يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل كارديوميوسيتيس خوارج من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على

10.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57953

⸱

يوليو 26, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine and Cardiology, Charité University Medicine, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

في هذه المقالة

ملخص

وهنا يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل cardiomyocytes أذينية خلية واحدة من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على. دليل تنظيم الضغط إينترالومينال تجاويف القلب ينفذ تؤتي myocytes وظيفيا سليمة مناسبة للدراسات الإثارة-الانكماش-اقتران.

الملخص

في هذه المقالة، يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل خلية واحدة أذينية cardiomyocytes (تابع) من نموذج الفئران من المتلازمة الأيضية (ميتس)-المتعلقة بفشل القلب مع كسر قذفي الحفاظ عليها (هفبيف). يتزايد انتشار ميتس المتصلة هفبيف، والقلب الرجفان المرتبطة بإعادة عرض الرجفان والرجفان الاذيني ذات الصلة سريرياً عاليا كما يعيد البناء الرجفان توقع مستقلة من الوفيات. كثيرا ما تستخدم الدراسات مع عزل الخلايا المفردة كارديوميوسيتيس التثبت وتكمل في فيفو النتائج التي توصل إليها. راريفيكيشن سفينة الدورة الدموية والتليف الخلالي الأنسجة تشكل عاملاً يحد يحتمل أن عزل الخلايا المفردة الناجحة تابع من نماذج حيوانية لهذا المرض.

ونحن قد تناول هذه المسألة باستخدام جهاز قادرة على تنظيم ضغط إينترالومينال تجاويف القلب يدوياً أثناء إجراء العزل، زيادة عائد تابع سليمة شكلياً ووظيفيا. يمكن استخدام خلايا المكتسبة في مجموعة متنوعة من تجارب مختلفة، مثل زراعة الخلايا وتصوير الكالسيوم وظيفية (أي، الإثارة-الانكماش-اقتران).

نحن تزويد الباحث ببروتوكول خطوة بخطوة، قائمة بالحلول الأمثل، وتعليمات شاملة لإعداد المعدات اللازمة، ودليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها شامل. حين التنفيذ الأولى للإجراء الذي قد يكون من الصعب بدلاً من ذلك، تسمح تكيف ناجح القارئ لأداء الدولة للفنون ACM العزلة في نموذج الفئران من هفبيف المتصلة ميتس لمجموعة واسعة من التجارب.

المقدمة

ميتس يصف مجموعة من عوامل خطر الإصابة بأمراض القلب والشرايين والسكري نوع-2 ويشمل ارتفاع ضغط الدم الشرياني، دسليبيدميا (آثار الشحوم وتخفيض الكوليسترول الكثافة lipoprotein)، زاد الصيام السكر، والسمنة المركزية1. انتشار ميتس في العالم يقدر بنسبة 25-30 في المائة، واستمرار ارتفاع2. هفبيف متلازمة سريرية ايربان غالباً ما ترتبط مع ميتس. إعادة عرض القلب أثناء هفبيف ومراحلها السابقة (أي، أمراض القلب ارتفاع ضغط الدم) أيضا يرافق إعادة عرض اتريا3. انخفاض وظيفة الهوس والتغيرات الهيكلية الاذين الأيسر ارتبطت بزيادة معدل الوفيات والرجفان الاذيني وقصور القلب بداية جديدة4. إعادة عرض الرجفان يتسم بالتغيرات في وظيفة قناة أيون، Ca2 + التوازن، وهيكل أذينية والتنشيط تنتجها الخلايا الليفية، وأنسجة التليف5. غادر يعيد البناء الرجفان في ميتس المتصلة هفبيف والكامنة في الآليات المرضية التي لا تزال غير مفهومة وتحتاج إلى مزيد من التحقيقات متعمقة. وأثبتت نماذج حيوانية يكون أداة قيمة ويؤدي إلى العديد من التطورات في مجال القلب الرجفان6،7،،من89.

