الاعتداء على أساس البيوتين المنسدلة للتحقق من صحة مرناً ميرناس "الأهداف الخلوية"

Summary

ويصف هذا التقرير طريقة سريعة وموثوق بها للتحقق من صحة الأهداف مرناً من ميرناس الخلوية. يستخدم أسلوب يحاكي ميرنا بيوتينيلاتيد الاصطناعية على أساس تأمين LNA "الحمض النووي" لالتقاط الهدف مرناً. بعد ذلك، تستخدم المغلفة streptavidin الخرز المغناطيسي المنسدلة الهدف مرناً للقياس الكمي ب qPCR تفاعل البوليميراز المتسلسل.

Abstract

ميكرورناس (ميرناس) هي فئة من الكشف فضله الصغيرة التي بوستترانسكريبتيونالي تنظيم تعبير الجينات الخلوية. ربط ميرناس إلى 3 ' غير مترجمة المنطقة (UTR) لاستهداف مرناً تحول دون ترجمة البروتين أو في بعض الحالات يتسبب في تدهور مرناً. ربط ميرنا إلى 3 'UTR الهدف هو بتسلسل بذور النوكليوتيدات 2-8 في 5' نهاية ميرنا وساطة مرناً. على الرغم من دور ميرناس كجزيئات التنظيمية الخلوية، تحديد مرناس المستهدفة ذات الصلة الوظيفية لا يزال يمثل تحديا. وقد استخدمت أدوات Bioinformatic للتنبؤ بتسلسل داخل 3 ' UTR من مرناس كأهداف محتملة لربط ميرنا. كما استخدمت هذه الأدوات لتحديد حفظ التطوري لهذه التسلسلات بين الأنواع ذات الصلة في محاولة للتنبؤ بدور وظيفي. ومع ذلك، هذه الطرق الحسابية غالباً ما توليد نتائج إيجابية زائفة وتقتصر على التنبؤ بالتفاعل المقبول بين ميرنا ومرناً. ولذلك، إجراءات تجريبية تقيس الربط المباشر لميرنا إلى هدفها مرناً ضرورية لإقامة التفاعل الوظيفي. وفي هذا التقرير، يصف لنا طريقة حساسة للتحقق من التفاعل المباشر بين ميرنا الخلوية مير-125b و 3 ' مرناً UTR نشطت-1. يمكننا وضع بروتوكول الذي تم transfected يقلد ميرنا بيوتينيلاتيد الاصطناعية في خلايا الثدييات وتهدمه المجمع ميرنا مرناً في الخلوي ليساتي مع الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين. وأخيراً، الهدف كان كمياً مرناً في سحبها إلى أسفل الحمض النووي المعقدة باستخدام استراتيجية قائمة على قبكر.

Introduction

ميكرورناس (ميرناس) صغيرة غير الترميز الكشف التي تنظم سلبا على بروتين التعبير¹. سلائف ميرنا الموجودة في مجموعات من خلال العديد من مناطق الجينوم، معظم الأحيان داخل المناطق إينتيرجينيك وإينترونس من البروتين ترميز الجينات^2،3. نشوء حيوي ميرناس تشمل النسخ من الحزب الثوري المؤسسي-ميرناس من ميرنا-ترميز الجينات⁴. الحزب الثوري المؤسسي-ميرناس الخضوع لمعالجة متسلسلة، أولاً في النواة، ومن ثم في السيتوبلازم لتوليد واحد الذين تقطعت بهم السبل ميرناس ناضجة^4،5. بعد ذلك، أدرجت ميرناس ناضجة في المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC): مجمع بروتين-الجيش الملكي النيبالي مولتيميريك التي تضم عضوا من عائلة البروتينات لهدف الاعتراف^{4،5، أرجوناوتي 6،7}. ميرناس ناضجة في RISC معقدة الغالب ربط 3 'UTR الهدف مرناس^8،،من⁹¹⁰ ، لكن يمكن أيضا ربط أحياناً في الترميز والمنطقة UTR 5' مرناً^10،11 . ربط ميرنا مرناً تسلسل النتائج في إسكات متعدية^12،،من¹³¹⁴ ، وفي بعض الحالات مرناً زعزعة¹⁵. حيث يمكنك استهداف ميرنا واحد مرناس كثيرة، يشاركون في العملية الخلوية تقريبا كل هذه الجزيئات التنظيمية وقد تورطت في المرض مختلف الظروف^16،17،18.

