مقالة منهجية

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

DOI:

10.3791/57978

⸱

يوليو 6, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة طريقة التزاوج القائم لتسهيل فحص أوفيريكسبريشن في مهدها الخميرة استخدام مكتبة صفت بلازميد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخميرة مهدها قد استخدمت على نطاق واسع كنموذج لدراسة البروتينات المرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان. الفحص الوراثي على نطاق الجينوم أداة قوية التي يشيع استخدامها في الدراسات الخميرة. التعبير عن عدد من البروتينات المرتبطة بأمراض الأعصاب في الخميرة الأسباب سيتوتوكسيسيتي وتشكيل التجميعية، ولخص النتائج في المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات. هنا، يمكننا وصف طريقة لفحص نموذج خميرة من البروتين المرتبط بالتصلب العضلي الجانبي فوس لمعدلات سميته. بدلاً من استخدام التحويل، هذا البرنامج فحص جديدة تعتمد على التزاوج من الخميرة لإدخال لمكتبة أراييد من البلازميدات في نموذج الخميرة. يحتوي الأسلوب على التزاوج اثنين من مزايا واضحة: أولاً، أنها ذات كفاءة عالية؛ ثانيا، يمكن تخزين مكتبة والبلازميدات arrayed قبل تحويلها للطويلة الأجل أسهم والغليسيرول وتطبيقها بسرعة على شاشات أخرى دون أن الخطوة كثيفة العمالة للتحول إلى نموذج الخميرة في كل مرة. ونحن تثبت كيف يمكن أن تستخدم هذا الأسلوب بنجاح على الشاشة للجينات التي تعديل سمية فوس.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae كانت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الأساسية1 فهم العمليات الخلوية التي تتصل مباشرة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وعلاوة على ذلك، قد استخدمت ككائن نموذج لدراسة البروتينات البشرية المرتبطة بالمرض، مثل تلك المرتبطة بأمراض الأعصاب الأكثر شيوعاً، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون والجانبي الضموري 2من التصلب الجانبي (المرض). ميزة نموذج الخميرة هو السهولة التي يمكن أن يؤديها شاشة على نطاق الجينوم لتحديد المسارات الخلوية المتصلة بسمية البروتينات ذات الصلة بالمرض، مما يعطي نظرة ثاقبة إليه سميتها. شاشة واحدة من هذا القبيل يطلق على شاشة مكتبة overexpression، فيه كل من جينات الخميرة 5,500 في مكتبة أراييد تتحول إلى نموذج خميرة على تحديد الجينات التي يمكن تعديل السمية عند أوفيريكسبريسيد. هذا أسلوب الفرز قد طبقت بنجاح في نماذج الخميرة متعددة الأعصاب المرتبطة بالمرض البروتينات، بما في ذلك هونتينجتين لمرض هنتنغتون3، α-سينوكلين لمرض باركنسون4،5 ، Aβ6من مرض الزهايمر، وفوس، ماساتشوستس-43 للمرض7،،من89. الخطوة كثيفة العمالة أكثر من الشاشة على حدة في حين أنه يتم عادة في طريقة الفائق10، هو تحويل جينات الخميرة 5,500 من مكتبة أراييد. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في كل مرة يتم تكرار الفحص، وكلما نموذجا خميرة المنشأة حديثا تحتاج إلى دراسة. من المهم إيجاد وسيلة أكثر كفاءة لإنجاز هذه المهمة.

[ستبلى] يمكن أن توجد خلايا الخميرة في أشكال فرداني والنباتات على حد سواء. هناك نوعان من المقابلة للتزاوج أنواع الخلايا فرداني، يزاوج نوع والخلايا α. فرداني للتزاوج كل نوع تنتج وتفرز فرمون التزاوج المحددة الخاصة بهم، التي تستجيب فقط الخلايا نوع التزاوج المعاكس. وهذا يسمح للتزاوج بين والخلايا α لإنتاج الخلايا ضعفاني مستقرة،/α. هذه العملية هي عفوية وذات كفاءة عالية11. يمكن لنا أن نستفيد من هذه دورة حياة فريدة من نوعها S. cerevisiae لإدخال بلازميد المكتبة. وبشكل أكثر تحديداً، ستحول كل الجينات في مكتبة صفت بلازميد إلى الخلايا فرداني من نوع التزاوج واحد، أي، خلية α. سيتم تخزين هذه الخلايا التي تحتوي على جينات مكتبة ثم والغليسيرول الأسهم في شكل 96-جيدا أراييد. لكل طراز الخميرة التي تحتاج إلى فحص، يمكن إذابة خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة من المخزون والغليسيرول، ويمكن أن يتم الفحص عن طريق التزاوج مع نموذج الخميرة من اهتمام بالمقابل التزاوج نوع، أينوع التزاوج. هذه الفكرة من استخدام التزاوج للجمع بين اثنين من الجينات في الخميرة ليست جديدة. قد طبقت بنجاح في الخميرة الفائق الفرز الهجين اثنين، فيه بناء طعم (أي، Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الأنشطار) في نوع التزاوج واحد جمعت عن طريق التزاوج مع بنية بري من مكتبة أراييد 12-غير أن هذه الاستراتيجية لم تطبق ابدأ في عروض مكتبة أوفيريكسبريشن، التي استخدمت دائماً طرق التحويل التقليدية.

