي
فيشر ScientificS5-3للمحلول الملحي
HEPESMillipore SigmaH3375للمحلول الملحي
HRP: Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch123-605-021لتسمية الأغشية العصبية
فرشاةالرسم Winsor & amp نيوتن94376864793للتلاعب باليرقات
ملاقط دومون دوموستار # 5WPI500233يستخدم أثناء التشريح
7 سم McPherson-Vannas Microscissors (شفرات 3 مم)WPI14177يستخدم أثناء التشريح   ;
FM1-43فيشر ScientificT35356صبغة الفلورسنت ستايريل
الموقت الرقميVWR62344-641لتوقيت تحميل / تفريغ صبغة FM   ؛
LSM 510 META مجهر متحد البؤر للمسح بالليزرZeissلتصوير علامات الفلورسنت
Zen 2009 SP2 الإصدار 6.0برنامج Zeissللتصوير على
ليزر HeNe 633nmLasosلإثارة HRP: 647 أثناء التصوير
ليزر Argon 488nmLasosلإثارة صبغة FM أثناء التصوير
Micro-ForgeWPIMF200لإطلاق الماصات الدقيقة الزجاجية البولندية
20 مل طرف حقنة انزلاقBD301625لامتصاص المحور العصبي للتحفيز الكهربائي.
مناور دقيق (قاعدة مغناطيسية)NarishigeMMN-9للتحكم في قطب الشفط للتحفيز الكهربائي
محفزالعشبS48للتحكم في LED والتحفيز الكهربائي
Zeiss Axioskop MicroscopeZeissالمستخدم أثناء التحفيز الكهربائي.
40X Achroplan الغمر في الماء الهدفZeissيستخدم أثناء التحفيز الكهربائي والتصوير متحد البؤر
All-trans RetinalMillipore SigmaR2500العامل المساعد الأساسي لمجهر ChR2
Zeiss Stemi مع منفذ الكاميراZeiss2000-Cيستخدم أثناء تحفيز القناة رودوبسين
LED 470 نانومترThorLabsM470L2يستخدم لتنشيط ChR
T-Cube LED سائقThorLabsLEDD1Bللتحكم في
LED LED مزود الطاقةCincon Electronics Co.TR15RA150لتشغيل
مقياس الطاقة الضوئية والطاقة LEDThorLabsPM100Dلقياس شدة LED
غطاء SylGard الماصات الدقيقة توريد مكونات الأنابيب متحد البؤر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790(2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133(2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135(2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila FM1 43 FM1 43

مقالات ذات صلة