كثيرا ما تستخدم الدراسات مع عزل الخلايا المفردة كارديوميوسيتيس التثبت وتكمل في فيفو النتائج التي توصل إليها. عزلة، وثقافة الخلية اللاحقة المحتملة، تسمح للتحقيق مما يشير إلى مسارات والتيارات القناة الأيونية، والإثارة-الانكماش-اقتران. في ظل الظروف الفسيولوجية، لا تتكاثر كارديوميوسيتيس. الانصهار بين تسلسلات التنظيمية النسخي عامل atrial natriuretic وفيروس القردي 40 كبيرة تي مستضد في الفئران المعدلة وراثيا أدى إلى إنشاء تابع مخلدة الأولى، المسماة في-110. المزيد من تطوير خلايا تي-1 يثير الخلايا HL-1، التي لا يمكن إلا أن يكون باساجيد متسلسل ولكن أيضا العقد تلقائياً11. بيد أنهم، إظهار الاختلافات الهيكلية والوظيفية مقارنة مع الخلايا المعزولة حديثا، مثل أولتراستروكتوري أقل تنظيماً، حدوث ارتفاع النامية ميوفيبريلس11، و الحالية إلى الداخل12المنشط فرط الاستقطاب. يتم عزل cardiomyocytes البطين (VCM) في الجرذان والفئران من مجموعة متنوعة من نماذج راسخة13،،من1415،16،،من1718 , 19-عموما، هو قلب قصت المركبة بجهاز لانجيندورف وريتروجراديلي perfused مع Ca2 +-الحرة المخزن المؤقت الذي يحتوي على إنزيمات الجهاز الهضمي، مثل collagenases والبروتياز. الكالسيوم ثم مجددا على نحو تدريجي للظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، حتى ولو كانت البروتوكولات المخصصة لعزل تابع متاح20،21، بسبب زيادة التليف والخلافات المتعلقة بالضغوط، فائدتها في نماذج المرض مع إعادة عرض الرجفان محدودة.

في هذه المقالة، قمنا بتنفيذ بروتوكول لعزل أذينية cardiomyocytes خلية واحدة من الحيوانات التي تظهر الرجفان يعيد البناء (أي، وبخاصة لنموذج فأر ZFS1 هفبيف ذات الصلة ميتس)22. القائمة عزل البروتوكولات الأمثل ويكمله جهاز بسيطة، مصنوعة خصيصا لمراقبة وتعديل ضغط إينترالومينال تجاويف القلب، مما يؤدي إلى زيادة الغلات في cardiomyocytes سليمة شكلياً ووظيفيا. ويوفر البروتوكول التالي الباحث مع دليل خطوة بخطوة، ووصف مفصل لمعدات مصنوعة خصيصا، وقائمة بالحلول، فضلا عن دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع التجارب التي أقرتها "لجنة الأخلاقيات" المحلية (TVA T0060/15 و T0003--15) وتنفيذ الاتفاق مع المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المعهد الوطني للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية).

ملاحظة: يظهر مخطط انسيابي مبسطة للإجراء في الشكل 1.

1-بريارانجيمينتس

  1. إعداد المخازن المؤقتة وفقا للجدول 1.
الحلالجريدة الرسميةبناء القدراتDBبينالي الشارقةS1S2S3NT
كاشف (مم)
كلوريد الصوديوم135135135135135135135135
بوكل4.74.74.74.74.74.74.74
خ2ص40.60.60.60.60.60.60.6
غ2هبو40.60.60.60.60.60.60.6
مجسو41.21.21.21.21.21.21.2
مجكل1
حبيس1010101010101010
توراين30303030303030
الجلوكوز10101010101010
متخذي قرارات العمل10101010101010
كاكل210.010.1250.250.51
جيش صرب البوسنة150707070
مزيج إنزيم المنقي (ثيرموليسين متوسط)0.195 Wünsch وحدة/مل
تعديل درجة الحموضة7.47.47.47.47.47.47.47.4
تعديل درجة الحموضة في37 درجة مئوية4 درجة مئوية37 درجة مئوية37 درجة مئوية37 درجة مئوية37 درجة مئوية37 درجة مئوية37 درجة مئوية
ضبط الأس الهيدروجيني معهيدروكسيد الصوديومهيدروكسيد الصوديومهيدروكسيد الصوديومهيدروكسيد الصوديومهيدروكسيد الصوديومهيدروكسيد الصوديومهيدروكسيد الصوديومهيدروكسيد الصوديوم

الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة. الجريدة الرسمية: نضح العازلة، التي يمكن تخزينها لمدة 3 أيام عند 4 درجة مئوية (300 مل للحيوان الواحد). بناء القدرات: كانوليشن المخزن المؤقت، الذي يمكن تخزينه لمدة 3 أيام عند 4 درجة مئوية (200 مل للحيوان الواحد). DB: الهضم العازلة، التي قد تستخدم في اليوم (40 مل للحيوان الواحد). س: وقف المخزن المؤقت، الذي لديه لاستخدامها خلال اليوم (2 مل للحيوان الواحد). S1: الخطوة 1 العازلة، التي ستستخدم في اليوم (2 مل للحيوان الواحد). S2: الخطوة 2 العازلة، التي ستستخدم في اليوم (2 مل للحيوان الواحد). S3: الخطوة 3 العازلة، التي ستستخدم في اليوم (2 مل للحيوان الواحد). NT: عادي تيرودي، التي قد تستخدم في اليوم (50 مل للحيوان الواحد).

  1. إعداد جهاز لانجيندورف (الشكل 2A).
    1. مسح النظام مع 100 مل إيثانول 70%، تليها الإحمرار 2 من 100 مل مقطر من الماء. ملء هذا النظام مع 200 مل من نضح المخزن المؤقت (الجريدة الرسمية).
    2. تعيين معدل تدفق مضخة تمعجية إلى 3 مل/دقيقة.
    3. معايرة درجة الحرارة من الجريدة الرسمية ترك الجهاز لانجيندورف إلى 39 درجة مئوية.
      1. وضع قنية مصنوعة خصيصا [ز 16، 25 مم طويلة، حادة تلميح إزالة (الشكل 3A)] على رأس جهاز لانجيندورف، وبدء التدفق. قم بتشغيل الوحدة النمطية تدفئة وقم بضبط قيمة التدفئة للوحدة النمطية للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة من الجريدة الرسمية على طرف القنية. وبمجرد الانتهاء من معايرة درجة الحرارة، نقل قنية مصنوعة خصيصا للمحاقن المستخدمة كانوليشن (الشكل 2).
    4. إعداد جهاز التحكم بالضغط (الشكل 3) إلى جانب النظام لانجيندورف. جبل إبرة الفراشة على المشبك ترايبود وإعداد 3 عقده الحظر.
      ملاحظة: يختلف نشاط إنزيم كولاجيناز مع درجة الحرارة. مطلوب رصد درجة الحرارة الاذين الأيسر، فضلا عن تسوية دينامية منه، لاحقاً في هذا الإجراء.
  2. قم بإعداد المعدات للختان الجهاز وكانوليشن وفقا الشكل 2B. تملأ الكأس، والمحاقن، وطبق بيتري مع مخزن مؤقت كانوليشن المثلج (CB) وتعد عقده كانوليشن.
  3. هيبارينيزي الفئران مع 500 وحدة دولية من الهيبارين كل 100 غم وزن الجسم في الفئران كما يلي.
    1. ضع 2 مل إيسوفلوراني 100% في دائرة التعريفي لتخدير مناسبة للقوارض. نقل الفئران السمنة زفس-1 أسبوع من العمر 21 من القفص إلى قاعة التعريفي. السماح للفئران لإدخال التخدير العميق، أشار إلى تباطؤ التنفس إلى نصف ما تردد الأولية.
    2. إزالة الفئران من قاعة التعريفي. حقن 500 وحدة دولية من الهيبارين كل 100 غم وزن الجسم في الفئران في الصفاق استخدام المحاقن الهيبارين.
    3. عودة الفئران في قفصة والسماح لكي تستيقظ.
      ملاحظة: ليس ضروريا للحفاظ على العقم خلال الخطوة 1.4. الانتظار 20 دقيقة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. يمكن أن يسبب منع تخثر الدم غير مكتملة الدم تخثر الدم، مما يؤدي إلى قال الصغيرة، التي يمكن أن تؤثر إلى حد كبير نوعية والعائد من كارديوميوسيتيس معزولة.

