غلوبيولين مناعي تحليل تسلسل الجين في اللوكيميا اللمفاوية المزمنة: من المواد المريض إلى تفسير التسلسل

ملخص

وهنا، فإننا نقدم بروتوكول تفاصيل الجوانب التقنية ومتطلبات أساسية لضمان تحليل تسلسل الجين IG قوية في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، استناداً إلى الخبرة المتراكمة للمبادرة "الأوروبية للبحث" في CLL (إريك).

الملخص

أثناء نضج الخلية ب، يقترن عملية معقدة من الغلوبولين المناعي (IG) الجين الخامس (د) ي التثب تثير هايبرموتيشن جسدية (SHM) تسلسل الحمض النووي فريدة من نوعها داخل كل خلية بالفرديه. منذ الخلية بالاورام الخبيثة نتيجة للتوسع في الاستنساخ من خلية واحدة، تمثل الجينات IG توقيع فريد جزيئية مشتركة لكافة الخلايا الخبيثة داخل مريض فردية؛ وهكذا، يمكن استخدام IG الجينات ترتيبات جديدة كعلامات للاستنساخ. بالإضافة إلى خدمة كمعرّف الاستنساخ هامة، يمكن أن تعمل بالتسلسل الجيني IG زمني جزيئية نظراً لأنه يرتبط بمراحل تنموية محددة ومن ثم يعكس تاريخ الخلية بالمشاركه في التحول الورمية. وعلاوة على ذلك، لبعض الأورام الخبيثة، خاصة سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، التسلسل الجيني IG يحمل قدرات تشخيصية ويحتمل أن تكون تنبؤية. وقال أن استقراء استنتاجات ذات معنى من تحليل التسلسل الجيني IG سيكون مستحيلاً إذا أدوات وأساليب قوية لم تكن متاحة للمساعدة في التحليل. هذا المقال، استناداً إلى الخبرة الواسعة "المبادرة الأوروبية من البحوث" في CLL (إريك)، وتفاصيل الجوانب التقنية والمتطلبات الأساسية اللازمة لضمان موثوق بها واستنساخه IG تسلسل الجين التحليل في CLL، اختبار أن ينصح الآن لجميع المرضى CLL قبل المعالجة. وبشكل أكثر تحديداً، وصف مختلف مراحل تحليلية تتراوح بين تحديد إعادة ترتيب الجينات IG كلونوتيبيك وتحديد تسلسل النوكليوتيدات لتفسير البيانات التسلسل الجيني IG سريرية دقيقة.

المقدمة

الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، الشكل الأكثر شيوعاً لسرطان الدم لدى البالغين في البلدان الغربية، ويتسم بالتوسع في الاستنساخ ناضجة الورم خلايا ب¹. من وجهة نظر سريرية، مسار المرض متغير جداً مع بعض المرضى تعاني من مرض عدوانية، التي تتطلب العلاج في وقت مبكر جداً بعد التشخيص، وغالباً ما الانتكاس أو يجري تعدينها للعلاج. وهذا في تناقض صارخ مع نسبة كبيرة من المرضى (~ 30 ٪) الذي يقدم مع مرض كسول، ابدأ يحتاجون إلى علاج، ويكون متوسط العمر المتوقع مماثلة للأشخاص الأصحاء مطابقة سن². وينعكس هذا التغايرية السريرية في تنوع شذوذ الجزيئية التي وجدت في CLL المرضى التي تدفع في نهاية المطاف المرضية وتطور هذا المرض³.

وضع تشخيص دقيق CLL بسيط عادة، بيد أن التغايرية السريرية المذكورة آنفا قد تعوق الإدارة الفعالة للمرضى CLL ويؤكد الحاجة إلى علامات تشخيصية والتنبؤيه التي يمكن أن تساعد في العلاج صنع القرار². وحاولت العديد من الدراسات صقل منذرة CLL، بلغت ذروتها في وفرة علامات سريرية وبيولوجية رواية يجري المقترحة⁴. حيث وضع الجين المتغير الثقيلة (إيغف) غلوبيولين مناعي كلونوتيبيك واحد من أقوى علامات تشخيصية في CLL، إلى حد كبير يرجع ذلك إلى حقيقة أن (ط) لا تزال مستقرة على مر الزمن، ومع تقدم المرض، و (الثاني) مستقل عن الآخر ⁵من المعلمات السريرية والبيولوجية. أنه على الرغم من ذلك، علامات قليلة جداً، أن وجدت، بما في ذلك حالة حيث إيغف، تطبيق حاليا في السريرية الروتينية في وقت التشخيص.

التقارير الأولية بشأن فائدة سريرية للتسلسل الجيني IG في CLL ترجع إلى عام 1999، عندما أفادت دراسات مستقلة 2 أن المرضى الذين يعانون من لا أو حمولة هايبرموتيشن جسدية الحد أدنى (SHM) (CLL أونموتاتيد، يو-CLL) يكون تشخيص أسوأ من المرضى تحمل ارتفاع عبء SHM (تحور CLL، M-CLL)^6،7. وبشكل أكثر تحديداً، تالف الفريق يو-CLL الحالات التي تأوي جينات إيغف كلونوتيبيك مع SHM قليلة أو لا ومن ثم هوية النسبة مئوية مرتفعة للجينات إيغف الخط الأقرب (إيه ناين إيت %)، تكونت من الحالات مع حمولة أعلى حيث M-CLL (الهوية نسبة إلى جين إيغف الخط الأقرب < 98 ٪). منذ هذه الدراسات المبكرة، باستمرار ثبت أن حالات يو-CLL عرض أقصر وقت لأول العلاج (تفت) وبقاء الشاملة (نظام التشغيل) بالمقارنة مع M-CLL.

في وقوعه، أبرزت هذه الدراسات المنوي الدور المحوري لمستقبلات الخلية ب (المركز) المفتش العام في بل CLL، مما يمهد السبيل لبحوث مستفيضة في التفاعلات CLL-ميكرونفيرونمينتال الذي، بدوره، أدى إلى فهم أكثر شمولاً عدم تجانس البيولوجي لهذا المرض^8،9. مزيد من الدراسات الأخيرة قد قدمت دعما إضافيا لأهمية تحليل إيمونوجينيتيك في CLL بالكشف عن أن حالات فردية قد الكتلة في مجموعات فرعية بسبب مشاركة (شبه) تسلسل الجين IG المركز متطابقة، ووصف ظاهرة IG بنك ستيريوتيبي^{10 11، ،،}من¹²¹³. تتراكم الأدلة تؤيد الفكرة أن المرضى الذين تم تعيينها إلى نفس نمطية فرعية ميناء كلينيكوبيولوجيكال خصائص مشابهة بوضوح فصلها عن المرضى CLL الأخرى ضمن نفس فئة SHM ولكن مع تسلسل الجين IG مختلفة؛ وفي الواقع أبلغ أن تصنيف المرضى CLL استناداً إلى stereotypy IG المركز كذلك تهذب الفصل الجزء الأكبر من المرضى CLL في يو-CLL أو M-CLL مجموعات^14،،من^{1516، 17 , 18 , 19 , 20}.

من وجهة نظر سريرية، جدير بالذكر أن حالة SHM الجين إيغف كلونوتيبيك ويبدو أن ترتبط برد محدد على تشمويمونوثيرابي. في خاص، M-CLL المرضى تعامل مع مزيج من فلودارابيني/السيكلوفوسفاميد/rituximab (FCR)، أظهرت معاملة معيار الذهب للمرضى CLL طبيا مناسباً تفتقر إلى عيوب الجين TP53 ، لم يعد إلى حد كبير خالية من التقدم البقاء على قيد الحياة (PFS) ونظام التشغيل بالمقارنة مع يو-CLL المرضى الذين تلقوا نفس المعاملة^21،،من²²²³. ولذلك، تحديد حالة SHM أصبحت مهمة خاصة للمساعدة في إدارة العلاجية CLL المرضى أي علامة تنبؤية، بدلاً من تقييم مسار السريرية المرض أي علامة تشخيصية. في الواقع، وفقا للتحديث الأخير للمبادئ التوجيهية التي ترعاها لجنة التحقيق الوطنية من "حلقة العمل الدولية" شأن CLL، حالة SHM الجينات إيغف آخر أعيد ترتيبه ينبغي أن تكون مصممة في جميع الحالات CLL قبل بدء العلاج في الممارسة العامة على حد سواء والسريرية ²⁴من المحاكمات. وعلاوة على ذلك، نظراً للموافقة الأخيرة على وكلاء العلاج الرواية، والعدد المتزايد للمخدرات في المحاكمات، حالة SHM جزيء IG قد تلعب دوراً أكبر في الإدارة العلاجية للمرضى الذين يعانون من CLL في المستقبل القريب⁵.

