مقالة منهجية

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

DOI:

10.3791/58024

⸱

يونيو 29, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت الزرد كالكائنات نموذج الوراثية الموثوقة في البحوث الطبية الحيوية، لا سيما مع ظهور تكنولوجيات تحرير الجينات. عندما تعمل اليرقات المتوقع، تحديد النمط الوراثي واستخراج الحمض النووي يمكن أن يكون تحديا. هنا، نحن تصف إجراء التنميط تتسم بكفاءة لليرقات الزرد، بقطع الذيل، أقرب وقت الإخصاب بعد 72-ح.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد (دانيو rerio) تمتلك أورثولوجويس 84 في المائة من الجينات معروفة مرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الحيوانات يكون وقت جيل قصيرة وسهلة للتعامل معها، وعرض ارتفاع معدل الإنجاب، منخفضة تكلفة، وقابلة بسهولة للتلاعب الجيني ب microinjection من الحمض النووي في الأجنة. وتمكن التقدم الذي أحرز مؤخرا في الجينات أدوات تحرير دقيقة مقدمة للطفرات والمتسلسلات في الزرد. المرض النمذجة في الزرد غالباً ما يؤدي إلى تعمل اليرقات والوفاة المبكرة التي يمكن أن يكون تحديا لتفسير إذا كانت الأنماط الوراثية غير معروفة. هذا التحديد المبكر للأنماط الجينية أيضا المطلوبة في التجارب التي تتطلب تجميع عينة، مثل الجينات التعبير أو كتلة دراسات قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك، يقتصر فحص واسعة النطاق قد بالطرق التقليدية، التي يتم تنفيذها فقط في الزرد الكبار أو في تشريح الجثة اليرقات في معظم مختبرات. لقد عالجت هذه المشكلة بتكييف أسلوب لعزل الحمض النووي جاهزة لبكر من اليرقات الحية الزرد التي يمكن أن يتحقق في أقرب وقت الإخصاب بعد ح 72 (hpf). هذا الوقت وتقنية فعالة من حيث التكلفة، وتحسن من بروتوكول التنميط منشورة سابقا، يتيح تحديد الأنماط الجينية من خزعات زعنفة مجهرية. بسرعة تجديد الزعانف تتطور اليرقات. ثم الباحثين قادرة على تحديد ورفع الوراثية المطلوبة لمرحلة البلوغ باستخدام هذا الفائق إجراء التنميط القائم على بكر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد (دانيو rerio) هو أحد الكائنات الفقارية المستخدمة على نطاق واسع كنموذج للتحقيق المرض، وكذلك فيما يتعلق بالتجارب الإكلينيكية للفرضيات العلاجية1،،من23. هذه الحيوانات يكون وقت جيل قصيرة وسهلة للتعامل معها، وعرض ارتفاع معدل الإنجاب، منخفضة تكلفة، وقابلة بسهولة للتلاعب الجيني ب microinjection من الحمض النووي في الأجنة4. من خلال التطور المتزايد للرواية المعدلة وراثيا والجينات تحرير تكنولوجيات مثل إصبع الزنك nucleases (زفن)5،6،مثل تل المستجيب Nucleases (تالينس)7، و "تجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة" المتناوب ويكرر (كريسبر)/المرتبطة كريسبر 9 (Cas9) نظام8، الزرد تستعد لتحسين فهم عدة شروط مرضية إلى حد كبير. استخدمت هذه التكنولوجيات لإنشاء المستهدفة بالضربة القاضية في على حد سواء جسدية وتعديل الخلايا germline في الزرد، كفاءة توليد وراثيا للحيوانات8. وتشمل الأمثلة الأخيرة في الأدب التنمية الناجحة للنماذج الوراثية للصرع واضطرابات التمثيل الغذائي في الزرد3،،من910،11،12 .