2. إعداد قلب

  1. ضع 2 مل إيسوفلوراني 100% في دائرة التعريفي لتخدير مناسبة للقوارض. نقل الفئران السمنة زفس-1 أسبوع من العمر 21 من القفص إلى قاعة التعريفي. السماح للفئران لإدخال التخدير العميق، أشار إلى تباطؤ التنفس إلى نصف ما تردد الأولية.
  2. Euthanize الحيوان بقطع الرأس باستخدام مقصلة مناسبة للقوارض. ثبت أطرافه الفئران على سطح رغوة البوليسترين. رفع وإزالة الجلد تغطي عملية الرهابه مع المقص الجراحي. فتح الصفاق أسفل الأقفاص الضلع على كلا الجانبين، وكشف الحجاب الحاجز.
  3. فتح الحجاب الحاجز بإجراء شق على طول القوس الأمامي باستخدام مقص جيد. قطع طريق الأضلاع على كلا الجانبين على طول ميدياكلافيكولاريس لينيا حتى العظم العضدي، استخدام المقص الجراحي، لفضح منصف في الموقع.
  4. إزالة الرئتين في نهايات القاصي يقضوا مع مقص جيد. قطع الغدة الصعترية لفضح القوس الاورطي.
  5. قرصه قاعدة القلب باستخدام الملقط وهدم بلطف نحو ذيل الحيوان. قص عبر الشريان الاورطي مع المحافظة على سحب في القلب، وترك شريحة طويلة 5 ملم من الشريان الاورطي تعلق للقلب. بسرعة نقل القلب في CB المثلج 50 مل في الكأس 50 مل (الشكل 2).
    ملاحظة: أثناء خطوات 2.5-3-3، القلب فعال في ظروف الدماغية. تجنب تجاوز إجمالي 3 دقيقة لهذه الخطوات كي لا تلحق الضرر كارديوميوسيتيس.

3-كانوليشن

  1. انتظر حوالي 10 s للقلب لتهدئة واغتنام تقلصات. تحويل القلب إلى طبق بتري يحتوي على 50 مل جديد، CB المثلج. بعناية إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بالشريان الاورطي باستخدام الملقط، والمقص.
  2. إدراج قنية مصنوعة خصيصا (نفس المستخدمة في الخطوة 1.2.3)، التي أرفقت بحقنه 10 مل مليئة المثلج CB، 3 مم في الشريان الاورطي. ثبت الشريان الاورطي على القنية بربط واحد من عقده cannulation اثنين (الشكل 3B) في المسافة البادئة الدانية إلى الطرف القنية.
    ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم إلحاق الضرر الصمام الابهري باختراق مع القنية.
  3. بلطف تدفق الشريان الاورطي مع 5 مل من المثلج CB استخدام المحاقن يعلق على القنية حتى لا يوجد المزيد من الدم مرئياً في الشرايين التاجية. بلطف تدليك الاذين الأيسر استخدام الملقط وحقن 5 مل المتبقية لبناء القدرات، مما يسمح لأي الدم الزائد إلى إزالته من التجويف في طبق بتري.
  4. قرانهما cannulation الثانية (خياطة: جامعة جنوب المحيط الهادئ 3-0، الحرير) في المسافة البادئة القاصي إلى الطرف القنية. قم بإلغاء تحميل قنية بالقلب المرفقة من المحاقن. جبل قنية بالقلب المرفقة إلى لانجيندورف استخدام محول مناسب.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مرتفعة الضغط في تجويف البطين أثناء التروية في جهاز لانجيندورف. عقده cannulation الإضافي مطلوب للإبقاء على هذا الضغط بتجنب أي تسرب anterograde المخزن المؤقت عن طريق الشريان الاورطي.

4-الضغط على التلاعب والهضم

  1. بدء تشغيل مضخة تمعجية جهاز لانجيندورف لبدء نضح الأنسجة القلبية بالجريدة الرسمية. قرانهما تراكم مزدوجة (خياطة: جامعة جنوب المحيط الهادئ 3-0، الحرير) حول قاعدة القلب، باستثناء الشريان الاورطي. كرر هذه الخطوة حتى تضخم من الاذين الأيمن والأيسر، فضلا عن الجيوب التاجي، ويلاحظ.
  2. ثقب الأتريوم بإبرة الفراشة لجهاز التحكم بالضغط (3D الشكل) وتسمح الأتريوم انكماش. التعامل مع ضغط intraluminal الأتريوم بضبط ارتفاع خرطوم الفراشة. تبقى اتريوم مضخمة قليلاً في بقية أنحاء الإجراء؛ رصد وضبط وفقا لذلك.
    ملاحظة: هذه الخطوة يحتاج إلى إجراء سريعاً، كما تضخم مطول الاذين الأيسر سوف يسفر عن وفاة كارديوميوسيتي.
  3. قياس درجة الحرارة التقريبية الاذين الأيسر عن طريق وضع مجس درجة حرارة بين الاذين الأيسر والبطين الأيسر. ضبط درجة حرارة لانجيندورف تدفئة الوحدة تبعاً لذلك، واستهداف درجة حرارة تقارب 37 درجة مئوية من الاذين الأيسر.
  4. نتخلل القلب بالجريدة الرسمية لمدة 3 دقائق.
  5. قم بالتبديل نضح إلى المخزن مؤقت لهضم (DB) لما يقرب من 14-18 دقيقة.
    ملاحظة: الهضم اكتمال عندما ينهار هيكل أذينية الأيسر والأنسجة يكتسب مادة حليبي.
  6. قرصه اتريوم استخدام الملقط وسن سحب طفيف. إزالة الاذين الأيسر باستخدام مقص غرامة ونقل الأتريوم في قارب وزنها كبير الذي يحتوي على 2 مل من إيقاف المخزن المؤقت (SB)، غمر الأنسجة تماما.
  7. التخلص من أنسجة القلب المتبقية وفقا للمبادئ التوجيهية للمختبر حيث يتم تنفيذ الإجراء.