يتضمن هذا التقرير تفاصيل جميع جوانب تحليل تسلسل الجين المفتش العام، بدءاً باختيار المواد المناسبة، وبلغت ذروتها مع تفسير تسلسل النتائج السريرية. من المهم إجراء تقييم متعمق لهذه الخطوات في التشخيص الروتيني لإنتاج نتائج موثوق بها وضمان دقة الطبقية المرضى في التجارب السريرية. يتم توفير بروتوكولات للمساعدة في تنسيق تحليل تسلسل الجين المفتش العام، وبالتالي ضمان أن النتائج قابلة للمقارنة بين المختبرات المختلفة.

البروتوكول

وأقر البروتوكول البحوث "لجنة الأخلاقيات" سان رافائيل المعهد العلمي، ميلانو، إيطاليا.

1-مواد مختارة

1. خيار البدء بالمواد
   ملاحظة: في معظم الحالات من CLL عدد خلايا الورم عالية في التشخيص (> 80-90 ٪). وهكذا، فرز الخلايا أو تخصيب الخلايا ليوكيميك عادة غير ضروري.
   1. في حالة استخدام الدم المحيطي (PB)، استخدام المواد الأكثر شيوعاً من خيار لتحليل التسلسل الجيني IG، حجم دم بين 10-20 مل.
   2. بدلاً من ذلك، في حالات انخفاض عبء خلية CLL، استخدام الخلية فرز عينات PB أو المواد من الأنسجة الأخرى، مثل نخاع العظم (بي أم) أو العقد الليمفاوية (LN).
2. وقت أخذ العينات
   1. أخذ العينات الزمنية ليست حاسمة نظراً لأن حالة IG SHM الإضافي مستقرة؛ وقال أن، وتجنب أخذ العينات في فترات معينة، مثل فورا بعد أو أثناء العلاج، نظراً لانخفاض عدد الخلايا CLL قد تؤدي إلى تعقيد التحليل وتؤدي إلى نتائج يمكن الاعتماد عليها.
3. جمع المواد والتخزين
   ملاحظة: جمع وتخزين ابتداء من المواد تعتمد بشدة على اختيار المواد.
   1. لعينات PB أو BM، استخدام يدتا أو CPT أنابيب جمع (سترات-تريس-بيريدوسالفوسفاتي) لمنع تثبيط عملية التضخيم بكر؛ بدلاً من ذلك، استخدام أنابيب الهيبارين.
   2. لعينات LN، مجموعة الخيارات أما تعليق خلية، الخزعات من الأنسجة المجمدة الطازجة، أو في حالات نادرة الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الأنسجة.

2-كثافة الفصل التدرج

ملاحظة: إذا كانت الجريدة الرسمية أو BM المواد بدءاً من الاختيار، وهو السيناريو الأكثر شيوعاً، ينصح عزل الخلايا وحيدات النوى استخدام كثافة الفصل التدرج.

1. إضافة 200 ميليلتر يدتا (يدتا 0.5 M/pH 8.0) إلى أنبوب جمع عقيمة 50 مل. إضافة 20 مل من الجريدة الرسمية و 15 مل من ربمي. مزيج من بيبيتينج (2-3 مرات غير كافية).
2. إضافة 15 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار إلى أنبوب جمع 50 مل جديدة.
   ملاحظة: في حالة وحدة التخزين الجريدة الرسمية أقل من 20 مل، وحدات التخزين ربمي (الخطوة السابقة) وكثافة التدرج ينبغي تعديلها تبعاً لذلك.
3. طبقة ببطء في الحل من الخطوة 2، 1 حيث أن ذلك يخل بالتدرج. الطرد المركزي في غ 800 x لمدة 20 دقيقة مع الفرامل الطرد المركزي قبالة.
4. جمع الحلبة الخلايا وحيدات النوى التي شكلت بين الطبقة العليا البلازما/الصفائح الدموية والطبقة المتوسطة التدرج كثافة استخدام ماصة باستور معقمة، ثم نقل إلى أنبوب جمع عقيمة 15 مل.
5. إضافة ربمي إلى وحدة تخزين نهائي من 12 مل ومزيج. الطرد المركزي في 750 x ز لمدة 8 دقائق. تجاهل المادة طافية.
6. ريسوسبيند بيليه الخلية باستخدام 10 مل ربمي وكرر الخطوة 2، 5.
7. حل بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني (دببس، لا الكالسيوم والمغنيسيوم لا). القيام بعدد خلايا استخدام لوحة نويباور بخلط 20 ميكروليتر من عينة وميليلتر 80 من 01:10 الحل تورك.
8. إذا ليس من التجهيز النهائي للعينة المقرر في اليوم نفسه، الطرد المركزي العينة في 750 x ز لمدة 8 دقائق. تجاهل المادة طافية وتخزين بيليه الخلية في جيم-80^س

3. استخراج الحمض النووي

1. اتخاذ قرار بشأن ركيزة لتحليل حالة SHM IG الجينات. الحمض النووي (جدنا) هو الخيار الأكثر شعبية كما ليس هناك حاجة لخطوة نسخ عكسي؛ بدلاً من ذلك، استخدام الحمض النووي الريبي/التكميلية الحمض النووي (كدنا) يضمن، على الأقل على المستوى النسخي، إعادة ترتيب IG كلونوتيبيك الإنتاجية والفنية المستهدفة "المفضلة".
2. استخدم واحدة من مجموعات المتاحة تجارياً عديدة مناسبة لجدنا أو مجموع استخراج الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا (انظر الجدول للمواد).
3. تقييم سلامة الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي استخدام نظم القياس الكمي الأحماض النووية الحساسة. في حالة استخدام مواد فب للتحليل، وتقييم نوعية وكمية المستخرج جدنا/كدنا قبل [بكر] تضخيم الجينات المعروفة التدبير المنزلي، ألفا مستقبلات حمض الريتينويك مثلاً (راره)، بيتا-أكتين، و ما إلى ذلك.