فهم تفصيلي لكيفية تنظيم ميرناس المسارات الخلوية يتطلب تحديد مرناس المستهدفة. تتوفر أنظمة المعلوماتية متعددة للتنبؤ miRNA:mRNA المفترضة التفاعلات^19،20. تعتمد هذه التوقعات على الكمال واتسون-كريك إقران قاعدة بين النوكليوتيدات 2 – 8 تسلسل البذور ميرنا وتسلسل تكميلية ضمن الهدف مرناً^4،21. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأدوات إنشاء هيكل مزدوج miRNA:mRNA الثانوي وحساب معلمات دينامي حراري لهذا التفاعل الجزيئي وإظهار المحافظة على مواقع الربط عبر الأنواع تعزيز صلة وظيفية للهدف التنبؤ. لسوء الحظ، هذه الأدوات أيضا أن يكون الحد من التنبؤ بأهداف إيجابية كاذبة في^15،معدل مرتفع جداً (~ 27-70 ٪)²². الأهم من ذلك، تفشل هذه المنصات في السيليكون الاعتراف غير المقبول تفاعلات ميرناس مع تلك الأهداف²³. ولذلك، هذه التحليلات التنبؤية هي غالباً جنبا إلى جنب مع طرق تجريبية للتحقق من صحة الأهداف ذات الصلة وظيفيا.

وضعت نهوج متعددة للتحقق تجريبيا من التفاعل miRNA:mRNA. التجارب الجينية باستخدام يقلد ميرنا، والإسفنج والموانع التي تغير مستويات ميرناس في الخلية توفر القرائن لأثره التنظيمية في الهدف الجينات التعبير^24،،من²⁵²⁶. بالإضافة إلى ذلك، مراسل على أساس فحوصات عبر تعداء المشارك لاستنساخ تحتوي على 3 ' UTR منطقة يقلد مرناً وميرنا المستهدفة أو مثبطات في خلايا تقديم الأدلة للوظيفة الرقابية ميرناس²⁶. في حين أن هذه الأساليب حاسمة لدراسة تنظيم التعبير الجيني بوستترانسكريبشونال من ميرناس، تعداء الكفاءة وبليوتروبيك آثار التغيرات في مستويات ميرنا الخلوية هي القيود الرئيسية من هذه النهج الوراثية^{23، 26}. ولذلك تستخدم الطرق البيوكيميائية التكميلية التي التحقيق التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها فهم أفضل لوظيفة الخلوية ميرناس.

أسلوب واحد يستخدم على نطاق واسع لدراسة التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها إيمونوبريسيبيتيشن RISC معقدة متبوعاً بكشف الهدف مرناً داخل مجمع^27،،من^2829،30 . في الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا طريقة مصيدة RISC محسنة لتحديد أهداف ميرنا؛ الأزواج استقرار الأهداف داخل وسيطة RISC-ميرنا-مرناً مع تنقية الأهداف مرناً. ومع ذلك، ميثودسفيس هذه التحديات الملازمة للتفاعلات غير محددة بين الجيش الملكي النيبالي والجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات التي عادة ما يتم فصل من مقصورات الهاتف الخلوي^31،32. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الاختبارات التي تعتمد على وجود بروتين AGO2 إيمونوبريسيبيتيشن من مجمع RISC³³. نظراً لأن AGO2 لا أرجوناوتي فقط للتوسط في التفاعلات miRNA:mRNA فعالة، يمكن أن يؤدي استبعاد الأخرى أرجوناوتيس إلى نتائج متحيزة³⁴. ولذلك، هناك حاجة إلى استراتيجيات بديلة لدراسة الربط المباشر لميرنا مرناً.