مع التقدم المحرز في تحرير الجينوم الزرد، أصبح التنميط سريعة وموثوق بها خطوة الحد من معدل لا يمكن إنكاره. تحديد محددة طفرات الحمض النووي المجاورة لموقع الهدف توقع تحرير الجينوم مرحلة أساسية من البروتوكول. تقليديا، عادة ما تكون تقنيات التنميط بالقطع زعنفة الزرد المؤداة في الأحداث أو الكبار فقط. إلا أن الوقت الذي يقضيه الزرد رفع إلى سن البلوغ (> 2 أشهر) إلى حد كبير تأخير التقدم في البحوث. في كثير من الحالات، لا يمكن تحقيق مرحلة البلوغ بسبب التقديم من الجينات الأساسية (مثلاً، في نمذجة المرض) أو مكسب للدالة الطفرات تؤدي إلى آثار ضارة المظهرية. وباﻹضافة إلى ذلك، فحوصات عدة تتطلب تجميع اليرقات، مثلما حدث في استخراج الحمض النووي الريبي أو المستقلب، وهكذا تنطوي على تحديد مسبق للأنماط الجينية، التي يمكن أن تكون صعبة عندما تتوفر تقنيات التنميط فقط وظيفة المخصصة . هذه الأمثلة المذكورة أعلاه تبرز أهمية تقنيات التنميط اليرقات وهي في نفس الوقت الدقيق وتمكين الانتعاش الكامل والتطور الطبيعي لليرقات. التنميط الزرد المرحلة المبكرة لا يظهر حاليا لاستخدامها على نطاق واسع؛ ويتجلى هذا المنشورات الأخيرة لنماذج الأمراض الوراثية اليرقات التي حددت عن طريق التنميط الجثة بدلاً من التنميط قبل تنفيذ التجربة12،،من1314. في هذه الورقة، يرد مقطع زعنفة يرقات استراتيجية تهدف إلى تحسين إجراءات التنميط المحددة سابقا.

في الماضي، تعيش استراتيجيات توظيف الهضم بروتيناز ك للنمط الوراثي الزرد اليرقات أدت إلى متغير بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) كفاءة15. على الرغم من أن أكثر مؤخرا بنشر تقنية خزعة ذيل مجهرية قدمت نتائج واعدة أكثر16، نحن ومجموعات أخرى لم تكن قادرة على إنتاج عالية الكفاءة واسترداد الحمض النووي أفاد مقدمو البلاغ. نكسة كبيرة للبروتوكول، المذكورة ويلكنسون et al. يمكن أن يكون 16 نقل الأنسجة الذيل إلى أنبوب PCR. نظراً لحجمها المجهري، من الصعب ضمان أن fin التي تم جمعها بشكل صحيح والاستغناء عن طريق بيبيتينج. ولمعالجة هذا العائق، وضعنا بروتوكولا محسنة للتنميط أعدادا كبيرة من اليرقات الزرد العيش مع ما يقرب من 100 ٪ كفاءة9. استخدام ميكروسكالبيل، إزالة غيض من زعنفة الذيل وتوضع على قطعة من ورق الترشيح. ويمكن تصور سهولة قطعة ورق الترشيح التي تحتوي على الأنسجة ووضعها بشكل صحيح في أنبوب PCR. ثم يتم استخراج الحمض النووي الجينوم، تليها [بكر] تضخيم المنطقة من الفائدة للنمط الوراثي العينة. وتشمل مزايا هذا الأسلوب من كفاءة PCR عالية، وانخفاض معدل إيجابية كاذبة ومعدل وفيات منخفض. بالإضافة إلى ذلك، التنميط عدد كبير من الأجنة من الممكن استخدام هذا البروتوكول. يسمح البروتوكول الخاص الموضحة هنا زعنفة-قطع مئات من اليرقات داخل ح 2-3 باستخدام هذا النهج وتحديد الهوية الصحيحة من الأسماك جينوتيبيد والتجدد الذيل في غضون يومين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إجراءات المواد الحيوانية التي تنطوي عليها، وهي وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المقدمة من المجلس الكندي "رعاية الحيوان" وجامعة أوتاوا لجان الرعاية الحيوانية.