4-التضخيم وتتابع ترتيبات جديدة جين إيغف-إيغد-إيغج

1. التحديد التمهيدي PCR فائق
   1. ويفضل إجراء PCR متعدد مع إيغف مجموعة فرعية محددة 5 'أجهزة الإشعال وإيغج الجينات محددة 3' الإشعال^25،26. إذا كانت نتائج دون المستوى الأمثل، إعداد منفصلة بكر يمزج باستخدام مفرد الإشعال الخاصة بالفريق الفرعي إيغف.
   2. استخدام 5 ' الإشعال أن يصلب أما زعيم المنطقة يقع المنبع مباشرة لإعادة ترتيب IG أو داخل منطقة الترميز (مثل الإطار 1، FR1) من الجينات إيغف.
      1. كبسولة تفجير زعيم الاستخدام التي تسمح للتضخيم لكل ترتيب تسلسل الجين إيغف-إيغد-إيغج، الذي بدوره سيمكن تقدير دقيق لمستويات SHM. وهكذا، ينصح إيغف زعيم كبسولة تفجير من قبل إريك في مبادئها التوجيهية المحدثة لتحليل تسلسل الجين في IG²⁷.
      2. في الحالات حيث فشل الزعيم كبسولة تفجير لتضخيم إعادة ترتيب IG كلونوتيبيك، تستخدم كبسولة تفجير FR1 إيغف. ومع ذلك، لا تضخيم كبسولة تفجير إطار ترتيب الجينات IG كلونوتيبيك كامل، مما قد يؤدي إلى تحديد غير دقيق لمستوى SHM. لهذا السيناريو، تنص بوضوح في التقرير السريرية أن استخدام كبسولة تفجير FR1 إيغف قد نبالغ في تقدير نسبة الهوية الحقيقية للجينات الخط الأقرب.
   3. 3 ' نهاية، استخدم كبسولة تفجير توافق استهداف جينات إيغج، مجموعات متعدد إيغج الخاصة بالجينات الإشعال أو كبسولة تفجير ايستب على حدة، اعتماداً على الركازة. تسلسلات التمهيدي ترد في الجدول 1، بينما يصور الشكل 1 في مختلف المواقع للصلب التمهيدي.
2. [بكر] تضخيم لترتيبات جديدة جين إيغف-إيغد-إيغج
   1. إعداد مزيج التمهيدي باستخدام كميات اكويمولار من كل primer(s) الفريق الفرعي لضمان التضخيم غير متحيزة.
      1. على سبيل المثال، عند استخدام أجهزة الإشعال الزعيم، تستخدم كبسولة تفجير مختلفة اثنين تضخيم ترتيبات جديدة تابعة للفريق الفرعي IGHV1. وبالتالي، استخدام كمية من هذه كبسولة تفجير 2 (IGHV1L و IGHV1bL) التي هي النصف بالمقارنة مع IGHV4L، وهو الدليل الوحيد لترتيبات جديدة في الفريق الفرعي IGHV4.
      2. تطبيق النهج المعاكس في حالة الإشعال IGHJ1-2، و IGHJ4 5. كما تستهدف هذه كبسولة تفجير مجموعتين فرعيتين الجينات إيغج مختلفة، ضعف الكمية مقارنة IGHJ3 و IGHJ6 كبسولة تفجير.
      3. استخدام الجدول 1 لتحديد كميات الدقيق التمهيدي عند إعداد يمزج التمهيدي ذات الصلة.
   2. مزيج PCR الكواشف كما هو موضح في الجدول 2. بعد ضم جميع الكواشف PCR في أنبوب PCR، إضافة 0.5 ميليلتر من [تق] [بولمرس] و 100 نانوغرام من جدنا أو 2 ميليلتر من كدنا (كدنا ينبغي إعداد باستخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي).
      ملاحظة: إنزيم بوليميراز مع تصحيح التجارب المطبعية النشاط ليس ضروري كما أن نسبة الخطأ التضخيم منخفض للغاية، وسوف تؤثر على مستوى SHM ولذلك لا.
   3. تشغيل البروتوكول PCR الحرارية بالتفصيل في الجدول 3.
3. تقييم كلوناليتي
   ملاحظة: خطوة التالية حاسمة ينطوي على تقييم نمط كلوناليتي المنتج PCR. عند تقييم كلوناليتي في مرضى CLL، النتيجة الأكثر شيوعاً واحدة، [مونوكلونل] ذروة/فرقة.
   1. استخدام أساليب مع حساسية عالية، مثل تحليل جزء أو هيتيرودوبليكس، لتقييم كلوناليتي^28،29.
   2. تحليل الشظايا
      1. أداء متعدد من تقارير إتمام المشروعات باستخدام 5 '-المسماة الزعيم إيغف أو FR1 الفريق الفرعي الإشعال PCR المحددة؛ هذا وسوف تسفر عن PCR المنتجات التي يمكن أن تكون مفصولة بواسطة التفريد الشعرية، مما يسمح بتقييم كلوناليتي PCR فائق المنتجات استناداً إلى تكاملها إيغف تحديد المنطقة 3 (CDR3) أطوال.
      2. استخدام أجهزة الإشعال والكاشفات وظروف حرارية مماثلة لتلك المذكورة آنفا (انظر الجداول 1-3). 5´ مخصص-المسمى كبسولة تفجير فلوريسسينتلي المسماة أوليجوس مع إمكانية اختيار الأصباغ في النهاية 5 '. وتشمل الأمثلة الأصباغ مراسل 6-الاتحاد الماليزي، الهيكس، نيد أو تيت. وهكذا، ردود فعل منفصلة 2 مطلوبة استناداً إلى استخدام صبغات مختلفة 3 كل رد فعل.
   3. تقييم حجم منتجات PCR في جل ستة (6%) polyacrylamide (نتائج هذه النسبة المئوية في القرار الأمثل)، استخدام 1 x TBE كمخزن مؤقت قيد تشغيل. تشغيل في 80 الخامس لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: من المستحسن أن منتجات PCR مسموح لها بترحيل في الجل لوقت كاف حتى أن عينات [مونوكلونل] لا يمكن فصلها عن الخلفية [بولكلونل] ويمكن فصل علامة حجم الحمض النووي على نحو كاف. يمكن أن تؤثر على عوامل مثل حجم وسمك من الجل الهجرة لا يمكن أن يضمن الإعداد مفردة (الجهد والوقت) نتيجة مثلى أن قال، وضع الجهد في 80 الخامس لمدة 45 دقيقة نقطة انطلاق جيدة كما أنه يقلل خطر العينة ترحيل جداً بسرعة و 'تشغيل' قبالة الهلام.
   4. التحقق من وجود منتجات PCR لحوالي 500 زوج قاعدي عند استخدام إيغف زعيم كبسولة تفجير و 350 قاعدة أزواج عند استخدام خلطات التمهيدي FR1 إيغف.
      ملاحظة: في بعض الحالات النادرة، CLL تم اكتشاف حالات تحمل المنتجات مزدوجة, [مونوكلونل]، وفي حالات نادرة حتى الحالات قد يحمل على نمط أوليجوكلونال. يمكن استخدام عامل إينتيركالاتينج مثل اثيديوم بروميد (أتبر) أو أقل خطرة وأكثر حساسية من البقع الحمض النووي المتاحة تجارياً للتصور من الحمض النووي في الهلام الاكريلاميد باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الإثارة أو الضوء الأزرق.
4. تنقية المنتج بكر
   ملاحظة: يتم تنقية منتجات PCR لإزالة أي خلفية [بولكلونل] التي تنشأ من خلايا ب العادية داخل عينة CLL، فضلا عن التمهيدي dimers التي قد تؤدي إلى التسلسل الأمثل. استخدام أي طريقة تزيل دنتبس غير مدمج وكبسولة تفجير لبكر تنظيف، مثل علاج الأنزيمي، مثلاً، ساب (الجمبري الفوسفاتيز القلوية)/أكسو ([ااكسونوكلس] أنا)، أو تنقية يستند إلى العمود.
   1. تحميل إجمالي حجم المنتج بكر على ذوبان منخفضة 3% [اغروس] هلام.
   2. السماح لمنتجات PCR لتشغيل على الهلام حتى أنها منفصلة من الخلفية.
   3. المكوس العصابات PCR حادة، بارزة، وتنقية والوت. إذا تم الكشف عن اثنين من ترتيبات جديدة، ينبغي أن اقتطعت كل العصابات ومتسلسلة بشكل منفصل.
   4. القيام بتنظيف ساب/أكسو، اتبع إرشادات الشركة المصنعة فيما يتعلق بوحدات التخزين المحددة الاستخدام؛ ولكن قد يحتوي على رد فعل نموذجي 1 ميليلتر Sap، 0. 5 ميليلتر أكسو وحضانة 5 x 2 ميليلتر المخزن المؤقت كل 5-10 ميليلتر [بكر] رد فعل. مزيج من فورتيكسينج بلطف كل عينة واحتضان على كتلة بكر في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إلغاء تنشيط الإنزيمات بالتدفئة إلى 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   5. تحميل كمية صغيرة من المنتجات بكر على 3% [اغروس] هلام لتقييم نقاء المنتج.

5-سانغر التسلسل

ملاحظة: تسلسل عدة استراتيجيات موجودة، ومع ذلك، بغض النظر عن النهج الدقيق، مباشرة في تسلسل كل خيوط إلزامي لضمان نتيجة موثوق بها.