قبل إنشاء مختبرنا نموذج خميرة فوس البروتين المرتبط بالمرض7. من خلال الفحص مكتبة أوفيريكسبريشن باستخدام أسلوب التحويل اكتشفنا خمس جينات الخميرة (ECM32، NAM8، SBP1، SKO1، و VHR1) أن إنقاذ سمية فوس عند أوفيريكسبريسيد. وتأكدت هذه النتائج بشكل مستقل مع دراسة مماثلة بآخر مجموعة8. وأبدى hUPF1، homolog الإنسان من ECM32، لاحقاً لقمع السمية في الخلايا العصبية الأولية13 وفي نموذج حيوان من المرض14 كذلك. باستخدام هذه الجينات الخمسة كدليل على المبدأ، علينا أن نبرهن أن الجينات خمس جميع المثل إنقاذ فوس السمية عند إدخالها في نموذج الخميرة فوس بالتزاوج. حيث يمكن تخزينها بشكل دائم في الأسهم والغليسيرول خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة وإحياء كلما دعت الحاجة، سيتم إزالة هذا الأسلوب القائم على التزاوج خطوة وقتاً طويلاً لتحويل كل مرة المكتبة بحاجة إلى فحص ضد. منذ التزاوج ذات كفاءة عالية بأي تحويل بلازميد المعنية، هذه الاستراتيجية أيضا إلى حد كبير يقلل التكلفة المرتبطة بتنقية وتحويل مكتبة بلازميد كبيرة. سوف نطبق هذا الأسلوب بنجاح إلى مكتبة الفرز ضد الخميرة نموذج فوس.

إجراء الفرز على أساس التزاوج يرد بإيجاز في الشكل 1. في البداية، تتحول إلى سلالة خميرة فرداني من التزاوج α نوع استخدام بروتوكول تحول الفائق خميرة التي يحتوي على كل من لوحة 96-جيدا جيدا الخميرة تحول مع بلازميد مكتبة محددة المكتبة بلازميد صفت. يتم حفظ هذه المجموعة من الخميرة المحولة كمخزون والغليسيرول يمكن إذابة وإحياؤها لاستخدامها في وقت لاحق. نموذج الخميرة من الاهتمام، في هذه الحالة سمية فوس، يجب أن يتم إنشاؤها في سلالة خميرة فرداني مع نوع التزاوج المعاكس (التزاوج نوع). في طريقة الفائق باستخدام معقم 96-دبوس مثاليان، سلالة فوس وسلالات الخميرة التي تحتوي على مكتبة بلازميد يتم تحويلها إلى لوحات 96-البئر الذي يحتوي على الوسائط الغنية، ويسمح لرفيقه. بعد التزاوج، كمية صغيرة من كل بئر الثقافة التزاوج يتم نقلها إلى 96-جيدا لوحات تحتوي على وسائط الإعلام التسرب الاصطناعية في الخميرة مثنوية فقط التي تحتوي على كلا فوس ومكتبة الجينات يمكن أن تنمو. ثم يتم استخدام جهاز اكتشاف روبوتية لنقل الثقافة الخميرة من كل بئر على لوحات أجار فيها فعل التعبير عن فوس والجينات المكتبة.  بالإضافة إلى ذلك، رصدت الثقافة الخميرة للتحكم في لوحات أجار حيث فوس والجينات مكتبة لا يعبر عن. في أعقاب النمو على ألواح أجار، سيتم تحديد الجينات التي إنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا صمم لفحص والبلازميدات مكتبة الواردة في عشر لوحات 96-جيدا لكن يمكن تحجيمها صعودا أو هبوطاً تبعاً لذلك. البروتوكول يحتاج إلى تكرار لإكمال فحص مكتبة كاملة. عادة، يمكن أن تعالج بشكل مريح الفحص ضد 10 لوحات من الجينات مكتبة في كل مرة بشخص واحد.