في هذا التقرير، يمكننا وضع نهج خطوة واحدة ليحقق التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها مرناً. أولاً، يتم ترانسفيكتيد 3 ' بيوتينيلاتيد مؤمن يقلد ميرنا الحمض النووي (LNA) في خلايا الثدييات. ثم، يتم التقاطها miRNA:mRNA المعقدة في الخلوية ليستي استخدام الخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة. الهدف مرناً منضم إلى ميرنا مكملة لها هو كمياً باستخدام قبكر.

Protocol

1-تعداء ميرنا 3 '--بيوتينيلاتيد

ملاحظة: الخطوات التالية داخل غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة.

1. البذور 4 × 10⁵–5 × 10⁵ HEK 293T الخلايا كل بئر في 2 مل من إكمال تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) [دميم وتستكمل مع 10% مصل "بقرى الجنين" (FBS) و 1 × القلم-بكتيريا المضادات الحيوية]. ثقافة الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ بين عشية وضحاها.
2. في اليوم التالي، تحقق من الصحة والانضمام للخلايا مطلي تحت مجهر خفيفة.
   ملاحظة: تأكد من الخلايا يكون التقيد ويبلغوا مورفولوجيا المناسبة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. الخلايا HEK 293T مستعدون عادة تعداء ح 18 – 24 وظيفة الطلاء.
3. في أنبوب [ميكروفوج] مل 1.7 عقيمة، تضعف بيكوموليس 75 من ميرنا بيوتينيلاتيد في 200 ميليلتر من الوسائط الأساسية الحد الأدنى. نقل هذا المزيج إلى آخر 1.7 مل [ميكروفوج] أنبوب يحتوي على الحويصلية تعداء استناداً إلى كاشف (8 ميليلتر في البئر) المخفف في 200 ميليلتر من الوسائط الأساسية الحد الأدنى. مزيج دقيق، ولكن بلطف، بيبيتينج واحتضانها لمدة 20-25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتشكيل مجمعات تعداء.
4. قم بإزالة الوسائط القديمة من لوحة 6 الثقافة جيدا قبل بيبيتينج لطيف وتجديد كل بئر مع 1.6 مل دميم كاملة طازجة (دون 1 × القلم-بكتيريا المضادات الحيوية).
5. إضافة مجمعات تعداء (من 1.3) دروبويسي إلى الخلايا الموجودة في لوحة 6-كذلك استخدام ماصة محسوبة جيدا. دوامة اللوحة برفق أثناء إضافة المجمعات ضمان توزيعها موحدة عبر اللوحة.
   ملاحظة: هذه الخطوة هي حرجة للغاية لتحقيق الكفاءة العالية تعداء ويجب أن تتم بعناية وصبر.
6. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لح 36 على الأقل.