1. بروتوكولات التسلسل العام
   1. إذا تم أداؤه التضخيم باستخدام كبسولة تفجير واحدة، المضي قدما في التسلسل باستخدام إيغف المناسبة-وإيغج-أو المستمرة الخاصة بكل منطقة الإشعال. يمكن اعتماد هذا النهج أيضا إذا كان متعدد فلوريسسينتلي وقد استخدمت كبسولة تفجير المسمى وتم تقييم المنتج بكر استخدام تحليل جزء (لا يجب أن يكون المسماة الإشعال التسلسل).
   2. إذا استخدمت كبسولة تفجير متعدد وتم تقييم كلوناليتي على هلام، ثم استخدم تمهيدي المصب في الخطوة الأولى من التسلسل مثلاً آراء التمهيدي إيغج مع تسلسل يجري 5 '-جتجاككاججتنككتجككككاج-3'. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الفصل تمهيدي إذا استخدمت كدنا كالركيزة. بعد ذلك، استخدم الزعيم إيغف الخاصة بالفريق الفرعي أو كبسولة تفجير FR1 للخطوة التسلسل الثاني.
2. مثال تسلسل البروتوكول
   ملاحظة: توجد العديد من البروتوكولات التسلسل وبروتوكولا مثال هو مفصل أدناه.
   1. تمييع 33 نانوغرام المنتج بكر في إجمالي حجم 11.5 ميليلتر استخدام، مثلاً، من الماء المعقم. تؤذي المنتج بكر بالتدفئة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ضع فورا على الجليد لمدة 10 دقائق لمنع تشكيل الهياكل الثانوية.
   2. إضافة 8 ميليلتر من مزيج الرئيسي لكل أنبوبة جنبا إلى جنب مع 0.5 ميليلتر (الموافق 5 pmol) من التمهيدي.
   3. كعنصر تحكم، إعداد أنبوب يحتوي على 8 ميليلتر من مزيج الرئيسي، 0.5 ميليلتر pUC18 قالب عنصر التحكم، 2 ميليلتر (-) 47 تسلسل التمهيدي و 9.5 ميليلتر الماء المعقم. ينبغي أن يكون حجم المجموع النهائي في كل أنبوبة 20 ميليلتر.
   4. استخدام شروط الدراجات الحرارية لرد فعل التسلسل كما هو مفصل في الجدول 4.
   5. إعداد "الحل وقف" بخلط 2 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 م (5.2 درجة الحموضة)، 2 ميليلتر "يدتا 100 ملم" (pH 8.0) و 1 ميليلتر من الجليكوجين (تركيز 20 ملغ/مل)، ثم قم بإضافة 5 ميليلتر لكل عينة. نقل المنتج إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
   6. إضافة 60 ميليلتر من الإيثانول 100% (-20 درجة مئوية) وتخلط برفق. الطرد المركزي 14,000 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة (4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
   7. إضافة 100 ميليلتر من الإيثانول 70% (-20 درجة مئوية) وتخلط برفق. الطرد المركزي 14,000 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقائق (4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة.
   8. جاف بيليه لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 40 ميليلتر من الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) إلى حل لكل عينة.
   9. نقل العينة إلى لوحة تسلسل وتغطية مع قطاع قبعات أو الأختام الشريط وتحميل إلى الجهاز وأداء سانغر التسلسل. لوحة التسلسل هو عادة 96-جيدا، والخامس-أسفل، تنورة الكاملة PCR اللوحة متوافقة مع جهاز التسلسل. قد تكون اللوحات المراقب استناداً إلى ما إذا أن التسلسل المراد تنفيذها داخل المنظمة، بشركة تجارية أو مركز أو منصة تسلسل أكاديمي.
3. بعد التسلسل، 'غرزة معا' 2 المتولدة من الخطوات الفردية تسلسل للنموذج كامل إيغف جينات إعادة ترتيب أي تسلسل توافق الآراء على ما يلي.

6. تحليل تسلسل

ملاحظة: التركيز المقاطع التالية في الإخراج التي تم الحصول عليها من أداة إيمجت/V-كويست³⁰ عند تحليل ترتيب تسلسل IG، وإيمجت/جونكتيوناناليسيس³¹، التي تتسم بأهمية خاصة للتقارير السريرية والبحوث الدراسات. إيمجت/V-كويست هو تقديم أداة محاذاة التي تقارن المستخدم تعيين تسلسل IG مع الدليل المرجعي إيمجت³⁰. يتضمن الإخراج الأداة عدة أقسام فيه تعريف المستخدم بعض المعلمات.

1. تحديد الأنواع، مثلاً، الإنسان العاقل (الإنسان)، ونوع مستقبلات أو المكان (مثل IGH أو إيجك أو IGL).
2. قم بلصق تسلسلات تحليلها، في شكل فاستا، بما في ذلك رؤوس، في ناحية النص (على دفعات تسلسل تصل إلى 50 في تشغيل). وبدلاً من ذلك، يتم توفيرها خياراً لإدخال المسار إلى ملف محلي يحتوي على تسلسل FASTA.
3. اختر أحد خيارات العرض 3 التالية للحصول على النتائج:
   1. عرض تفصيلي: اختر هذا الخيار من أجل الحصول على النتائج لتسلسل كل على حدة.
   2. عرض خلاصة: حدد هذا الخيار لترجمة جدول ملخص أمرت باسم الجينات واليل إيغف أو بترتيب تسلسل الإدخال. كما يوفر هذا الخيار محاذاة تسلسلات التي تم تعيينها إلى نفس إيغف الجينات واليل، في أي دفعة مقدمة،.
   3. ملف Excel: اختر هذا الخيار لتوفير كافة ملفات الإخراج كجداول البيانات التي تدرج في ملف واحد. كافة خيارات العرض لديها مجموعة كبيرة من المعلمات الأساسية والمتقدمة الاختيار من بينها، ومع ذلك إلا أن العوامل الأكثر صلة بتحليل تسلسل CLL IG تناقش أدناه في المقطع 'الممثل النتائج'.

7-اعتقال/أسيجنسوبسيتس أداة

1. للتحقيق في ستيريوتيبي IG المركز داخل CLL (التفاصيل الإضافية المقدمة أدناه في المقطع 'الممثل النتائج')، يقدم تسلسل "فاستا" إيغف-إيغد-إيغج إلى أداة القبض/أسيجنسوبسيتس³². الأداة التقارير النمطية بالإحالة إلى CLL كبرى مجموعات فرعية. تتوفر أداة مهمة فرعية جنبا إلى جنب مع تعليمات مفصلة على موقع الاعتقال/أسيجنسوبسيت³² وأيضا على موقع إريك ضمن علامة التبويب خدمات.

النتائج

وتبين الأمثلة الواردة أدناه النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل تسلسل الجينات IG الإجراءات التالية الخطوات المفصلة أعلاه. على الرغم من أن استخراج الحمض النووي و/أو الحمض النووي الريبي إجراءات روتينية لمعظم المختبرات السريرية/البحوث، تنطوي خطوة حاسمة أولى التحقق من النوعية/كمية جدنا و/أو الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي أو غيرها من التكنولوجيا المناسبة مع حساسية عالية. الخطوة الحاسمة التالية ينطوي على تضخيم بكر كلونوتيبيك إعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج. وكما ذكر أعلاه، فقط استخدام كبسولة تفجير الزعيم إيغف تمكن التضخيم من كامل طول التسلسل الجيني إيغف آخر أعيد ترتيبه، مما يسمح بتحميل SHM الحقيقية التي سيتم تحديدها؛ ولذلك، يتم الإشعال الزعيم إيغف الاختيار التمهيدي الموصى بها (الشكل 2). في حالات نادرة حيث لا يمكن تضخيم الإشعال الزعيم إيغف إعادة ترتيب IG كلونوتيبيك، ويمكن استخدام كبسولة تفجير FR1 إيغف. كما يتضح في الشكل 3، بكر عدة منتجات/العصابات يمكن ملاحظة، لا سيما عند جدنا هو انطلاق المواد؛ وينبغي أن تكون اقتطعت هذه العصابات ومتسلسلة بشكل منفصل. إذا فشل الزعيم إيغف وكبسولة تفجير FR1 إيغف تؤتي ثمارها، ينبغي تكرار التحليل باستخدام عينة مريض جديد (عند الإمكان). يتم تحديد آخر نقطة تفتيش قبل التسلسل كلوناليتي العينة باستخدام التحليل بلغة (الشكل 4).

