حويصلة متشابك (SV) ركوب الدراجات هو الآلية الأساسية للاتصالات بين الخلايا في نهايات الخلايا العصبية. امتصاص صبغ FM وإطلاق سراح هي الوسيلة الأساسية للمعايرة الكمية SV إندو-والرقابة. هنا، نحن نقارن جميع أساليب التحفيز محرك FM1-43 ركوب الدراجات في المشبك نموذج الوصلات العصبية العضلية (NMJ) المورفولوجية .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتستخدم الأصباغ FM لدراسة دورة حويصلة متشابك (SV). هذه المسابر amphipathic تحتوي على رأسه ماء وذيل مسعور، جعلها للذوبان في الماء مع القدرة بشكل قابل للعكس الدخول والخروج غشاء دهني بليرس. هذه الأصباغ ستيريل نسبيا غير الفلورية في وسط مائي، ولكن أسباب الإدراج في المنشور الخارجي من غشاء البلازما > زيادة 40 س في الأسفار. في نهايات الخلايا العصبية، يتم استيعابه الأصباغ FM خلال SV الالتقام، الذين يتم الاتجار بهم داخل وبين تجمعات SV، وتم إصدارها مع الرقابة SV، توفير أداة قوية لتصور presynaptic مراحل كبيرة. يعتبر نموذج الجينية الأولية وضع المشبك جلوتاماتيرجيك والدالة المورفولوجية الوصلات العصبية العضلية (NMJ)، حيث صبغ FM التصوير قد استخدمت على نطاق واسع لقياس ديناميات SV في طائفة واسعة من الظروف المسخ. المحطة الطرفية متشابك NMJ يتم الوصول إليها بسهولة، مع مجموعة جميلة من boutons متشابك كبيرة مثالية لتطبيقات التصوير. هنا، يمكننا مقارنة وعلى النقيض من ثلاث طرق لتحفيز المورفولوجية NMJ محرك تعتمد على نشاط امتصاص صبغ FM1-43/الإفراج عن: 1) حمام تطبيق عالية [ك+] ديبولاريزي الأنسجة العضلية، 2) شفط العصب المحرك الكهربائي التحفيز ديبولاريزي الأعصاب presynaptic الطرفية، و 3) تستهدف التعبير المحورة وراثيا من المتغيرات تشانيلرهودوبسين للسيطرة المكانية، وحفز الضوء على ديبولاريزيشن. كل من هذه الأساليب على مزايا وعيوب لدراسة تأثيرات الطفرات الوراثية المتعلقة بدوره SV في المورفولوجية NMJ. وسوف نناقش هذه المزايا والعيوب لمساعدة اختيار النهج التحفيز، جنبا إلى جنب مع منهجيات محددة لكل استراتيجية. بالإضافة إلى تصوير فلوري، يمكن أن تكون الأصباغ FM فوتوكونفيرتيد إلى إشارات إلكترون كثيفة تصور استخدام مجهر إلكتروني (TEM) لدراسة آليات دورة SV على مستوى ultrastructural. نحن نقدم المقارنات من [كنفوكل] والمجهر الإلكتروني التصوير من أساليب مختلفة من التحفيز NMJ المورفولوجية ، للمساعدة في توجيه اختيار النماذج التجريبية المقبلة.
المقدمة
وقد استخدمت تتميز جميل المورفولوجية اليرقات الوصلات العصبية العضلية (NMJ) جلوتاماتيرجيك المشبك نموذج لدراسة تشكيل المشبك والدالة مع طائفة واسعة من الاضطرابات الوراثية1. المحطة الطرفية العصبون يتكون من فروع إكسون متعددة، كل مع العديد من بتونس متشابك الموسع. هذه varicosities رحيب (تصل إلى 5 ميكرومتر في القطر) تحتوي على جميع الأجهزة كبيرة، بما في ذلك الحويصلات جلوتاماتيرجيك موحدة متشابك (SVs; ~ 40 نانومتر في القطر) في محمية سيتوسوليك وسهولة يمكن نشرة برك2. قفص الاتهام هذه الحويصلات في غشاء البلازما presynaptic الانصهار الموقع النشط المناطق (المزرعة)، حيث يتوسط الرقابة الإفراج العصبي الغلوتامات السكك-الاتصا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-اليرقات الغراء تشريح
- مزيج دقيق 10 أجزاء من سيليكون الاستومر قاعدة مع جزء 1 من سيليكون الاستومر علاج عامل من مجموعة الاستومر (جدول المواد).
- معطف كوفيرسليبس الزجاج 22 × 22 ملم مع الاستومر وعلاج على صفيحة ساخنة في 75 ˚C لعدة ساعات (حتى لم يعد مثبت للمس).
- ضع ساترة واحد زجاج الاستومر المغلفة في قاعة تشريح الزجاج plexi مصنوعة خصيصا (الشكل 1، أسفل) تحضيرا لتشريح اليرقات.
- إعداد الماصات الغراء من زجاج البورسليكات الشعرية استخدام ساحبة ميكروليكترودي قياسية للحصول على الاستدقاق المرجوة وتلميح الحجم.