5-الخلية تجهيز وإعادة التكيف الكالسيوم

  1. تخطر أذينية الأنسجة إلى قطع صغيرة من تقريبا 2 × 2 مم باستخدام مقص جيد.
  2. تفريق الأنسجة بالشفط لطيف وطرد من قطع الأنسجة باستخدام ماصة نقل. متابعة هذا الإجراء لمدة 5 دقائق تقريبا حتى يمكن ملاحظتها الانفصال عيانية للأنسجة.
    ملاحظة: تجنب أي فقاعات الهواء أثناء هذه الخطوة، كتعريض الخلايا للهواء سوف يسفر عن وفاة كارديوميوسيتي.
  3. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. السماح لقطع الأنسجة تسوية لنقل س. 30 المادة طافية في أنبوب مخروطي 15 مل آخر. السماح للخلايا بتسوية لمدة 15 دقيقة.
  4. إزالة وتجاهل المادة طافية. إضافة 2 مل الخطوة 1 المخزن المؤقت (انظر الجدول 1). السماح كارديوميوسيتيس على تسوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: تتضمن المادة طافية المهملة أيضا الخلايا الليفية، وخلايا بطانية. يرجى الرجوع إلى بروتوكولات أخرى إذا كان ذلك هو المطلوب لاستخدام هذه الخلايا لتجارب14،23. وسيتضمن بيليه معظمهم أذينية cardiomyocytes، الذي يمكن أن تؤكده مجهرية الخفيفة. وتناقش خصائص أذينية cardiomyocytes المجهري في الخطوة 6، 1.
  5. إزالة وتجاهل المادة طافية. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت في الخطوة 2. السماح كارديوميوسيتيس على تسوية لمدة 10 دقائق.
  6. إزالة وتجاهل المادة طافية. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت في الخطوة 3. السماح كارديوميوسيتيس على تسوية لمدة 10 دقائق.
  7. إزالة وتجاهل المادة طافية. إضافة 250 ميليلتر من الطبيعي تيرودي (NT) الذي يحتوي على 1 مم Ca2 +.
  8. نقل 50 ميليلتر من تيرودي العادية التي تحتوي على كارديوميوسيتيس خوارج على طبق زجاج لأسفل، التي ما برحت المغلفة مع laminin 25% (والسماح لتجف مسبقاً). السماح كارديوميوسيتيس على تسوية لمدة 10 دقائق.
  9. ملء طبق زجاج السفلي مع 500 ميليلتر من NT الذي يحتوي على 1 مم كاكل2.