يجب أن يتم تحليل تسلسل الحصول عليها باستخدام أداة إيمجت/V-كويست³⁰. ترد جنبا إلى جنب مع عدد تسلسل تحليل معلمات المستخدم المحدد وتشمل الأنواع أو نوع مستقبلات أو المكان، بحثاً عن الإدراج، وخيار الحذف و ما إلى ذلك . يتم عرض كل تسلسل فاستا وهو أبرز الخامس-المجال تحليلها بواسطة إيمجت/V-السعي باللون الأخضر. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان تسلسل الإدخال في الاتجاه المعاكس (antisense)، البرنامج تلقائياً يوفر التسلسل العكسي مكملة وهذه الدول أعلاه تسلسل FASTA.

نتيجة الجدول الموجز يتم توفيرها مباشرة أسفل التسلسل فاستا، في الجزء العلوي من '"عرض مفصل"' صفحة النتائج، ويحتوي على معلومات هامة للإبلاغ عن تحليل التسلسل الجيني IG في CLL السريرية. كل صف من الجدول هذا مفسرة أدناه.

ملخص النتيجة. دول الصف الأول في الجدول نتائج الأداء الوظيفي لتسلسل الإدخال: تسلسل IG ترتيبها يمكن أن تكون منتجة أو غير منتجة (الشكل 5A و 5B). إعادة ترتيب جينات IG هو غير منتجة إذا وقف codons موجودة داخل الخامس-د-ي-المنطقة (VH) أو في الخامس-ي-المنطقة (لداء الليشمانيات الحشوي) و/أو إذا كان يتم إعادة ترتيب خارج-من-الإطار بسبب عمليات الإدراج/الحذف. إخراج ثالث يتم توفيرها عندما يتعذر تحديد الوظيفة، أي، إذا تعذر التعرف مفرق إيغف-إيغد-إيغج؛ وفي هذه الحالة، سوف قراءة موجز نتيجة 'إعادة ترتيب لم يتم العثور على' أو 'لا تقاطع العثور على'. من المهم ملاحظة أن فقط منتجة، وهكذا، يجب أن يتم تحليل ترتيبات وظيفية جديدة أخرى. إذا كان الوحيد تضخيم IG إعادة ترتيب غير وظيفية (غير منتجة أو 'إعادة ترتيب لم يتم العثور على')، يجب تكرار عملية التضخيم PCR. إذا بقيت النتيجة سلبية ينبغي الحصول على عينة مريض جديد.

الجين الخامس واليل. الصف 'الجين الخامس واليل' يشير إلى الخط الأقرب إيغف الجينات واليل مع نقاط المحاذاة الخاصة بها، وهوية النسبة المئوية. إذا كان العديد من gene(s) والاليلات تعطي نفس درجة عالية، يتم سرد كافة. هوية النسبة المئوية بين التسلسل المقدم والأقرب إيغف الجينات اليل بأهمية خاصة نظراً لأنها تحدد حالة SHM. يتم حساب هذه القيمة من النوكليوتيدات أول الخامس-المنطقة إلى النهاية 3 ' الخامس-المنطقة باستثناء CDR3. إذا استخدمت كبسولة تفجير FR1 إيغف، ينبغي دائماً إزالة تسلسل المقابلة لأن الدليل التمهيدي لضمان دقة نتيجة ممكنة. تجدر أن نسبة مئوية منخفضة هوية (< 85 في المائة) قد ينتج من الإدراج أو الحذف (يناقش المزيد أدناه)، وينبغي أن يكون هذا هو الحال سوف تظهر ملاحظة 'تحذير' في الصف 'ملخص نتيجة' لتنبيه المستخدم.

ي-جين واليل. كما هو موضح للجين الخامس واليل أعلاه، يشير إلى الصف 'ي-الجينات واليل' الخط الأقرب إيغج الجينات واليل مع نقاط المحاذاة الخاصة بها، وهوية النسبة المئوية. ومع ذلك، الجين إيغج قصيرة نوعا، وقد يكون تم اقتطاعها نهايته 5 ' سبب [ااكسونوكلس] نشاط، يتم البحث الخيارات البديلة أيضا بواسطة الأداة، استناداً إلى أعلى عدد من النيوكليوتيدات متطابقة على التوالي.

د-الجينات واليل من إيمجت/جونكتيوناناليسيس- كان الجين واليل من إيمجت/جونكتيوناناليسيس يشير إلى أقرب germline إيغد الجينات واليل مع الإطار القراءة د-المنطقة المحددة بواسطة الأداة في تسلسل المستخدم. إيمجت/جونكتيوناناليسيس³¹ يوفر تحليل مفصل ودقيق من مفترق الطرق، وأدمج في واجهة أداة إيمجت/V-السعي. هذه الأداة بإدارة جميع جوانب الصعوبة ترتبط إيغد الجينات واليل تحديد أي (ط) مدة قصيرة د-المنطقة؛ (ثانيا) استخدام 3 2 أو حتى قراءة الإطارات؛ (ثالثا) [ااكسونوكلس] التشذيب في كلا طرفي الجينات؛ و (رابعا) وجود الطفرات.

أطوال FR-إيمجت ومجلس الإنماء والإعمار-إيمجت أطوال ومفرق AA. ويوفر هذا الصف طول FRs إيغف وتقارير الإنجاز الموحدة تظهر داخل أقواس ومفصولة بالنقاط وتقاطع الأحماض الأمينية (أإ). يوضح تسلسل AA من مفترق الطرق (ط) إعادة ترتيب في أو خارج-من-إطار (يتم الإشارة إلى مواقف الخروج من الإطار بعلامة '#')، (الثاني) وجود أو عدم وجود stop codons (يرد كودون توقف قبل العلامة نجمية' * ')، و (الثالث) وجود أو عدم وجود المراسي من VH CDR3-إيمجت: ج (2-CYS 104) و W (الحزب ي 118).

هايبرموتيشنز جسدية غالباً تتكون من التغييرات النوكليوتيدات واحدة، بيد الصغيرة عمليات الإدراج والحذف داخل منطقة الخامس يمكن أن يلاحظ، لو في كثير أقل تردد³³. عند استخدام المعلمات الافتراضية إيمجت/V-كويست، وعمليات الإدراج والحذف لا يتم تلقائياً الكشف عن؛ ومع ذلك، يتم الكشف عن دلائل قوية على أن تسلسل قد تحمل مثل هذه التعديلات، أي هوية نسبة منخفضة و/أو أطوال مختلفة إيغف CDR1-إيمجت و CDR2-إيمجت بين تسلسل المستخدم المقدمة والجينات germline الأقرب واليل، قبل أداة وإنذار يظهر أسفل الجدول الموجز النتائج (الشكل 5).

إيمجت يوفر خيار يسمى 'البحث عن عمليات الإدراج والحذف' المقطع 'معلمات متقدمة' الموجود أسفل المقطع 'عرض النتائج'. في الحالات التي تظهر فيها تحذيرات ذات الصلة، من المستحسن استخدام هذه الوظيفة. عندما يتم الكشف عن عمليات الإدراج وعمليات الحذف، تفاصيل شاملة بالنتيجة ترد في القسم 'النتيجة الموجزة' بما في ذلك (ط) حيث الإدراج أو الحذف يقع أي الأب VH-إيمجت أو مجلس الإنماء والإعمار-إيمجت؛ (ثانيا) عدد النيوكليوتيدات إدراجها أو حذفها؛ (ثالثا) التسلسل (فقط من أجل عمليات الإدراج)؛ (رابعا) ما إذا كان قد حدث فراميشيفت؛ (v كودون الخامس-المنطقة) الذي يبدأ بالإدراج أو الحذف؛ والتسلسل (سادسا) موقف النوكليوتيدات المتأثرة في المقدمة (الشكل 5). للملاحق، الأداة يزيل insertion(s) من تسلسل المستخدم المقدمة وثم إعادة تحليل تسلسل استخدام معلمات إيمجت/V-كويست القياسية. إذا تم الكشف عن عمليات الحذف، يضيف الأداة الثغرات، ممثلة بالنقاط، ليحل محل النيوكليوتيدات محذوف قبل تكرار التحليل.