1-الإعداد للتحول الخميرة 96-جيدا

ملاحظة: هذه الخطوة ويتم ذلك كما سبق وصف7،10.

  1. الكوة 5 ميليلتر (حوالي 50 – 100 نانوغرام) من بلازميد الحمض النووي من مكتبة بلازميد المنتشرة في كل من لوحة 96-بئر مستديرة القاع جيدا.
    ملاحظة: سيكون مثالاً لتلك المكتبة خميرة جينات overexpression مكتبة10.
  2. تلقيح 150 مل من الخميرة ببتون سكر العنب (YPD) وسائط الإعلام في قارورة 500 مل مع مستعمرة (2-3 مم) من سلالة الخميرة فرداني W303α. تبني عليها بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة).
  3. في صباح اليوم التالي، قياس OD600 الثقافة بين عشية وضحاها، وتمييع ثقافة الخميرة OD600 = 0.1 في (تصل إلى) 2 لتر YPD. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة) ح ~ 5 حتى يصل إلى الثقافة OD600 = 0.4 – 0.6.

2-الخميرة التحول

  1. حصاد الثقافة الخميرة بملء 8 زجاجات الطرد المركزي العقيمة 250 مل وسينتريفوجينج لهم في درجة حرارة الغرفة في س 3,000 ز للحد الأدنى 10 من أجل إيقاف المادة طافية دون تعطيل بيليه.
    ملاحظة: القيام بجميع الخطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.
  2. أغسل الخميرة مع العقيمة المقطر H2o. لهذا، إضافة 100 مل من العقيم ح2س لكل زجاجة للطرد المركزي ودوامه أن ريسوسبيند بيليه الخلية. دمج الخلايا غسلها 2 زجاجات والطرد المركزي لهم في س 3,000 ز 5 كحد أدنى من أجل إيقاف المادة طافية.
  3. تغسل الخلايا في كل زجاجة في 100 مل من 0.1 م ليواك/1XTE (100 مم ليواك؛ 10 ملم تريس، pH 8.0; 1 مم يدتا) والطرد المركزي لهم في 3,000 س ز 5 كحد أدنى من أجل إيقاف المادة طافية.
  4. بينما سينتريفوجينج، يغلي 5 مل من سمك السلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي (10 مغ/مل) عند 100 درجة مئوية باستخدام سخان كتلة لمدة 3 دقائق وثم تبرد على الجليد.
  5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 25 مل من 0.1 م ليواك/1XTE في كل زجاجة، والجمع بين الخلايا ريسوسبينديد ونقلها إلى قارورة 150 مل. إضافة 5 مل من الحيوانات المنوية السلمون يبرد قبل الحمض النووي واحتضان أنه عند 30 درجة مئوية مع الهز (225 لفة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.
  6. صب الخليط خلية في خزان كاشف المتاح عقيمة، واستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 35 ميليلتر من الخليط خلية لكل بئر من الجولة-أسفل لوحة 96-البئر الذي يحتوي على مكتبة بلازميد الحمض النووي. لوحات دوامة 96-البئر باستخدام فورتيكسير طبق لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة. احتضان لوحات لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية دون المصافحة.
    ملاحظة: لا المكدس اللوحات، وحتى يمكن نقل الحرارة أكثر كفاءة. وقد وجدنا أن فورتيكسينج لوحات 96-بئر 1,000 لفة في الدقيقة لا يسبب السائل إلى تسرب من الآبار، ولكن ينبغي اختبار سرعة دوامة آمنة قبل القيام بالخطوة.