2-إعداد Streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي — أنا

1. ريسوسبيند الخرز المغناطيسي ستريبتافيدين تماما من فورتيكسينج. نقل 30 ميليلتر من حبة تعليق (كل عينة) إلى أنبوب نوكلاس الحرة [ميكروفوج] 2 مل.
2. ضع الأنبوبة التي تحتوي على تعليق حبة في موقف فاصل حبة المغناطيسي ("المغناطيس" يشار إليها فيما بعد) لمدة 2 دقيقة. بعد التأكد من أن يتم رسمها الخرز إلى جانب الأنبوب على اتصال بالمغناطيس، بعناية إزالة المادة طافية باستخدام ميكروبيبيتي.
3. إضافة 100 ميليلتر من حبة يغسل المخزن المؤقت (10 ملم تريس Cl الرقم الهيدروجيني 7.5، يدتا 0.5 مم، 1 م كلوريد الصوديوم) الخرز. إزالة الأنبوب من المغناطيس. دوامة لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة لغسل الخرز.
4. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرز على المغناطيس لمدة 2 دقيقة، وإزالة بعناية وتجاهل المادة طافية.
5. كرر الخطوات من 2.3 و 2.4 لما مجموعة ثلاث يغسل. بعد خطوة الغسيل النهائي، إزالة الأنبوب من المغناطيس.
6. إضافة 100 ميليلتر من رناسي تحرير الحل (0.1 M هيدروكسيد الصوديوم، وكلوريد الصوديوم م 0.05) الخرز، ومزيج جيد من قبل فورتيكسينج لمدة 15 ثانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرز على المغناطيس لمدة 2 دقيقة، بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
7. كرر الخطوة 2.6 لما مجموعة ثلاث مرات.
8. إضافة حبة استثارة الحل (0.5 م كلوريد الصوديوم) الخرز، دوامة 15 ثانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان الخرز ريسوسبينديد على المغناطيس لمدة 2 دقيقة، وإزالة المادة طافية بعناية.
9. إضافة 200 ميليلتر من عرقلة الحل (1 ميكروغرام/ميليلتر جيش صرب البوسنة، 2 ميكروغرام/ميليلتر الخميرة الحمض الريبي النووي النقال) حبة الخرز. مزيج من فورتيكسينج لطيف لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تبني في 4 درجات مئوية عن ح 16 (ليلة المفرط) على المدورة أنبوب متعدد.

3-إعداد ليساتيس خلية

1. حصاد الخلايا HEK 293T transfected بإلغاء لطيف باستخدام مكشطة خلية عقيمة داخل غطاء الصفحي، ثم نقل كل عينة في أنبوب عقيم 2 مل [ميكروفوج].
2. بيليه كشط الخلايا باستخدام الطرد المركزي في س 1,500 ز للحد الأدنى 5 ريسوسبيند بيليه في 1 × PBS العقيمة (الفوسفات المخزن المؤقت المالحة)، الرقم الهيدروجيني 7.2. الطرد المركزي مرة أخرى في س 1,500 ز لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه خالية من وسائل الإعلام المتبقية. فورا يغرق أنبوب يحتوي على بيليه في الجليد.
3. إعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلية كاملة جديدة (150 مم كلوريد الصوديوم، 25 مم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني-7.5، 5 مم DTT، 0.5% إيجيبال، 60 يو/مليلتر سوبراس، 1 x مثبط البروتياز).
   ملاحظة: قد أعدت مسبقاً بمخزون من المخزن المؤقت لتحلل الخلية تفتقر إلى كوكتيل المانع إيجيبال، سوبراس، ومبطلات وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. إعداد دفعة جديدة من المخزن المؤقت لتحلل الخلية كاملة بإضافة المكملات الغذائية أعلاه في تركيزات النهائي الموصى به للمخزن المؤقت تحلل الخلية الأسهم وتخزينها على الجليد.
4. إضافة ميليلتر 260 من المخزن المؤقت لتحلل الخلية كاملة المثلج لكل عينة في [ميكروفوج] أنابيب (أي كل [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على خلايا حصادها من بئر واحدة للوحة 6-جيدا) وريسوسبيند بيليه الخلية إلى تعليق متجانسة من بيبيتينج.
5. الخلايا باستخدام طريقة تجميد أذاب: احتضان هذه الأنابيب في-80 درجة مئوية لمدة 10 – 15 دقيقة. ثم، تسمح للخلايا لذوبان الجليد على الجليد.
6. الطرد المركزي في الخلية الناتجة في س 16,000 ز لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد مركزي benchtop مبردة تعيين عند 4 درجة مئوية.
7. نقل الخلية الممسوحة ليستي إلى أنبوب [ميكروفوج] مل 1.7 عقيمة على الجليد. تجاهل بيليه.
   ملاحظة: وحدة التخزين النهائي لمسح ليستي ينبغي ~ 240 – 250 ميليلتر.
8. إضافة 5 م كلوريد الصوديوم لتطهير ليساتي إلى تركيز نهائي 1 م والمحافظة على العينات على الجليد.