1-إعداد

  1. تحضير السطح التشريح بتسجيل غطاء صحن بيتري 9 سم مع شريط اﻷوتوكﻻف عبر سطحه الداخلية. وضعه تحت مجهر ستيريو.
  2. مكان الإخصاب بعد 3-5 أيام (إدارة الشرطة الاتحادية) الزرد اليرقات في بتري طبق وتخدير في ˜1.5 مم تريكيني في وسائل الإعلام الجنين x E3 1 (كلوريد الصوديوم، 0.17 مم بوكل، 0.33 مم كاكل2، 0.33 مم MgSO4، الرقم الهيدروجيني 7.2 ملم 5).
  3. قطع نهاية طرف ماصة P1000 مع زوج من مقص أو شفرة حلاقة ليبلغ قطرها 2 مم لاستيعاب 3 يرقة إدارة الشرطة الاتحادية مع حد أدنى من الإجهاد.

2-fin القطع يرقات الزرد

  1. التقاط يرقة أنيسثيتيزيد استخدام ميكروبيبيتي P1000 تم التعديل ووضع اليرقة الزرد إلى شريط اﻷوتوكﻻف متوضعة على غطاء طبق بيتري.
  2. إزالة الحل تريكيني الزائدة المحيطة اليرقة استخدام ميكروبيبيتي. يجب أن تكون المنطقة جافة قدر الإمكان للفرع وتلتقط fin بنجاح ولكن لا يزال الرطب لضمان البقاء على قيد الحياة.
  3. استخدام مشرط الصغرى، قسم fin والذيلية تحت مجهر ستيريو كما هو مبين في الشكل 1، كما هو موضح في ويلكنسون وآخرون16. خلال الشق، تنطبق ضغط الهبوطي مطرد داخل الموقع الفجوة الصباغ زعنفة والذيلية، البعيدة لحد دوران الدم (الشكل 1A). تطبيق ضغط لطيف لتجنب إتلاف في نوتوتشورد.
  4. تصور fin مقطعة تحت المجهر ووضع قطعة على رأس غيض من شفرة ميكروسكالبيل (الشكل 2A). ضع ميكروسكالبيل التي تحتوي على زعنفة على سطح قطعة صغيرة من ورق الترشيح.
    ملاحظة: بسبب وجود الخلايا الصباغية في الأنسجة بحف، تسمح هذه الخطوة التصور زعنفة كبقعة سوداء صغيرة (الشكل 2).
  5. باستخدام مقص وملاقط (الشكل 2)، نقل ورقة تصفية تتضمن fin لصفيحة بكر 96-جيدا، وتحتوي على 25 ميكروليتر من حل هيدروكسيد الصوديوم 50 مم كل بئر (الشكل 2D).
  6. إعداد لوحة 96-جيدا مسطحة القاع، ترقيم البئر وفقا للتسمية لصفيحة PCR. بعناية باستخدام ماصة P1000 المعدلة مليئة ميليلتر 200 جديدة وسائط الجنين x E3 1، جمع اليرقة الزرد استخدام ضغط لطيف. الاستغناء عن اليرقة في لوحة زراعة الأنسجة 96، حسنا، بنفس رقم جيدا كلوحة بكر (الشكل 2E).
  7. تأكد من أن أوراق الترشيح هو أيضا غارقة في الحل (الشكل 2 واو). تنظيف بليد ميكروسكابيل وملاقط بين كل قطع لمنع التلوث عبر طريق غمس أنه في حل EtOH 70%. مسح الشفرة مع الأنسجة/مسح ورقة نظيفة.
  8. كرر الخطوات من 2.1-2.7 حتى قد تم قص جميع الأجنة.
  9. تخزين اليرقات في لوحة 96-جيدا عند 28 درجة مئوية حتى قد حددت الأنماط الجينية.
    ملاحظة: وسائط الإعلام الجنين لا تحتاج إلى تغيير، حيث يمكن إكمال البروتوكول بسهولة في أقل من يومين. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الوقت، يوصي بتغيير وسائط.