  7. وفي قارورة، تعد 200 مل من تحويل المخزن المؤقت الذي يحتوي على تركيز نهائي من 40% PEG3350 و [دمس] 10% 0.1 م ليواك. إعداد المخزن المؤقت التحول فورا قبل الاستخدام ومزجها جيدا بالهز.
  8. لوحات إزالة 96-جيدا من الحاضنة 30 درجة مئوية ومزجها لمدة 30 ثانية 1,000 لفة في الدقيقة باستخدام فورتيكسير لوحة. إضافة 125 ميليلتر من المخزن المؤقت التحول لكل بئر ومن ثم دوامة لوحات لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة.
  9. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وثم الحرارة صدمة الخميرة بوضع اللوحات في حاضنة 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: لا المكدس اللوحات.
  10. الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز. إزالة المخزن المؤقت التحول من الآبار بعكس اللوحات على حاوية نفايات وبقوة إلقاء المخزن المؤقت من اللوحات. لطخة لوحات مقلوبة على منشفة ورقية نظيفة لإزالة أي سائل على رأس اللوحات بسرعة.
  11. شطف الخلايا عن طريق إضافة إلى ميليلتر 200 لوحات من التسرب الحد الأدنى المتوسط المقابلة لعلامة اختيار على بلازميد المكتبة.
    ملاحظة: قمنا باستخدام وسيلة اتفاق جولة أوروغواي اصطناعية.
  12. الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز وإزالة المادة طافية على حاوية نفايات كما في الخطوة 2، 10.
  13. إضافة 160 ميليلتر أورا-المتوسطة تحتوي على حد أدنى 2% الجلوكوز. دوامة لوحات لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة واحتضانها لهم عند 30 درجة مئوية عن 48 ساعة دون المصافحة. بعد 48 ساعة، ملاحظة أن بيليه خميرة المحولة مرئياً في الجزء السفلي من كل بئر.
  14. استخدام موزع سائلة، إضافة 100 ميليلتر من اتفاق جولة أوروغواي، وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز في كل من مجموعة جديدة من لوحات 96-جيدا جيدا.
  15. دوامة لوحات تحتوي على الخميرة المحولة (من الخطوة 2، 13) 1,000 لفة في الدقيقة لمدة 30 س. باستخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس بلاستيك عقيمة ووضع الدبابيس في الآبار التي تحتوي على الخميرة المحولة وتطعيم لهم ثم إلى الآبار المقابلة للوحات الجديدة مليئة بوسائل الإعلام. احتضان لوحات جديدة عند 30 درجة مئوية ح 24.
    ملاحظة: إذا كان يعمل مع 10 لوحات، المتوسط يمكن أيضا يمكن الاستغناء عن يدوياً باستخدام الماصات متعدد القنوات.
  16. بعد 24 ساعة، ينبغي أن يكون بيليه خميرة مرئية في الجزء السفلي من كل بئر يحتوي على الخميرة المحولة بنجاح. لحفظ هذه سلالات الخميرة كمخزون والغليسيرول، إضافة 50 ميليلتر من الجلسرين 50% لكل بئر، دوامة لوحات لمدة 30 ثانية 1,000 لفة في الدقيقة، ختم اللوحات مع ختم الشريط وتجميدها في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: الخطوات المذكورة أعلاه تحتاج إلى تتم مرة واحدة فقط. البدء من مخزونات والغليسيرول العروض المستقبلية لنماذج مختلفة من الخميرة ضد نفس مكتبة كاشف المتاح الخزان والشروع فورا من الخطوات المذكورة أدناه.