أما بالنسبة لكل اختبار التشخيص أو تشخيصية تجري في المختبرات السريرية، المعايير الصارمة ودرجة عالية من إمكانية تكرار نتائج ذات أهمية قصوى. إخراج إيمجت/V-كويست يوفر الكثير من المعلومات اللازمة للإبلاغ عن نتائج تحليل التسلسل الجيني IG في CLL، أي، (ط) إيغف، والجينات إيغد وإيغج والاليلات المستخدمة؛ (ثانيا) وظيفة كلونوتيبيك إيغف-إيغد-إيغج الجينات إعادة ترتيب أي، ما إذا كان يتم إعادة ترتيب المنتجة أو غير المنتجة؛ وجين إيغف (iii) هوية نسبة آخر أعيد ترتيبه واليل بالمقارنة مع ما germline إيغف الجينات واليل الأقرب. للحصول على تفاصيل شاملة فيما يتعلق بالإبلاغ عن السريرية للجينات IG في CLL، تفسير إشكالية أو تحديا من الناحية التقنية قضايا وتوصيات لتحديد حالة SHM الجين إيغف في CLL دقيقة وقوية، يوجه القارئ في الآونة الأخيرة تحديث إريك المبادئ التوجيهية والتقارير^27،34.

وأخيراً، تتصل إضافي الموصى بها للإبلاغ عن IG الجينات ترتيبات جديدة في CLL السريرية نظراً لمعرفتنا المتزايدة بشأن stereotypy IG المركز في CLL، إحالة الحالات إلى مجموعات فرعية رئيسية النمطية. من المستحسن الآن للدولة في تقرير السريرية عما إذا كانت إعادة ترتيب الجينات إيغف تحليل الإنتاجية يمكن أن تسند إلى واحدة من المجموعات النمطية الرئيسية، إلا وهي مجموعات فرعية #1، #2، #4 أو #8^12،27. ينبغي أن تجري الإحالة إلى مجموعات فرعية CLL النمطية الرئيسية باستخدام أداة (الشكل 6) اعتقال/أسيجنسوبسيتس³².

5 ' كبسولة تفجير FR1 إيغف	تسلسل التمهيدي		كمية 60 ميكروليتر من التمهيدي مزيج
IGHV1	كاجتجكاجكتجتجكاجتكتج		10
IGHV2	كاجتكاكتاججاجتكتج		10
IGHV3	جاجتجكاجكتجتجاجتكتج		10
IGHV4	كاجتجكاجكتجكاجاجتكجج		10
IGHV5	جاجتجكاجكتجتجكاجتكتجك		10
IGHV6	كاجتاكاجكتجكاجكاجتكاج		10
5 ' إيغف زعيم الإشعال
IGHV1L	آآتكجاتاككاككاتجاكتجاككتجاج		5
IGHV1bL	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A)		5
IGHV2aL	ميلان آآتكجاتاككاككاتجاكاكاكتتجكت (التكييف)		5
IGHV2bL	آآتكجاتاككاككاتجاكاتاكتتجتككاك		5
IGHV3aL	آآتكجاتاككاككاككاتجاجتتججكتجاجك		5
IGHV3bL	AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC		5
IGHV4L	آآتكجاتاككاككاتجااكاككتجتجتكت		10
IGHV5L	آآتكجاتاككاككاتجججتكاككجككاتك		10
IGHV6L	آآتكجاتاككاككاتجتكتجتكتككتككتك		10
إيغج الإشعال 3 '
IGHJ1-2	تجاجاجاكجتجاككاججتجكك		20
IGHJ3	تجاجاجاكجتجاككاتجتككك		10
IGHJ4-5	تجاجاجاكجتجاككاججتكك		20
IGHJ6	تجاجاجاكجتجاككجتجتككك		10

الجدول 1. تسلسلات التمهيدي والكميات للتضخيم بكر من كلونوتيبيك إعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج.

كاشف	وحدة التخزين (ميكروليتر)
م ع س العازلة 10	5
مجكل2 (50 مم)	3
دنتبس (10 mΜ)	2
التمهيدي إيغف زعيم/FR1 ميكس (10 ميكرومترات)	3
مزيج إيغج التمهيدي (10 ميكرومترات)	3
ح2س	31.5
الحجم الإجمالي	47.5

الجدول 2. الكواشف للتضخيم بكر من كلونوتيبيك إعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج.

درجة الحرارة	المدة	رقم الدورة	الوصف
94 درجة مئوية	بعد 5 دقائق	1	تنشيط بوليميراز
94 درجة مئوية	1 دقيقة	39	تمسخ
59 درجة مئوية	1 دقيقة		الصلب
72 درجة مئوية	1.5 دقيقة		ملحق
72 درجة مئوية	10 دقائق	1	التمديد النهائي
18 درجة مئوية	∞	1	الحفاظ على

الجدول 3. شروط الدراجات الحرارية للتضخيم بكر من كلونوتيبيك إعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج.

درجة الحرارة	المدة	رقم الدورة	الوصف
94 درجة مئوية	بعد 5 دقائق	1	تنشيط بوليميراز
96 درجة مئوية	20 ثانية	30	تمسخ
50 درجة مئوية	20 ثانية		الصلب
60 درجة مئوية	4 دقائق		ملحق
4 درجة مئوية	∞	1	الحفاظ على

الجدول 4. شروط الدراجات الحرارية لرد فعل التسلسل الجيني المفتش العام.