6. الوظيفية تقييم الإثارة-الانكماش-اقتران

  1. تقييم مورفولوجيا الخلايا والبقاء تحت مجهر خفيفة استخدام تكبير X 20 (الشكل 4A و 4B). عشوائياً تحديد ما يقرب من 100 خلية وتصنيفهما كقابلة للتطبيق أو غير قادرة على البقاء من أجل تقدير صلاحية إجراء عزل الخلية.
    ملاحظة: خلايا قابلة للحياة تتميز ببنية ساركومير متماثل وفي غياب الغشاء بليبس وشكل قضيب.
  2. تحميل الخلايا مع Ca2 +-صبغة الفلورسنت الحساسة داخل 20 دقيقة لإتمام الخطوة 5.9.
    1. إضافة 10 ميكرون Fluo4-صباحا وحتى 500 ميليلتر من NT. إزالة المادة طافية من الطبق الزجاج السفلي (من الخطوة 5، 9). إضافة NT الذي يحتوي على Fluo4-صباحا إلى الطبق أسفل الزجاج. احتضان هذا الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة وتجاهل المادة طافية. تغسل العينة 2 x باستخدام 500 ميليلتر من NT.
  3. تصور Ca2 +-الإثارة مع مجهر [كنفوكل] على النحو التالي.
    1. نقل الطبق أسفل الزجاج إلى مجهر [كنفوكل] وتصور Ca2 +-الإثارة مع مجهر [كنفوكل] (الليزر شدتها 5.8 في المائة، الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات في 515 نانومتر) استخدام تكبير X 40.
    2. نتخلل الخلايا مع NT تسخينها إلى 37 درجة مئوية باستخدام جهاز سوبيرفوسيون مناسبة. وبدلاً من ذلك، إبقاء الخلايا الحارة استخدام حاضنة حرارة المجهر التي شنت.
    3. تنشيط كارديوميوسيتيس في حقل كهربائي مع أقطاب مشجعا المتاحة تجارياً، ومجهر التي شنت على تردد 1 هرتز وتيار كهربائي من 24 ألف-انتظر 1 دقيقة السماح بالوصول إلى حالة من الثبات من Ca2 + التعامل مع الخلايا.
    4. ضع السطر تفحص موازية للمحور مستعرضة، منتصف الطريق بين الحافة من اختيارها عشوائياً، والنواة الميكروسكوب المتعاقدة الخلية. الحصول على خط مسح الصور عن طريق مسح المتكررة.
    5. باستخدام برمجيات التصوير متاحة بحرية لتقدير كثافة إشارة مباشرة قبل تحفيز كهربائي (و0) عبر الخلية بأكملها. ارسم كثافة الإشارات عبر الخلية بأكملها على مدى دورة التحفيز 1 (و). القسمة (و) (و0) الحصول كل منهما Ca2 + عابرة.

مخطط انسيابي لمعالجة الأعضاء ، خطوات حقن الهيبارين ، استئصال الأعضاء ، القنية ، التصوير.
رقم 1: مخطط انسيابي تبسيط إجراءات العزل. هذا الإجراء الغاية الحساسة للوقت حتى يتم إكمال الهضم الأنزيمي ميوسيتيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مخطط نظام القلب والأوعية الدموية وأدوات الجراحة للدراسة التشريحية. إعداد الفحص المجهري ومعدات المختبر.
رقم 2: إعداد المعدات قبل العزلة. (أ) هذا الفريق يظهر جهاز لانجيندورف عصامي: (1) سفينة رد فعل تغلف بالجريدة الرسمية؛ (2) سفينة رد فعل تغلف ببناء القدرات؛ (3) 3-طريقة محبس الحنفية؛ (4) حقنه؛ (5) مضخة تمعجية؛ (6) هو غمر تدفئة؛ (7) فخ فقاعة تغلف؛ و (8) قنية والقلب. (ب) هذا الفريق يظهر الإعداد للختان كانوليشن وجهاز لتدفق عمل أمثل: (1) كوب 100 مل مع 50 مل من المثلج بناء القدرات؛ (2) حقنه 10 مل مع المثلج بناء القدرات؛ (3) طبق بيتري مع المثلج بناء القدرات؛ (4) مصدر ضوء؛ (5) قنية مصنوعة خصيصا مع كانوليشن عقده (انظر أيضا الشكل 3 ألف و 3 باء)؛ (6) دفع غرامة، منحنى ملقط؛ (7) ملقط الأنسجة؛ (8) الملقط غرامة، زاوية 45°؛ (9) البطن المقص الجراحي؛ (10) غرامة المقص الجراحي؛ (11) 4 × 30 ز الإبر؛ و (12) إبرة ز 15. (ج) هذا الفريق يوضح معدات محمولة على المجهر للتصوير [كنفوكل]: أقطاب مشجعا الكهربائية (1)؛ (2) قلم سوبيرفوسيون؛ (3) طبق زجاج لأسفل مع تابع؛ واقطاب مشجعا الكهربائية البلاتين مغمورة (4). (د) يظهر هذا الفريق إعداد المجهر للتصوير [كنفوكل]: (1) المجهر [كنفوكل]؛ (2) قلم سوبيرفوسيون؛ (3) خزان سوبيرفوسيون المخزن مؤقت؛ (4) منظم تدفق سوبيرفوسيون؛ (5) سوبيرفوسيون تدفئة الوحدة النمطية؛ (6) محطة عمل كمبيوتر؛ (7) مشجعا كهربائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