- كسر قبالة رأس ميكروبيبيتي، وفي الطرف الآخر بلطف، وإرفاق 2 متر أنابيب بلاستيكية مرنة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 تدفق العمل لصبغ FM تعتمد على نشاط التصوير البروتوكول. التجربة يبدأ دائماً بتشريح الغراء اليرقات نفسها، بغض النظر عن أسلوب التحفيز المستخدمة في وقت لاحق. 1a الشكل تخطيطي ليرقة تشريح، عرض الحبل البطني العصب (فنك)، يشع الأعصاب ونمط العضلات هيميسيجمينتال المتكررة. تتم إزالة فنك والإعداد حمم في حل 4 ميكرومتر FM1-43 (الشكل 1b، الوردي). ثم هو حفز الإعداد حضور صبغ FM باستخدام واحد من ثلاثة خيار.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عالية التحفيز ديبولاريزينج المالحة [ك+] هو حتى الآن أسهل من الخيارات الثلاثة لصبغ FM تعتمد على نشاط ركوب الدراجات، ولكن يرجح أن الأقل الفسيولوجية29. هذه طريقة بسيطة ديبولاريزيس كل خلية موجوداً في الحيوان الكامل، وحتى لا يسمح للدراسات الموجهة. قد يكون من الممكن تطبيق محلياً عالية الملوحة [ك+] مع ميكروبيبيتي، ولكن هذا سوف لا يزال ديبولاريزي الخلايا قبل/بوستسينابتيك واحتمال إطلاق المرتبطة المشبك1. شاغلا رئيسيا آخر هو أن ارتفاع [ك+] depolarizati.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.
شكر وتقدير
ونشكر أعضاء مختبر برودي للمساهمات لهذه المادة. ودعمت هذا العمل MH096832 R01s المعاهد الوطنية للصحة و MH084989 إلى كيلوبايت، والمعاهد الوطنية للصحة بريدوكتورال زمالة F31 MH111144 D.L.K.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| SylGard 184 سيليكون المطاط الصناعي كيت | فيشر العلمي | NC9644388 | لوضع غطاء زجاجي للتشريح |
| مجهر زجاجي 22x22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | لوضع SylGard على التشريح |
| الألومنيوم العلوي لوحة ساخنة نوع 2200 | Thermolyne | HPA2235M | لعلاج |
| غرفة تشريح الزجاج | Plexi N / A | N / A | اليدوية |
| الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات | WPI | 1B100F-4 | لصنع الماصات الدقيقة للشفط والغراء |
| أداة مجتذب مجتذب | القائمة على الليزر P-2000 | لصنع الماصات الدقيقة للشفط والغراء | |
| Tygon E-3603 شركة | المختبرية. | TET-031A | للفم والماصة شفط |
| طرف ماصة P2 | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1111-3700 | لماصة الفم |
| 0.6 مل غطاء أنبوب Eppendorf | Fisher Scientific | 05-408-120 | يستخدم لوضع الغراء للتشريح |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | الغراء المستخدم في تشريح |
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر Scientific | P-217 | Forsaline |
| كلوريد الصوديوم | Millipore Sigma | S5886 | للمحلول |
| الملحي كلوريد المغنيسيوم | فيشر Scientific | M35-500 | للمحلول الملحي |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | Millipore Sigma | C7902 | للسكروز الملحي |
| فيشر Scientific | S5-3 | للمحلول الملحي | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | للمحلول الملحي |
| HRP: Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | لتسمية الأغشية العصبية |
| فرشاة | الرسم Winsor & amp نيوتن | 94376864793 | للتلاعب باليرقات |
| ملاقط دومون دوموستار # 5 | WPI | 500233 | يستخدم أثناء التشريح |
| 7 سم McPherson-Vannas Microscissors (شفرات 3 مم) | WPI | 14177 | يستخدم أثناء التشريح ; |
| FM1-43 | فيشر Scientific | T35356 | صبغة الفلورسنت ستايريل |
| الموقت الرقمي | VWR | 62344-641 | لتوقيت تحميل / تفريغ صبغة FM ؛ |
| LSM 510 META مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر | Zeiss | لتصوير علامات الفلورسنت | |
| Zen 2009 SP2 الإصدار 6.0 | برنامج Zeiss | للتصوير على | |
| ليزر HeNe 633nm | Lasos | لإثارة HRP: 647 أثناء التصوير | |
| ليزر Argon 488nm | Lasos | لإثارة صبغة FM أثناء التصوير | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | لإطلاق الماصات الدقيقة الزجاجية البولندية |
| 20 مل طرف حقنة انزلاق | BD | 301625 | لامتصاص المحور العصبي للتحفيز الكهربائي. |
| مناور دقيق (قاعدة مغناطيسية) | Narishige | MMN-9 | للتحكم في قطب الشفط للتحفيز الكهربائي |
| محفز | العشب | S48 | للتحكم في LED والتحفيز الكهربائي |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | المستخدم أثناء التحفيز الكهربائي. | |
| 40X Achroplan الغمر في الماء الهدف | Zeiss | يستخدم أثناء التحفيز الكهربائي والتصوير متحد البؤر | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | العامل المساعد الأساسي لمجهر ChR2 |
| Zeiss Stemi مع منفذ الكاميرا | Zeiss | 2000-C | يستخدم أثناء تحفيز القناة رودوبسين |
| LED 470 نانومتر | ThorLabs | M470L2 | يستخدم لتنشيط ChR |
| T-Cube LED سائق | ThorLabs | LEDD1B | للتحكم في |
| LED LED مزود الطاقة | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | لتشغيل |
| مقياس الطاقة الضوئية والطاقة LED | ThorLabs | PM100D | لقياس شدة LED |
المراجع
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