رقم 1. التمثيل التخطيطي من إعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج مع مختلف التمهيدي الصلب المواقع أشارت إلى. إيغف الإشعال 5 ' يصلب للتسلسل الزعيم الذي يقع المنبع للتسلسل الترميز إيغف. 5 'إيغف إطار (FR) الإشعال يصلب إلى بداية منطقة FR1، الذي يقع داخل الجين إيغف آخر أعيد ترتيبه، حين يصلب كبسولة تفجير إيغج 3' إلى نهاية الجين إيغج آخر أعيد ترتيبه. UTR: المنطقة غير مترجمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2. [بكر] تضخيم لإعادة ترتيب الجينات في عينات المرضى 7 5 ' إيغف زعيم كبسولة تفجير باستخدام إيغف-إيغد-إيغج- لين الثامن يمثل عنصر تحكم إيجابية بينما تم تحميل عنصر التحكم السلبي لبكر في حارة التاسعة. المنتج بكر المتوقع حوالي 500 زوج قاعدي في الحجم عند استخدام إيغف زعيم الإشعال. تشير العلامة النجمية في العمود الأخير من الجل إلى سلم الحمض النووي bp 100. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. [بكر] تضخيم لإعادة ترتيب الجينات في عينات المرضى 13 استخدام كبسولة تفجير FR1 إيغف إيغف-إيغد-إيغج- لين الرابع عشر يحتوي على عنصر تحكم إيجابية بينما تم تحميل عنصر التحكم السلبي في حارة الخامسة عشرة. كما تدل على ذلك لين 2، الذي كان الحمض النووي بانطلاق المواد، عدة عصابات PCR لوحظت، التي ينبغي أن تكون اقتطعت ومتسلسلة بشكل منفصل. عينات في حارات 5 و 7 و 13 نتائج [بولكلونل] (يتضح من التشويه في الهلام)، وهكذا، يجب تكرار الخطوة PCR. إذا فشل بكر ثاني تضخيم المفتش العام آخر أعيد ترتيبه gene(s) التحليل الذي ينبغي أن يقوم على عينة جديدة (إذا أمكن) أو تمهيدي مختلفة باستخدام مجموعة. المنتج بكر المتوقع حوالي 350 قاعدة أزواج في الحجم عند استخدام خلطات التمهيدي FR1 إيغف. تشير العلامة النجمية في العمود الأخير من الجل إلى سلم الحمض النووي bp 100. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4. تقييم استخدام تحليل جينيسكان كلوناليتي- في تحليل جينيسكان، تثير [مونوكلونل] [بكر] منتوجات إلى ذروة مهيمنة لمنتجات الفلورسنت من حجم متطابقة (اللوحة العلوية)، بينما تؤدي [بولكلونل] [بكر] منتوجات في توزيع الطبيعي أكثر من أحجام المنتج (أسفل اللوحة). آثار الحمراء هي قمم من سلم الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي الذي تم تحميله في نفس الحقن الشعرية كنموذج يجري تحليلها. شظايا الحجم القياسي يتعرضون لنفس القوة الغرواني الكهربي كالعينة ويتعرض لذلك بنفس الشروط التي حقن. ويؤكد التباعد موحدة من الشظايا الحجم القياسي الدعوة الحجم الدقيق. تمثل آثار زرقاء [مونوكلونل] (اللوحة العلوية) أو [بولكلونل] طبيعة العينات (أسفل اللوحة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5. أمثلة لنتائج الجداول الموجزة المقدمة من إيمجت/V-السعي- (أ) نتيجة الجدول الموجز لإنتاجية إيغف-إيغد-إيغج جينات إعادة ترتيب (لا codon(s) التوقف وتقاطع تسلسل في الإطار). الخامس-الجينات واليل والجين ي واليل حددها إيمجت/V-السعي في تسلسل المستخدم في هذه الحالة هي IGHV4-34 * 01 و IGHJ6 * 02 (على أساس تقييم نقاط المحاذاة أعلى). هو هوية نسبة 99.65% بسبب طفرة جسدية واحدة. د-الجينات واليل حددها إيمجت/جونكتيوناناليسيس هو IGHD3-3 * 01 في قراءة الإطار 1. الأطوال من مناطق الإطار 4 (FRs)، فضلا عن مناطق تحديد التكامل 3 (تقارير الإنجاز الموحدة) بين قوسين. وتقدم أيضا تسلسل الأحماض الأمينية (أإ) من تقاطع إيغف-د-ي. في هذا المثال مفرق تضم 22 العاص. (ب) النتيجة جدول موجز لتسلسل إعادة ترتيب جينات إيغف-إيغد-إيغج التي غير المنتجة بسبب مفترق طرق الخروج من الإطار. X على طول CDR3-إيمجت يشير إلى أن الطول لا يمكن تحديده لهذا التسلسل. تشير علامات ' #' لوحظ في تسلسل مفرق AA فراميشيفت. (ج) نتيجة الجدول الموجز تحذير انخفاض الخامس-المنطقة الهوية (60.94 ٪) والتي تشير إلى أنه يجب استخدام الخيار 'عمليات الإدراج وعمليات الحذف' في قسم 'متقدمة للمعلمات'. (د) نتيجة جدول ملخص للحالة مع هوية نسبة منخفضة germline يتضح في (ج) وبعد تكرار تسلسل التحليل باستخدام الخيار 'البحث عن عمليات الإدراج والحذف'. النسبة المئوية للهوية الصحيحة يتم عرض أقواس ويحسب النظر في الإدراج كحدث حيث واحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 6. مجموعة فرعية إحالة تقرير الجدول التي تم إنشاؤها بواسطة أداة القبض/أسيجنسوبسيتس- تسلسلات FASTA IG من 10 CLL المرضى (A1-A10) قدمت إلى أداة القبض/أسيجنسوبسيتس. A4 القضية أحيلت إلى CLL نمطية فرعية 2 # (المرضى داخل هذه المجموعة معروفة ليكون من سوء تشخيص بغض النظر عن الحمولة SHM) بثقة عالية. سبع الحالات أخرى/تسلسل لا تم تعيينها إلى مجموعة فرعية نمطية رئيسية ومن ثم تصنف غير المعينة. اثنين من تسلسل المقدمة (A7 و A8) لا يمكن استخدامها لتخصيص مجموعة فرعية وتم بدلاً من ذلك تصنف في تخطي/غير صحية بسبب قضايا بالتسلسل، أي سبب مفترق طرق الخروج من الإطار أو وجود stop codons. شرح شامل لعناوين الجدول والأداة متاحة في موقع الاعتقال/أسيجنسوبسيتس³². الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المناقشة

دراسة الجينات IG في CLL كان حيويا ليس فقط لتوفير فهم أفضل في المرض بل ولكن أيضا لتحسين التكوين الطبقي خطر المريض. ولذلك فإن من بالغ الأهمية أن يتم تنفيذ الإجراء خطوة متعددة لتحليل التسلسل الجيني IG والتفسير اللاحق لتسلسل البيانات بطريقة موحدة. توافر مواد المريض مناسبة وكافية وتوقيت أخذ العينات ينبغي إلا تؤثر على القدرة على أداء IG الجينات حيث التحليل حيث يمكن إجراء الاختبار في الجريدة الرسمية وعلى أي عينة مع عدد خلايا ورم CLL عالية. فصل خلايا الدم وحيدات النوى باستخدام أساليب الفصل التدرج تتم بشكل روتيني في مختبرات التشخيص، وكما هو الحال دائماً، ينبغي توخي الحذر عند إضافة حل الدم/ربمي للأنبوب الذي يحتوي على التدرج؛ وينبغي أن يكون القيام بهذه المهمة بطريقة بطيئة، ولطيف لتجنب الإخلال بالتدرج والحيلولة دون فقدان الخلايا.

وبعد فصل الخلية، يتم استخراج الأحماض النووية. كلا جدنا وكدنا مناسبة لتحليل SHM لإعادة ترتيب فائق كلونوتيبيك، ومع ذلك، هناك مزايا وعيوب لاستخدام أما المواد. سير عمل المختبرات عائدات أسرع عند استخدام جدنا منذ النسخ العكسي لا يكون أداؤها قبل التضخيم PCR. أن قال، استخدام جدنا الركيزة لبكر قد تؤدي التضخيم من ترتيبات جديدة على حد سواء المنتجة وغير المنتجة التي، بدورها، يمكن أن يؤدي إلى عمل المختبر العملي الإضافية، أي تنقية أو الختان جل من منتجات PCR متعددة وتسلسل الفردية لجميع ترتيبات جديدة. عند مقارنة النهج جدنا وكدنا، لهذا الأخير خطوة نسخ عكسي يجب أن يتم قبل الشروع في [بكر] تضخيم. بيد في هذا المقام، لمعظم الحالات، ترتيبات جديدة IG الإنتاجية فقط سوف يكون تضخيم والتسلسل في وقت لاحق. وهكذا، سيتم تنقية فقط منتج PCR واحد ومتتابعة، بينما يتم تفسير نتائج أكثر وضوحاً.

كفاءة التضخيم يعتمد إلى حد كبير على نوعية جدنا/كدنا، التي ينبغي تقييمها باستخدام أسلوب التقدير الكمي حساسة، والإشعال المستخدمة. الإشعال المستخدمة ذات الأهمية الحاسمة للإجراءات التحليلية بأكملها لأن يتحقق إلا تحديد دقيق لمستوى SHM بتضخيم تسلسل بأكمله من الجينات إيغف آخر أعيد ترتيبه. ويمكن تقييم إعادة ترتيب كامل طول فقط إذا استخدمت 5 ' إيغف زعيم الإشعال، مما يبرر التوصيات الأخيرة التي إريك للاستخدام لزعيم كبسولة تفجير²⁷. استخدام الإشعال بديلة، مما يؤدي إلى التضخيم لترتيبات جديدة جين إيغف-إيغد-إيغج غير مكتملة، ليست مناسبة لتحليل حيث الجينات إيغف، ومن ثم نصح بقوة ضد. والاستثناء الوحيد يتعلق بالحالات التي تنتج نتائج سلبية مرارا وتكرارا عندما تستخدم كبسولة تفجير الزعيم إيغف وتحليل المواد المريض الجديد هو غير ممكن أو كما يفعل لم تسفر عن نتائج. في حالة استخدام عينة مريض مختلفة و/أو المواد (جدنا/كدنا) والإشعال مختلف مجموعات لا تزال تفشل لإنتاج منتج PCR، الأسباب المحتملة يمكن أن عبء خلية ورم منخفض جداً، أو أن يلاحظ ليس بسبب استنساخ CLL (في هذه الحالة إيمونوفينوتيبي ينبغي أن يكون إعادة تقييم). ينبغي أن يكون ذكر الإشعال المستخدمة في التحليل دائماً في التقرير السريرية.

كما CLL ينتج عن تراكم الخلايا ب [مونوكلونل] مع إعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج نفسه، سيكشف التقييم للغالبية العظمى من الحالات كلوناليتي ذروة [مونوكلونل] فريدة من نوعها، أي استنساخ واحدة. وفي مناسبات نادرة، ضعف ترتيبات جديدة أو حتى oligoclonal أنماط يمكن ملاحظة³⁵. في مثل هذه الحالات، التفريد جل ليست الأسلوب المفضل لتقييم كلوناليتي وينبغي أن تطبق أساليب أكثر حساسية مثل تحليل الشظايا. متى تأكدت كلوناليتي، الخطوة النهائية قبل تسلسل يتعلق بتنقية المنتج PCR لضمان الحصول على تتابعات عالية الجودة. وأخيراً، الأداة إيمجت/V-السعي هو المورد أوصت بتحليل تسلسل IG إريك. قواعد البيانات إيمجت التي يتم تحديثها باستمرار وتقرير النتائج بطريقة مشروحة جيدا ومتسقة، هذه الأداة يضمن تحليل موحد ويسهل تحليل مقارن بين مختلف المرافق السريرية أو الأكاديمي.