إعداد التوازن الثابت لتجربة الأنسجة. تقنية حلقة الخياطة ، حامل المشبك ، دورق
الشكل 3: معدات مصنوعة خصيصا. (أ) هذا الفريق يظهر 15 التلاعب قنية ز مع قفل اللوير. تشير الأسهم إلى اﻻنبعاجات اثنين لعقدة كانوليشن. (ب) هذه هي عقده cannulation، هما عقده تراكم مزدوجة وضعت فوق بعضها البعض لتشديد السريع. الأسهم تشير إلى أين والذي أمر العقدة يحتاج إلى تشديد. (ج) هذا الفريق يظهر جهاز التحكم في ضغط المجمعة. إبرة فراشة ز 21 هو مدمن مخدرات في المشبك ترايبود. يتم الاحتفاظ الخرطوم في نفس ارتفاع الإبرة. يتم فتح رأس المسمار. ويمكن تغيير ارتفاع خرطوم الفراشة كما هو مبين بالأسهم من أجل تغيير ضغط الاذين الأيسر إينترالومينال. هو ثقب اتريوم (د) اليسار مع جهاز التحكم بالضغط. هذه الصورة توضح الاذين الأيسر مبالغ فيها من الناحية المثالية. علامات القطع الناقص موضع العقدة تراكم. هو ثقب atrium (ﻫ) اليسار مع جهاز التحكم بالضغط. هذه الصورة توضح الاذين الأيسر تضخم مفرط، مما سيؤدي إلى انخفاض عائد من تابع قابلة للحياة. علامات القطع الناقص موضع العقدة تراكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في 21 أسبوعا عمر، 60 – 90% تابع قابلة للتطبيق (ويقدر كما هو موضح في الخطوة 6، 1)، بعد الكالسيوم إعادة التكيف (الخطوة 5، 4 – 5.7)، يمكن أن تكون معزولة من زسف-1 الفئران السمنة بهذه الطريقة (الشكل 4 أ). في الفئران، تتميز تابع بمختلف والنمط الظاهري ايربان أكثر بالمقارنة مع24،فكمس25. ويبين الشكل 4B ACM فردية مع الحفاظ على الأغشية وهيكل ساركومير، كل مؤشرات قوية لخلية متكاملة وظ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، نحن أول من وصف بروتوكول لعزل تابع خلية واحدة من نموذج الفئران من المتصلة ميتس هفبيف تظهر علامة يعيد الرجفان22. الإجراء تحديا فريداً يمكن أن تجعل الأنسجة الدهنية المفرطة في إعداد العمليات الجراحية، فضلا عن كانولاتيون من الشريان الاورطي، تزداد صعوبة. وتقدم دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في عناوين الجدول 2 القضايا الأكثر شيوعاً من إجراءات العزل.