3. استخراج الحمض النووي الجينوم

  1. ختم بلوحة بكر 96-جيدا والعينات في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة للتأكد من أن جميع أوراق التصفية مغمورة ضمن الحل هيدروكسيد الصوديوم للطرد المركزي.
  2. لتحلل الأنسجة، الحرارة العينات في ثيرموسيكلير عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق متبوعاً بالتبريد إلى 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. إضافة ميكروليتر 6 500 مم تريس-HCl، pH 8.0 لكل عينة. دوامة.
  4. الطرد المركزي باختصار اللوحة في 1,500 س ز، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. استخدام 1.5 ميكروليتر من المادة طافية الحمض النووي كل تفاعل PCR.
  6. إعداد بكر للنمط الوراثي اليرقات، كما هو مبين في الجدول 1-2.
    ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول لاثنين من التطبيقات: متعدد PCR ردود فعل الكشف عن النمط الوراثي باستخدام المواد الهلامية [اغروس]9، وهيتيرودوبليكس ذوبان المقايسة (HMA) الكشف عن الأنماط الجينية باستخدام هلام polyacrylamide التفريد (صفحة)17.

4-البديل استخراج الجينوم استخدام راتنج شيلاتينغ

  1. إكمال الخطوة 2، 5 عن طريق إضافة ورق الترشيح مع fin قص لوح بكر 96، حسنا، تتضمن ميكروليتر 30% 5 خالب الراتنج (كوبوليمر الستيرين-ديفينيلبينزيني التي تحتوي على أيونات إيمينودياسيتاتي المزدوجة).
    ملاحظة: يستخدم هذا النوع من الراتنج عادة لتحلل الأنسجة والتحضير للحمض النووي جاهزة لبكر في طريقة سريعة وفعالة18.
  2. اتبع الخطوات 2.6-2.8 كما هو مبين.
  3. إغلاق لوحة بكر 96-جيدا وإيجاز الطرد المركزي العينات للتأكد من أن كل عامل تصفية الورق هو مغمورة داخل الراتنج شيلاتينغ.
  4. لتحلل الأنسجة، الحرارة العينات في ثيرموسيكلير عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها التبريد إلى 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: هذه الخطوة يسمح تحلل والربط اللاحقة من حبات راتنج القطبية للمكونات الخلوية بينما تظل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في الحل.
  5. باختصار الطرد المركزي العينات لبيليه الراتنج الخرز والحصول على الحمض النووي في التعليق.
  6. اتبع الخطوات 3.5-3.6 لإكمال الإجراء التنميط.

5-تطبيق 1: متعدد PCR متبوعاً بتحليل [اغروس] هلام

  1. اتباع الجدول 1، إعداد فعل PCR متعدد لتمكين بالتمييز بين طفرات متماثل، heterozygotes ووزن اليرقات. استخدام cycler حرارية 96-جيدا للقيام بردود فعل PCR استخدام الدراجات الشروط الموضحة في الجدول 3.
    ملاحظة: ردود فعل PCR يمكن أيضا إجراء في أي الأخرى التقليدية بكر الحراري cycler. يصف هذا المثال بكر الاستراتيجية المستخدمة من قبل بينا, et al. 9 تحديد aldh7a1 WT والإدراج 5-بي بي الآليلات متحولة في نفس رد الفعل متعدد.
  2. تعد من 1% [اغروس] هلام في المخزن المؤقت بورات الصوديوم، ملطخة 1 x GelRed.
    ملاحظة: يتكون من 40 مل من 10 M هيدروكسيد الصوديوم، 1800 مل ddH2س، 20 x المخزون الاحتياطي بورات الصوديوم الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 8.5 مع 76 غ من الماء المقطر وثم الانتهاء إلى الحجم النهائي ل 2 استخدام سين ddH2
  3. تشغيل الهلام في 1 x بورات الصوديوم العازلة لمدة 15 دقيقة على 250 الخامس. ولتيسير هذه العملية، إذا كان ذلك ممكناً، استخدام نظام جل متوافق مع بيبيتس متعددة القنوات لتمكين قدرات إنتاجية عالية بتقليل وقت تحميل عينات.
  4. صورة الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) للسماح بالتمييز من الأنماط الجينية المختلفة.