تحليل إيمونوجينيتيك في CLL التنبؤات، وعلى وجه الخصوص، النمطية التنبؤية الآثار، تحليل قوية لإعادة ترتيب الجينات إيغف-إيغد-إيغج بما في ذلك الإحالة إلى CLL الرئيسية لمجموعات فرعية، لم يعد فقط مرغوب فيه ولكن ذات أهمية رئيسية. وهذا واضح بصورة خاصة في هذه الحقبة من رواية المداواة والإمكانات التي قد IG التحليل الجيني لتوجيه العلاج المقررات^5،21،،من^{2223،36،37 ،38}، رسميا كما يتبين من التحديث الأخير للمبادئ التوجيهية التي ترعاها لجنة التحقيق الوطنية من "حلقة العمل الدولية" شأن CLL²⁴. أن هناك ما يبرر معايير صارمة، وقال، لا سيما وأن تحديد المركز SHM كلونوتيبيك ترتيب الجينات إيغف في CLL المرضى ليس مسألة تافهة، وينطوي على عملية متعددة الخطوات. الأهم من ذلك، بعض الخطوات التجريبية، أبرزها اختيار الإشعال، تسفر عن نتائج متفوقة عند خيارات محددة و/أو النهج هي ملتزمة، جوانب فنية أخرى قابلة لدرجة ما من المرونة، مثل اختيار المواد أو أسلوب لتقييم كلوناليتي، يرجع ذلك إلى حقيقة أن تؤدي إلى الفروق الدقيقة، أن وجدت، فيما يتعلق بالنتائج النهائية.

على مدى العقد الماضي، سعت إريك للترويج لتوحيد وتنسيق مختلف أساليب ذات الصلة لتشخيص CLL ومنذرة. ويتجلى في نشر توصيات ومبادئ توجيهية لتحليل إيمونوجينيتيك^27،34، نظمت العديد من حلقات العمل التعليمية والأحداث، وإنشاء شبكة للمفتش العام، فضلا عن منتدى على إنترنت لخبراء إلى مناقشة وتقديم التوجيه بشأن تفسير التسلسل الجيني IG في CLL. والهدف العام لاريك من خلال هذه الإجراءات تعزيز الإدارة السريرية المثلى والعناية بالمرضى. وعلى الرغم من الجهود المكثفة، هذه المهمة بعيدة عن الاكتمال، وأصبحت في الواقع أكثر تعقيداً نظراً لوضع التسلسل الفائق رواية تهدف إلى التنميط المناعي. ومع ذلك، على الرغم من أن التحديات ما زالت قائمة، جهودا مكثفة لتوحيد قوي لتحليل الجينات IG في CLL مواصلة وحاليا تركز الأنشطة الجارية داخل إريك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنابيب جمع الدم البلاستيكية BD Vacutainer مع K2EDTA: سدادة الأنبوب	ThermoFisher العلمية	02-689-4	تخزين المواد
BD Vacutainer CPT أنبوب تحضير الخلايا أحادية النواة - هيبارين الصوديوم	Becton Dickinson		362753 تخزين المواد
BD Vacutainer أنابيب جمع الدم الهيبارين الأسئلة الشائعة	Daigger Scientific	366480	تخزين المواد
UltraPure 0.5 M EDTA درجة الحموضة 8.0	Invitrogen	15575038	معالجة
الخلايا أنابيب الطرد المركزي 15 مل CS500	Corning		352096 معالجة
الخلايا أنابيب الطرد المركزي PP 50 مل CS500	Corning	352070	معالجة الخلايا
RPMI متوسط 1640 (1X) سائل	Invitrogen	21875-091	معالجة الخلايا
Ficoll-Paque PLUS ، 6 × 100 مل	تقنيات	STEMCELL17-1440-02	معالجة الخلايا
الماصات المصلية 5 مل	Sarstedt	861,253,001	معالجة الخلايا
الماصات المصلية 10 مل	Sarstedt	861,254,001	معالجة الخلايا
الماصات المصلية 25 مل	Sarstedt	861,685,001	معالجة الخلايا
Dulbecco's محلول ملحي مخزن بالفوسفات (D-PBS) (1X)	Invitrogen	14190250	معالجة الخلايا
لوحة Neubauer	Marienfeld-Superior	640010	معالجة الخلايا
حل Tuerk	Sigma-Aldrich	93770	معالجة الخلايا
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K1820-01	استخراج الحمض النووي
الريبي QIAamp RNA Blood Mini	Qiagen	52304	استخراج الحمض النووي الريبي
AllPrep DNA / RNA Mini Kit	Qiagen	80204	استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي
5X أول حبلا عازلة	Invitrogen	P / N Y02321	توليف الحمض النووي (كدنا
بادئات عشوائية ، 20 وميكرو ؛ ز	Promega	C1181	(كدنا) تخليق
RNaseOUT & تجر; مؤتلف ريبونوكلياز مثبط	Invitrogen	10777019	تخليق (كدنا
DTT	Invitrogen	P / N Y00147	توليف (كدنا
SuperScript II النسخ العكسي	Invitrogen	18064-014	تخليق الحمض النووي (كدنا
10 ملي مولار dNTP مزيج	Invitrogen	18427013	(كدنا) ، PCR
Buffer	Invitrogen	O00065	PCR
MgCl2 (كلوريد المغنيسيوم) (25 ملم)	ThermoFisher العلمي	AB0359	PCR
Taq DNA Polymerase ، المؤتلف	Invitrogen	10342-020	PCR
Applied Biosystems 5 & prime ؛ الاشعال المسماة	ThermoFisher التقييم العلمي	PCR	/ Clonality
مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية	Agilent Technologies	5067-4626	قياس كمية منتج PCR
UltraPure TBE Buffer ، 10X	ThermoFisher الرحلان	الكهربائي الهلام	العلمي 15581044
UltraPure Ethidium Bromide ، 10 مجم / مل	15585011	العلمي ThermoFisher	الرحلان الكهربائي
SYBR آمن الحمض النووي جل وصمة عار	ThermoFisher العلمية	S33102	هلام الرحلان الكهربائي
10X BlueJuice هلام تحميل العازلة	Invitrogen	16500100	هلام الرحلان الكهربائي
سلم الحمض النووي سلم 1000 نقطة أساس / 1 كيلو بايت سلم أزرق جاهز للاستخدام	Geneon	305-105	هلام الرحلان الكهربائي
هلام UltraPure Agarose	ThermoFisher جل 16500500 العلمي		الرحلان الكهربائي
Agarose درجة حرارة التبلور المنخفضة	Sigma-Aldrich	A9414-250G	الرحلان الكهربائي
Novex TBE Gels ، 10٪ 10٪ 10 جيدا	الرحلان الكهربائي للهلام EC6275BOX العلمي
ThermoFisher ExoSAP-IT PCR كاشف تنظيف المنتج	ThermoFisher Scientific	78201.1.mL	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	تنظيف منتج PCR
GenomeLab DTCS Quick Start	Kit Beckman Coulter	608120	تسلسل Sanger
محلول أسيتات الصوديوم (3 م) ، درجة الحموضة 5.2	ThermoFisher العلمي	R1181	تسلسل سانجر
الجليكوجين ، درجة البيولوجيا الجزيئية	ThermoFisher العلمية	R0561	تسلسل سانجر
الإيثانول المطلق	EMD	Millipore 1024282500	تسلسل سانجر
أنبوب SafeSeal 1.5 مل	Sarstedt	72،706	الاستخدام العام
كوب Multiply-Pro 0.2 مل ، PP	Sarstedt	72،737،002	الاستخدام العام
معدات			المركزي
معدات آلة PCR
معدات المحلل الحيوي	Agilent Technologies