4-إعداد ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز – الثاني

1. إعداد المخزن المؤقت كاملة جديدة سحب لأسفل المياه والصرف الصحي (10 ملم بوكل 1.5 مم مجكل₂، 10 مم تريس Cl الرقم الهيدروجيني 7.5، 5 ملم DTT، م 1 كلوريد الصوديوم، 0.5% إيجيبال، 60U/mL سوبراس وكوكتيل "مثبط البروتياز" 1 x)
   ملاحظة: قد أعدت مسبقاً بمخزون من المخزن المؤقت يغسل المنسدلة التي تفتقر إلى كوكتيل المانع إيجيبال، وسوبيراسي، ومبطلات وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. إعداد دفعة جديدة من المخزن المؤقت لتحلل الخلية كاملة بإضافة المكملات الغذائية أعلاه في تركيزات النهائي الموصى به للمخزن المؤقت تحلل الخلية الأسهم وتخزينها على الجليد.
2. ضع أنبوب يحتوي على الخرز المعدة (من الخطوة 2.9) على المغناطيس للحد الأدنى 2 إزالة وتجاهل المادة طافية بعناية.
3. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت كاملة المثلج سحب لأسفل المياه والصرف الصحي الخرز. دوامة لمدة 15 ثانية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمكان 30-60 س. هذه الأنابيب في المغناطيس للحد الأدنى 2 إزالة وتجاهل المادة طافية بعناية.
4. كرر الخطوة 4، 3 لإجمالي 3 مرات.
5. ريسوسبيند الخرز في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت كاملة المنسدلة الغسيل.

5-سحب لأسفل مجمعات المستهدفة مرناً-ميرنا

1. نقل 300 ميليلتر من الخلية ليستي (من الخطوة 3، 8) إلى [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على 300 ميليلتر من الخرز (من الخطوة 4، 5).
2. احتضان هذا الخليط في خلاط نوتاتينج ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
3. ضع الأنبوب على المغناطيس لإزالة الحد الأدنى 5 بعناية، وتجاهل المادة طافية.
4. إضافة 300 ميليلتر من المخزن المؤقت كاملة المثلج سحب لأسفل المياه والصرف الصحي الخرز. دوامة لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة ومكان الأنبوب في المغناطيس للحد الأدنى 5 إزالة وتجاهل المادة طافية بعناية.
5. كرر الخطوة 5.4 مرتين أخريين.
6. ريسوسبيند الخرز في 100 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس واحتضان على الجليد.

6-مجموع "استخراج الحمض النووي الريبي" وكدنا توليف قبكر

1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخرز ريسوسبينديد (من الخطوة 5، 6) باستخدام أسلوب مناسب (انظر الجدول للمواد). ريسوسبيند رنا الإجمالية المستخرجة في 25 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي والجودة باستخدام جهاز المطياف الضوئي (امتصاص في 260/280). إعداد رصيد عامل من الجيش الملكي النيبالي في 50 نانوغرام/ميليلتر.
2. إجراء توليف كدنا، في تريبليكاتيس، باستخدام 50 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي (من الخطوة 6، 1) استخدام توليف كدنا ملائمة طقم (انظر الجدول للمواد) باستخدام اليغو dT الإشعال بحجم نهائي في 20 ميليلتر (الجدول 1). ثم تحميل أنابيب PCR إلى أداة qPCR القيام بركوب الدراجات الحرارية وفقا للشروط الموضحة في الجدول 2.
3. إجراء قبكر على كدنا (من الخطوة 6.2) باستخدام الكيمياء "الخضراء سيبر" (انظر الجدول للمواد):
   1. أداء جميع ردود الفعل قبكر في تريبليكاتيس في صفيحة 96 أسفل واضحة أيضا في ظروف معقمة.
   2. مزيج ميليلتر 9 الكوة في رد فعل خليط من سيد قبكر (انظر الجدول 3) في كل بئر من اللوحة. ثم إضافة ختم 1 ميليلتر من كدنا لكل بئر لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 10 ميليلتر. لوحة بكر استخدام السدادة لوحة بكر مقاومة للحرارة وتحميل من صك قبكر
   3. أداء ركوب الدراجات الحرارية وفقا للشروط الموضحة في الجدول 4.
   4. تطبيع مستويات التعبير (قيم Ct) لكل عينة إلى مستويات التعبير لعنصر التحكم المجمعة. استخدام هذه القيم لحساب التغييرات حظيرة في التعبير.