3-التزاوج بين الخلايا التي تحتوي على جينات مكتبة والخميرة الاستعلام

  1. لإنعاش سلالات مكتبة من المخزون والغليسيرول، تأخذ لوحات 96-جيدا للخروج من الثلاجة-80 درجة مئوية، إزالة الشريط الختم، وترك الخميرة ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة حوالي 30 دقيقة.
  2. بمجرد قد إذابة الخميرة، استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس بلاستيك عقيمة لتطعيم الأرصدة والغليسيرول إلى 160 ميليلتر الطازجة التي تحتوي على اتفاق جولة أوروغواي-وسائط 2% الجلوكوز في لوحات 96-جيدا واحتضانها لهم عند 30 درجة مئوية ل 24 h. فورا بعد أن يتم استخدام سلالات المكتبة ، ختم اللوحات مع ختم الشريط، وإعادتها إلى الثلاجة-80 درجة مئوية.
  3. في نفس اليوم هي إذابة سلالات مكتبة (W303α)، تطعيم سلالة الخميرة الاستعلام (هنا، فوس في W303a) إلى 50 مل YPD، وأنها تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
  4. في صباح اليوم التالي، صب سلالة الخميرة الاستعلام إلى خزان كاشف المتاح عقيمة، والكوة ميليلتر 160 من سلالة الاستعلام لكل بئر من صفيحة 96-جيدا ماصة متعددة باستخدام.
  5. استخدام موزع السائلة، الاستغناء عن 160 ميليلتر من YPD وسائل الإعلام في كل من عشر لوحات 96-جيدا جيدا. استخدام هذه اللوحات في وقت لاحق للتزاوج سلالة الخميرة الاستعلام مع الخميرة المكتبة.
  6. باختصار دوامة سلالة لوحة 96-كذلك يتضمن سلالة الاستعلام ومن ثم استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس معقم لنقل الاستعلام إلى لوحات YPD.
  7. باختصار دوامة المكتبة سلالة لوحات، وكل لوحة مكتبة السلالة، استخدام وحدة النسخ متماثل 96-دبوس معقم جديدة لنقل سلالات مكتبة إلى لوحات YPD التي قد تم تلقيح مع سلالة الاستعلام.
    ملاحظة: الخلايا في والغليسيرول تفقد صلاحيتها بعد عدة دورات تجميد ذوبان الجليد. العودة سلالات مكتبة للتخزين طويل الأجل (الثلاجة-80 درجة مئوية) أقرب الاحتفاظ المكتبة في ذات نوعية جيدة، وجاهزة للاستخدام في المستقبل. حفظت بشكل صحيح، يمكن تجميد الأسهم والغليسيرول وإذابة 10 مرات على الأقل. نوصي بشدة أيضا حفظ نسخة عمل ونسخ احتياطية من الأسهم والغليسيرول. عندما لا يعمل العامل المخزون، فورا جعل جديدة تعمل نسخة من نسخة احتياطية.
  8. احتضان لوحات YPD عند 30 درجة مئوية ل h. 24 علما أن بيليه خميرة سيكون مرئياً في الجزء السفلي من كل بئر بعد 24 ساعة.
  9. لوحات ملء 96-جيدا مع متوسط تسرب الحد أدنى الذي يحتوي على 2% رافينوسي، المقابلة لعلامات التحديد على بلازميد في سلالة الاستعلام وكذلك على بلازميد المكتبة (مثلاً، هنا أورا-له-).
  10. استخدام النسخ متماثل 96-دبوس عقيمة لنقل الخميرة من YPD التزاوج الثقافات لوسائط الإعلام الانتقائي. احتضان لوحات 96-جيدا عند 30 درجة مئوية عن 48 ساعة؛ الخميرة فقط الخلايا التي قد تزاوج وشكلت مثنوية الخلايا لذلك، تحتوي على كلا بلازميد الاستعلام وبلازميد المكتبة سوف تكون قادرة على النمو في هذه الوسائط. بعد يومين، نلاحظ أن بيليه مرئياً في الجزء السفلي من الآبار.