المشكلة<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

أيد هذا البحث دزهك (المركز الألماني "بحوث القلب والأوعية الدموية"، D.B.)، اكفس (Stiftung Else-كرنر-فريسينيوس، F.H.)، والألمانية (الوزارة الألمانية للتعليم والبحوث)، فضلا عن البوسنة والهرسك-مستشفى الشارتي تمويل برنامج العلماء اﻻكلينيكي بمستشفى الشارتي-برلين Universitätsmedizin ومعهد برلين للصحة (F.H.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ZSF-1 الفئران السمنةمختبرات نهر تشارلز ، إنك.21 أسبوعا
من العمر مقص القزحيةالدقيقة أدوات العلوم الدقيقة GmbH14094-11
مقص جراحيأدوات العلوم الدقيقة GmbH14001-18
ملقط الضمادات الدقيقة (منحني ، مسن)Aesculap، Inc.ملقط الأنسجة BD312R
(مستقيم ، 1 × 2 أسنان)Aesculap، Inc.BD537R
ملقط ربط (بزاوية)Aesculap، Inc.MA624R
القوارض والمقصلة الصغيرة للحيواناتالصغيرة كينت Scientific Corp.منخفضة التكلفة DCAP
3.0 لتركينت Scientific Corp.SOMNO-0730 
مجموعة التسريب المجنح بالفراشة 21 جرامHospira، Inc.181106101
Abbocath 16 GHospira، Inc.0G7149702
Microlance Underdermic NeedleBecton Dickinson GmbH301300تعديل الإبرة لصنع قنية
براون حقنة بيرفيوسور الأصلية 50 ملB. Braun Melsungen AG8728810F
حقنة براون حقنة منفردة 10 ملB. Braun Melsungen AG2057926
Beaker 50mlDuran Group (DWK Life Sciences GmbH)21 106 17
طبق بتري Duroplan (100 × 20 مم)Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)21 755 48
Seraflex Suture USP 3/0SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KGIC208000
VWR قوارب الوزن المربعة التي يمكن التخلص منها 100 ملVWR، Inc.10803-148
الستايروفوم
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش ، Inc.71380
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتش ، إنك.P4504
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةSigma-Aldrich، Inc.P5379
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتش ، إنك.S0876
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدراتسيجما ألدريتش ، إنك.230391
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش ، إنك.M8266
هيبسسيجما ألدريتش ، إنك.H3375
تورينسيجما ألدريتش ، إنك.T0625
الجلوكوزسيجما ألدريتش ، إنك.G7528
2،3-Butanedione monoximeSigma-Aldrich، Inc.B0753
محلول كلوريد الكالسيوم (1 م)شركة سيجما ألدريتش21115
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتش ، إنك.A9647
ليبراسروش (سيجما ألدريتش ، إنك)LIBTM-RO
HeparinRotexmedica GmbH3862357
Forene (Isoflurane)Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG10182054
Laminin من Engelbreth-Holm-Swarm غشاء القاعدي لساركوما الفئرانSigma-Aldrich، Inc.L2020
WillCo طبق زجاجي القاع 500 & مايكرو; ل 0.005 ممWillCo Wells BVHBST-3522
Fluo4 AMInvitrogen (ثيرمو فيشر العلمي ، وشركة)F142015 & M لمدة 20 دقيقة في RT
Di-8-ANNEPSInvitrogen (Thermo Fisher Scientific، Inc.)D316710 وميكرو ؛ م لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة ؛ ج 
Mitotracker RED FMInvitrogen (ثيرمو فيشر العلمي ، وشركة)M2242520nM لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة ؛ C
وعاء تفاعل مغلف 500 ملجبر. Rettberg GmbH107024414
وعاء تفاعل مغلف 1000 ملجبر. Rettberg GmbH107025414
مصيدة الفقاعات المغلفةGebr. Rettberg GmbH134720001
ED التدفئة الغاطسة الدائريJulabo GmbH9116000
Reglo Digital MS-2/6 مضخة التمعجيةIsmatec (Cole-Parmer Gmbh)ISM 831
Voltcraft Thermometer 302 K / JConrad Electronic SE030300546
Tubing
LSM 700 المجهرCarl Zeiss، Inc.
برنامج التصوير ZEN 2.3Carl Zeiss، Inc.410135-1011-240 
وحدة تحكم سخان أحادية القناة TC-324BWarner Instruments، LLC64-2400
نظام التروية 8 قنواتWarner Instruments، LLC64-0185
8 قنوات متعددة الخطوط في الخط سخاناتWarner Instruments، LLC64-0105
غرفة الحث سطح

المراجع

  1. Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
  2. International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
  3. Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
  4. Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
  5. Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
  6. Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
  7. Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
  8. Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
  9. Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
  10. Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
  11. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  12. Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
  15. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357(2014).
  16. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289(2013).
  17. Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109(2014).
  18. Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
  19. Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
  20. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).
  21. Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823(2014).
  22. Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
  23. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033(2010).
  24. Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
  25. Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
  26. Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
  27. Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
  28. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  29. Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
  30. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  31. Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
  32. Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
  33. Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
  34. Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلايا العضلية القلبية الأذينيةتروية لانجندورفنموذج جرذ لقصور القلب مع الحفاظ على الكسر القذفيقلب متلازمة التمثيل الغذائيعزل الخلايا المفردةبروتوكول تصوير الكالسيوماقتران الاستثارة والتقلصدراسة إعادة تشكيل الأذينتحليل المجهر البؤريتقييم حيوية الخلايا
عزل كارديوميوسيتيس خوارج من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.