Results

ميرناس تنظيم العمليات الخلوية بالربط إلى مرناس الهدف. ولذلك، تحديد أهداف مرناً مفتاح لفهم وظيفة ميرنا. هنا يمكننا وضع طريقة لتحديد الهدف مرناً لميرنا الخلوية. هذا البروتوكول مقتبس من أني et al. ³⁵ مع التعديل للاستفادة من بيوتينيلاتيد يقلد ميرنا LNA المستندة إلى المنسدلة الهدف مرناً. يحسن استخدام المستندة إلى LNA اليغنوكليوتيد يقلد خصوصية ملزم الهدف نظراً لاستقرار أعلى من الطوق الريبوز معدلة دون التأثيرات السمية^36،،

Discussion

تحديد أهداف مرناً من ميرناس الخلوية مهم لفهم وظيفتها التنظيمية. وتستخدم العديد من الأدوات الحسابية للتنبؤ بأهداف تستند إلى تكامل تسلسل البذور والمحافظة على الهدف تسلسل^19،20. على الرغم من أن هذه الأدوات قيمة، أنها يمكن أن تولد مستويات عالية من كاذبة إيجابيات وسلبيات كاذبة. ولذلك، تقترن هذه التنبؤات بالأساليب التجريبية مثل إيمونوبريسيبيتيشن RISC المعقدة وسحب لأسفل لمجمع miRNA:mRNA لتأكيد الربط المباشر من ميرناس إلى تلك الأهداف الخاصة بكل منها²⁷

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
خط الخلية- خلايا HEK293T	ATCC	CRL-3216
مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة (Hi-FBS)	GIBCO / Thermofisher	10438-026
Dulbecco s النسر المعدل s medium (DMEM)	GIBCO / Thermofisher	11995-065
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1x)	GIBCO / Thermofisher	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25٪)	GIBCO / Thermofisher	25200-056
محلول البنسلين والستربتومايسين (100x) Cellgro	/ Mediatech	30-002-CI
DNase	Ambion	AM2238
Opti-MEM وسائط مصل مخفضة	GIBCO / Thermofisher	3198-088
Liopfectamine 2000 كاشف Transfection	Invitrogen / Thermofisher	11668-019
بيوتينيل has-miR-125b	Exiqon	339178 / ID-27281622
التحكم المخفوق البيوتينيل	Exiqon	479997-671 / ID-714884
IGEPAL	Sigma-Aldrich	18896
Streptavidin الخرز المغناطيسي	بيرس	88816
الخميرة tRNA	Invitrogen / Thermofisher	15401-011
ألبومين مصل البقر (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
محلول كلوريد البوتاسيوم (KCl)	Sigma-Aldrich	60142
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / فرعي >	هيدروكسيد الصوديوم Sigma-Aldrich	M1028
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)	Sigma-Aldrich	795429
حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك ، محلول ملح ثنائي الصوديوم (EDTA) ، 0.5 م ، درجة الحموضة 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Superase	Ambion / Thermofisher	AM2694
كوكتيل مثبط البروتياز	Sigma-Aldrich	P8340
RNAse / DNAse ماء	خال من GIBCO / Thermofisher	10977-015
RNeasy مجموعة الاستخراج	Qiagen	74104
iScript-Select مجموعة توليف cDNA	Biorad	170-8897
qPCR Primers   ؛	Invitrogen / Thermofisher
iTaq-Universal SYBR الأخضر سوبرميكس	Biorad	172-5120
DynaMag-Spin Magnet	Invitrogen / Thermofisher	12320D