4-اكتشاف الإنزيم

  1. بعد 48 ساعة نمو في وسائل الإعلام الانتقائي التي تحتوي على رافينوسي، على الفور الخميرة لوحات أجار.
    1. إعداد مجموعات من لوحات أورا-صاحب التسرب تتضمن أجار 2% باستخدام ألواح البوليسترين واضحة وواحدة تحتوي على اللبن 2% والجلوكوز 2% أخرى تحتوي على 2.
    2. لوحات دوامة 96-جيدا لمدة 1 دقيقة 1,000 لفة في الدقيقة، ثم بقعة الخميرة لوحات أورا-صاحب الانقطاع عن الدراسة التي تحتوي على اللبن 2% واجار 2% (هي التي يسببها الجينات فوس ومكتبة) ولوحات أورا-صاحب التسرب الذي يحتوي على الجلوكوز 2% و 2% أجار (الجينات فوس ومكتبة القمع) باستخدام جهاز اكتشاف روبوتية، التي رصدت الثقافة في كل جيدا على لوحات أجار في البيلوروسية (أيالثقافة في 1 كذلك رصدت للبقع 4 على لوحة أجار).
    3. بعد أن شاهد، اسمحوا لوحات أجار الجاف، وثم وضعها في حاضنة 30 درجة مئوية رأسا على عقب. تصوير لوحات أجار كل 24 ساعة لتسجيل نمو أسرع/أكثر خميرة التي أنقذت السمية على سلالة الاستعلام أو تسجل نمواً أبطأ/أقل من الذي يتفاقم السمية على سلالة الاستعلام. احتضان اللوحات لمدة 4 أيام.
      ملاحظة: الثقافة في كل جيدا يمكن رصدها على ألواح أجار 1 إلى 1, كما هو موضح في أسلوب المستندة إلى التحول سابق10. ومع ذلك، 1-إلى-4 شاهد هنا (والتي يمكن وضع مريح حتى باستخدام آلة اكتشاف الروبوتية) يزيد بشكل كبير مدى متانة المقايسة بالحد من العدد إيجابيات كاذبة. وتعتبر الزيارات إيجابية فقط عندما تظهر جميع المستعمرات 4 من نفس جيدا النمط الظاهري مماثلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتين المرتبط بالمرض فوس، الحمض النووي الريبي/DNA بروتين، درست سابقا في الخميرة فرداني7،8. الوراثية الفحص باستخدام الأسلوب القائم على التحول اكتشفت عدة جينات الخميرة التي تقمع سمية فوس. Homolog الإنسان واحدة من جينات الخميرة اتضح فيما بعد أن تكون فعالة في قمع السمية في الخلايا العصبية الأولية ونموذج الفئران من ALS13. هنا، نقوم باستخدام نفس نموذج الخميرة لإظهار أن overexpression مكتبة الفرز يمكن أن يؤديها...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف بروتوكولا لأداء شاشة overexpression بلازميد في استخدام التزاوج لإدخال بلازميد المكتبة في نموذج الخميرة الخميرة. باستخدام هذا النهج، يمكن فحص نماذج متعددة من الخميرة سمية البروتين أمراض الأعصاب باستخدام نفس المجموعة من الخميرة تحول مع مكتبة بلازميد. عملية شاقة للتحول يحتاج فقط إلى إجراء مرة واحدة، وبعد فيه الخميرة ذات كفاءة عالية التزاوج يستخدم لإدخال بلازميد المكتبة في سلالة الاستعلام. يعتمد هذا البروتوكول على استخدام المعدات الآلية الاستغناء عن وسائل الإعلام والثقافات الخميرة بقعة على لوحات أجار. في حين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لمناقشات عميقة مع الأعضاء في جو المختبر ومختبر تشونغ، والدعم المالي من جامعة ولاية رأيت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سمك السلمون المنوية الحمض النووي (SS-DNA)سيجما ألدريتش  ؛ D1626
مرق YPDمنتجات أبحاث الدولية (RPI)Y20090
حبيبات أجارفيشر العلومBP97445
D- (+) - منتجات أبحاث الجلوكوزالدولية (RPI)G32040
D- (+) - منتجات أبحاث Galactoseالدولية (RPI)G33000
D- (+) - منتجات أبحاث خماسي الرافينوز دولي (RPI)R20500
كبريتات الأمونيومفيشر SciA702-500
Ura الاصطناعية - التسرب المتوسطClontech630416
الخميرة الأحماض الأمينية الملحة - هيستيدين / - يوراسيلClontech630422
قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ومنتجات أبحاث كبريتات الأمونيومالدولية (RPI)Y20060
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) فيشرالعلومS67496
أسيتات الليثيوم ، اللامائيفيشر العلومAC268640010
البولي إيثيلين جلايكول 3350 (PEG-3350)الطيف الكيميائي   ؛PO125-12KG
96 دبوس النسخ المتماثل ScinomixSCI-5010-OS
Nunc OmniTrayThermo Sci140156
Corning Costar 96 لوحة فحص البئر ، قاع دائري مع غطاءFisher Sci07-200-760غير معالج ، معقم
Eppendorf   ؛ Research plus Multichannel PipetteEppendorfTI13690052حجم 30-300ul
Fisherbrand  Isotemp الحمامات الجافة الرقمية / سخانات البلوكفيشر العلوم88-860-023
Eppendorf  MixMateEppendorf21-379-00
Eppendorf 5810R أجهزة الطرد المركزيفيشر Sci05-413-112
Avanti J-26 XPI جهاز طرد مركزيBeckman393127
MultiFlo FX متعدد الأوضاع موزعBioTek
Rotor HDA    المغني
آلات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
  2. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  3. Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
  4. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
  5. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
  6. Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
  7. Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052(2011).
  8. Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).
  9. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
  10. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).
  11. Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
  12. Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
  13. Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
  14. Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Yeast MatingPlasmid Library ScreeningFUS ToxicityYeast TransformationGlycerol Stock StorageSelective Medium GrowthRobotic SpottingAgar Plate AssayNeurodegenerative Disease ModelOverexpression Screening

مقالات ذات صلة