6-تطبيق 2: هيتيرودوبليكس ذوبان الإنزيم

  1. إعداد صفحة 12% الجل باستخدام لوحة مباعدة 1.5 مم وأمشاط 15-عينات. إعداد اثنين الجل الصفحة استخدام مل 12.21 ddH2س، 2.52 مل 10 × تريس/بورات/يدتا (TBE)، 10 مل من الاكريلاميد 30 ٪، 250 ميكروليتر من فوق كبريتات الأمونيوم 10% (الجزائرية) و 20 ميكروليتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد). استخدام المخزن المؤقت x TBE 1 (0.089 م تريس-HCl، م 0.089 الماء المقطر وحامض الإيثيلين 0.002 M (يدتا)) كتشغيل المخزن المؤقت.
  2. الحرارة منتجات PCR في 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. تبريد الأنابيب على الجليد أو في ثيرموسيكلير لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. تحميل 10 ميكروليتر كل عينة PCR و 8 ميكروليتر علامة الوزن الجزيئي.
  5. قم بتشغيل الصفحة 150 الخامس في 1 x TBE استخدام نظام التفريد رأسي ح 1 أو حتى علامة الوزن الجزيئي تقريبا تصل إلى خط سيرا على الأقدام لصفيحة الزجاج.
  6. صورة الجل تحت الأشعة فوق البنفسجية للسماح بالتمييز من الأنماط الجينية المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنميط وكفاءة بروتوكول تجلى ذرية الصليب متخالف (aldh7a1+ ot100، يظهر هنا ك aldh7a1+/--) (الشكل 3 ألف-ج)9. اليل متحولة aldh7a1ot100له إدراج زوج 5-قاعدة (bp) في إكسون الترميز الأول من الجينات aldh7a1 الزرد التي تؤدي إلى فراميشيفت وفقدان لوظيفة نتيجة مبكرة كودون وقف9. واستخدمت كبسولة تفجير أربعة في رد فعل متعدد ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجينات قد استخدمت أدوات التحرير التحديد استحداث الطفرات والمتسلسلات في الزرد على مدى سنوات5،6،،من78. تعمل اليرقات أو الأحداث المبكرة عند أداء مرض النمذجة في الزرد، كثيرا ما يلاحظ9،12،،من1314. ويصف البروتوكول المعروضة هنا استخراج الحمض النووي جاهزة لبكر من خزعات الذيل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف يود أن يشكر نماذج الأمراض النادرة والشبكة الآلية (ردمم) (تموله المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا) وكندا الجينوم). كورونا تشيكية معتمد من قبل على جائزة منحة أوروب (جامعة أوتاوا). دلج تدعمه "منحة Vanier كندا العليا". ويدعم الأكاديميات بمنح زمالات ما بعد الدكتوراه في معاهد كندية لبحوث صحية (استوفوا). يشكر المؤلفون في "علم الوراثة الجمعية الأمريكية" لمنح الإذن لنشر هذا البروتوكول واستخدام لتكيف من 5 الرقم الإضافي من بينا، وآخرون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتريكورنينج430167
مشرطالعالم أدوات الدقة500249
مجهر مجسمنيكونSMZ1500
تريكايين / إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفوناتسيجما ألدريتشE10521
96 بئر لوحة زراعة الأنسجةكوستار3595
96 بئر PCR لوحةفيشر14230232
NaOHفيشرS25548A 
قاعدة تريس سيجما ألدريتشT1503
كلوريد الصوديومفيشرBP358-10
KClسيجما ألدريتشP3911
MgSO4سيجما ألدريتش230391
5٪ Chelex 100 شكل الصوديومSigma-AldrichC7901
Gel Red 1xBiotium41003
حمض البوريكSigma-AldrichB6768
الخلية الفرعية 192 نظامBio-Rad & nbsp ؛1704508
30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1Bio-Rad   ؛1610158
GoTaq Green Master Mix ، 2XPromegaM7123
مناديل ورقية (Kimwipes & reg ؛ مساحات يمكن التخلص منها)Sigma-AldrichZ188956
الوزن molecylar 1kb Thermo ScientificSM1343
مياه خالية من النوكليز نظام Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 (نظام هلام الاغاروز عالي الإنتاجية)Bio-Rad & nbsp ؛1704508
نظام الرحلان الكهربائي للهلام العمودي Mini-PROTEAN Tetra Cell  Bio-Rad 1658004
نموذج علامة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  2. Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
  3. Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
  4. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115(2009).
  5. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  6. Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  7. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
  8. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  9. Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
  10. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410(2013).
  11. Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
  12. Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
  13. Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
  14. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
  15. Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
  16. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  17. Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420(2014).
  18. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
  19. Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة