Method Article

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

DOI:

10.3791/58089

⸱

November 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول الهندسة الوراثية عابر لطب الأسنان من الخلايا الجذعية المستخرجة من المسام الأسنان البشرية. الاستراتيجية التطبيقية التعديل غير الفيروسية التي قد تصبح أساسا لتحسين منتجات الخلايا الجذعية العلاجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحتى الآن، العديد من أنواع الخلايا الجذعية في مراحل إنمائية مختلفة في التركيز على علاج الأمراض التنكسية. حتى الآن، جوانب معينة، مثل موت الخلية الأولى واسعة النطاق والآثار العلاجية منخفضة، ضعف الترجمة السريرية واسعة النطاق. الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية قبل زرع برزت كوسيلة واعدة لتحسين الآثار العلاجية من الخلايا الجذعية. ومع ذلك، تزال تفتقر إلى نظم إيصال الجينات آمنة وفعالة. ولذلك، تطوير أساليب مناسبة قد توفر نهجاً لحل التحديات الراهنة في العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية.

يصف هذا البروتوكول استخراج وتوصيف الخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان (هدفسكس) كذلك على التحوير الوراثي غير الفيروسية. كشف النقاب عن المسام الأسنان بعد الولادة كمصدر واعدة ويمكن الوصول إليها بسهولة لحصاد الخلايا الجذعية البالغة multipotent تمتلك إمكانات عالية الانتشار. ويعرض إجراءات العزل وصف طريقة بسيطة وموثوق بها لحصاد هدفسكس من تأثير ضرس العقل. ويضم هذا البروتوكول أيضا أساليب لتحديد خصائص الخلايا الجذعية الخلايا المعزولة. للهندسة الوراثية من هدفسكس، يرد استراتيجية أمثل تعداء الأيوني على أساس المادة الدهنية مواتية ميكرورنا ذات كفاءة عالية مقدمة دون أن تسبب الآثار السامة للخلايا. ميكرورناس هي المرشحين المناسبين للتلاعب بالخلية عابرة، هذه الجهات المنظمة متعدية الجنسيات الصغيرة التحكم في مصير وسلوك الخلايا الجذعية دون خطر التكامل الجينوم مستقرة. وهكذا، يمثل هذا البروتوكول إجراء آمنة وتتسم بالكفاءة لهندسة هدفسكس التي يمكن أن تصبح مهمة لتحسين فعاليتها العلاجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جريب الأسنان البشرية فضفاضة المستمدة من اكتوميسينتشيمالي نسيج الضام المحيطة بالأسنان النامية1،2. إلى جانب وظيفتها تنسيق أوستيوكلاستوجينيسيس وتكون العظم لعملية اندلاع الأسنان، يأوي هذا النسيج الخلايا الجذعية، والسلف لا سيما لوضع دواعم3،،من45. ولذلك، يعتبر المسام الأسنان كمصدر بديل لحصاد الخلايا الجذعية البشرية6،7.

وأظهرت دراسات عدة أن الخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان (هدفسكس) قادرون على التفريق في نسب اللثة بما في ذلك خلايا الاوستيوبلاستس، الرباط الليفية وسيمينتوبلاستس8،،من910 . وعلاوة على ذلك، عرضت هذه الخلايا تطابق خصائص كافة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) بما في ذلك القدرات الذاتية تجديد، التقيد البلاستيك، والتعبير عن علامات سطح معين (مثل، CD73، CD90، CD105) كذلك، أوستيوجينيك، أديبوجينيك وتشوندروجينيك التمايز المحتملة11،،من1213. وكشفت دراسات أخرى أيضا إمكانية تفريق العصبية هدفسكس2،،من1415،16،،من1718.

نظراً لخصائص واعدة وسهولة الوصول، أصبح هدفسكس ذات الصلة مؤخرا للأنسجة الهندسة19،،من2021. الدراسات الأولى التي ركزت على إمكانات دفسكس لتجديد العظام واللثة وجذور الأسنان19،،من2223،24،،من2526، ،من 2728،،من2930. معرفة قدرة هدفسكس العصبية، تطبيقها كعلاج محتمل لأمراض الأعصاب منذ التحقيق31،،من3233. هدفسكس اكتسبت أيضا أهمية فيما يتعلق بتجديد أخرى34،الأنسجة (ظهارة القرنيةمثلاً )35. إمكانات العلاج هدفسك لا يقوم فقط على إمكاناتهم التمايز المباشر بل أيضا على نشاطهم باراكريني. مؤخرا، أظهرت أن تفرز ثروة عوامل النشطة بيولوجيا، مثل مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) وعامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (بفجف) ويشبه الأنسولين عامل النمو (IGF) النمو تتمثل هدفسكس عامل (هجف)، التي تقوم بدور حاسم للأوعية والمرباة وإعادة عرض مصفوفة الخلوية إضافية وعمليات الترميمي36.

ومع ذلك، تأثر الترجمة السريرية واسعة النطاق للعلاج بالخلايا الجذعية لا تزال العديد من التحديات، مثل موت الخلايا الأولية الضخمة وانخفاض الخلايا الجذعية مفيدة آثار37،38. الهندسة الوراثية يوفر استراتيجية واعدة للتصدي لهذه التحديات وذلك يمكن أن يعزز الفعالية العلاجية للخلايا الجذعية البالغة38،،من3940. للتلاعب بالخلية عابرة، ميكرورناس (ميرس) مرشحين مناسبين، كما هذه الجهات المنظمة متعدية الجنسيات الصغيرة التحكم في مصير وسلوك الخلايا الجذعية دون الخطر من الجينوم مستقرة التكامل41،42، 43-وحتى الآن، حددت عدة ميرس مفيدة تعزيز انتشار الخلايا الجذعية والبقاء على قيد الحياة، وصاروخ موجه، نشاط paracrine، فضلا عن على التمايز إلى عدة الأنساب44. على سبيل المثال، المهندسة مير-133a MSCs أظهرت زيادة البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت في قلوب الفئران إينفاركتيد أدى تحسين وظيفة القلب عند مقارنة بغير معدلة MSCs45. وبالمثل، عرضت مير-146a overexpressing MSCs لإفراز كميات أعلى من VEGF الذي أدى بدوره إلى تعزيز كفاءة علاجية في الأنسجة الدماغية46.

ويعرض هذه المخطوطة بروتوكول مفصل لاستخراج انتقائية والهندسة الوراثية من هدفسكس. ولهذا الغرض، وصفت لنا هضم الحصاد والانزيميه تجاويف الأسنان البشرية وكذلك عزل هدفسكس اللاحقة. لوصف الخلايا المعزولة، وتعليمات هامة لتحقق خصائص ماجستير قد أدرجت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها "الجمعية الدولية" "العلاج الخلوي"13. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للجيل من تعديل مير هدفسكس بتطبيق استراتيجية الأيوني تعداء على أساس المادة الدهنية وتقييم كفاءة تعداء وسيتوتوكسيسيتي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هدفسكس يتم عزل من المسام الأسنان لاستخراج الحكمة الأسنان المقدمة من الإدارة عن طريق الفم والوجه والفكين جراحة التجميل في المركز الطبي في جامعة روستوك. تم الحصول على الموافقة عن علم وموافقة كتابية من جميع المرضى. إذن هذه الدراسة لجنة الأخلاقيات المحلية التابعة لجامعة روستوك (إذن برقم 2017-0158).

1-عزل هدفسكس

ملاحظة: لمنع التلوث البكتيري، ضرس العقل ينبغي أن لا تكون اندلعت قبل استخراج

  1. إعداد الحلول المطلوبة
    1. تحضير المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS)/البنسلين والستربتوميسين-الجلوتامين (P-S-G) الحل: مزيج مل 495 من برنامج تلفزيوني مع 5 مل من محلول P-S-G. تخزين مختبرين من 50 مل عند 4 درجة مئوية.
    2. إعداد متوسطة الثقافة هدفسك: مزيج مل 445 من متوسطة القاعدية مع 5 مل من عامل المضادات الحيوية و 50 مل من المصل البقري الجنين (FBS). مخزن في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد نوع كولاجيناز أنا الأسهم الحل (30 ملغ/مل): تمييع 300 ملغ نوع كولاجيناز في 10 مل متوسطة القاعدية وتستكمل مع عامل مضاد حيوي 1%. مزيج من قوة الحل. تصفية الحل باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون. مخزن مختبرين من 500 ميليلتر من كولاجيناز النوع الأول من الحل الأسهم عند-20 درجة مئوية.
    4. إعداد الحل "الثاني ديسباسي" الأسهم (40 مغ/مل): تمييع 40 مغ من "ديسباسي الثاني" في 10 مل متوسطة القاعدية وتستكمل مع عامل مضاد حيوي 1%. مزيج من قوة الحل. تصفية الحل باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون. تخزين مختبرين من 500 ميليلتر للحل "الثاني ديسباسي" الأسهم في-20 درجة مئوية.
  2. إجراء العمليات الجراحية
    1. ضخ كمية كافية (الحد الأقصى: 2 مل) من مخدر موضعي.
    2. إنشاء ورفع رفرف ثلاثي موكوبيريوستيل. رفع رفرف لغات غير مطلوب.
    3. حماية الجانب المتعلق باللغات بمصعد بيريوستيل.
    4. مطحنة بلطف العظام الشدقى والقاصي مع جولة لدغ معادن الصلبة.
    5. قم بفك أنسجة المسام بمصعد بيريوستيل. بعناية إزالة الأسنان كاملة (الجرثومية) والمسام بسحب التاج (والمسام) مع الخلفي (الثالثة-المولى) الملقط.
    6. ديبريدي وري مأخذ التوصيل جيدا مع محلول كلوريد الصوديوم.
    7. استبدال رفرف موكوبيريوستيل بخيوط فيكريل (انظر الجدول للمواد).
    8. إزالة المسام الأسنان من تجويف الفم ووضعها في قاسمة من 50 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G.
      ملاحظة: ويمكن تخزين العينة في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  3. الهضم الأنزيمي للمسام الأسنان
    1. هدفسك الحارة قبل الثقافة المتوسطة وحل برنامج تلفزيوني/P-S-G إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. ذوبان الجليد قاسمة واحد لكل نوع من أنواع كولاجيناز الأول و "الثاني ديسباسي" الأسهم الحلول. تعد حلاً هضم من 3 ملغ/مل نوع كولاجيناز أنا و 4 مغ/مل ديسباسي الثاني بإضافة 500 ميليلتر من كل كولاجيناز النوع الأول و "الثاني ديسباسي" حل الأسهم إلى 4 مل من القاعدية المتوسطة التي تحتوي على 1% المضادات الحيوية عامل.
    3. مكان جريب المستخرجة في طبق بتري معقم وإضافة 10 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G لغسل الأنسجة المستخرجة. كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
    4. فرم المسام المستخرجة إلى قطعة من حوالي 1 مم × 1 مم مع مشرط معقم داخل طبق بتري يحتوي على 10 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G.
    5. نقل الأنسجة مفروم وحل برنامج تلفزيوني/P-S-G من طبق بيتري في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. أغسل صحن بيتري مع 10 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G ونقل الحل في الأنبوب نفسه.
    6. الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 353 س ز على RT وتجاهل المادة طافية.
    7. إضافة 5 مل من محلول الهضم للأنسجة الأعلاف. المزيج بلطف الحل والأنسجة. احتضان المخلوط في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 2 ح في حاضنة تهتز.
    8. أجهزة الطرد المركزي يهضم تعليق خلية/الأنسجة في 353 x ز لمدة 10 دقائق في الرايت تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه التي تم الحصول عليها في 6 مل من هدفسك الثقافة المتوسطة.
    9. تعليق خلية البذور في 25 سم2 خلية قارورة الثقافة واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2% 20 س2.
      ملاحظة: إذا لم يتم هضمها الأنسجة تماما، نقل الأنسجة المتبقية إلى قارورة ثقافة الخليوي أيضا.
    10. تغيير المتوسطة بعناية ح 24 بعد البذر الخلية. بعد ذلك تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام حتى كونفلوينسي.
      ملاحظة: هدفسكس ينبغي أن البلاستيك-تمسكا 24 ساعة بعد البذر الخلية ولا يمكن فصلها عن الخلايا غير ملتصقة ومكونات الدم بمجرد تغيير في المتوسط.
  4. حصاد الخلية
    1. قبل الحارة هدفسك الثقافة المتوسطة، حل برنامج تلفزيوني/P-S-G وحل حمض (يدتا) التربسين/الإيثيلين إلى الرايت
    2. تجاهل المادة طافية من قارورة الثقافة ويغسل خلايا المتلاقية مع 5 مل من محلول برنامج تلفزيوني/P-S-G.
    3. أضف 1 مل من محلول التربسين/أدتا إلى قارورة الثقافة واحتضان لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية. إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 3 مل من هدفسك الثقافة المتوسطة إلى قارورة الثقافة.
    4. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل والطرد المركزي من تعليق لمدة 10 دقيقة في 353 x ز في الرايت تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه بمبلغ مناسب لمتوسط الثقافة هدفسك.
    5. حساب عدد الخلايا: مزيج 10 ميليلتر من تعليق خلية بلطف مع 10 ميليلتر لحل تريبان الأزرق. تطبيق 10 ميليلتر في غرفة الفرز وحساب مقدار خلية هدفسك.

2-وصف هدفسكس

  1. إيمونوفينوتيبينج
    1. إعداد الخلايا لتحليل تدفق سيتوميتريك
      1. إعداد الحلول المطلوبة
        1. إعداد برنامج تلفزيوني/يدتا (2 مم): مزيج مل 996 من برنامج تلفزيوني مع 4 مل يدتا (0.5 م).
        2. إعداد المخزن المؤقت المصبوغة: مزيج مل 995 من برنامج تلفزيوني/يدتا (2 مم) مع 5 غ من جيش صرب البوسنة. تصفية الحل باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
        3. إعداد حل الأسهم بارافورمالدهيد (PFA) (4%): تمييع ز 4 منهاج عمل بيجين في 100 مل من برنامج تلفزيوني والحرارة الحل إلى 80 درجة مئوية. مزيج الحل وضبط قيمة pH إلى 7.3. قاسمة الحصول على حل منهاج عمل بيجين في مخزن في-20 درجة مئوية ومبلغ كل منها (1.5 مل) حتى الاستخدام.
          تنبيه: نظراً لمنهاج عمل بيجين الأبخرة السامة، إعداد الحل منهاج عمل بيجين في غطاء دخان التهوية.
      2. بعد خلية الحصاد (1.4)، نقل عينات 14 من 5 × 104 خلايا إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب. الطرد المركزي من التعليق في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
        ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك. الحفاظ على الخلايا والمواد الكاشفة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
      3. تعليق إعادة الخلايا بكميات معينة من المخزن المؤقت المصبوغة (4 درجة مئوية) وإضافة FcR حجب كاشف (4 درجة مئوية) كما هو مبين في الجدول 1.
      4. إضافة الأضداد التالية على الجانب الداخلي من العينة الخاصة بكل منها كما هو مبين في الجدول 1: اللوفيكوسيانين (APC) الماوس المضادة الإنسان CD29؛ آسيا والمحيط الهادئ الماوس IgG1 κ ايستب التحكم؛ بيريدينين--الكلوروفيل البروتين (بيركب)-Cyanine5.5 الماوس المضادة الإنسان CD44؛ الماوس Cyanine5.5 بيركب IgG2b κ ايستب التحكم؛ V500 الماوس المضادة الإنسان CD45؛ ماوس V500 IgG1 κ ايستب التحكم؛ ماوس فيكوريثرين (PE) المضادة الإنسان CD73؛ PE الماوس IgG1 κ ايستب التحكم؛ بيركب-Cyanine5.5 الماوس المضادة الإنسان CD90؛ الماوس Cyanine5.5 بيركب IgG1 κ ايستب التحكم؛ ماوس CD105 المضادة الإنسان: أليكسا فلور (AF) 488؛ فأرة التحكم IgG1 السلبية: AF488؛ PE Cyanine7 الماوس المضادة الإنسان CD117؛ ماوس PE-Cyanine7 IgG1، κ ايستب التحكم. بعد أن تم إضافة الأجسام المضادة لكل عينة، تدور أسفل الأجسام المضادة وتخلط برفق. تبني الحلول لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      5. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) والطرد المركزي العينات من 300 غرام x لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
      6. تعليق إعادة الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) وإضافة 33 ميليلتر من منهاج عمل بيجين (4 في المائة). مزيج من الحلول وتخزينها على الجليد أو عند 4 درجة مئوية حتى تحليل تدفق سيتوميتريك.
    2. قياس التدفق سيتوميتريك للخلايا
      ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك. تبقى الخلايا على الجليد حتى القياس.
      1. للنظر في التعبير عن المستضدات السطحية، نقل العينات في أنابيب مناسبة لتدفق سيتوميتريك القياسات.
      2. قياس أحداث4 على الأقل 2 x 10 باستخدام سيتوميتير تدفق. تحليل كما هو مبين في الشكل 2.
  2. إمكانية التفريق مولتيبوتينت من هدفسكس
    1. استخدام المتاحة تجارياً "البشرية Mesenchymal الخلايا الجذعية الوظيفية تحديد مجموعة" للتأكد من أديبوجينيك، أوستيوجينيك، وإمكانات المفاضلة تشوندروجينيك من هدفسكس. تطبيق حمار الماعز المضادة AF488 جسم الثانوية لتلطيخ من الأحماض الدهنية ملزمة البروتين 4 (FABP4) وأجريكان فضلا عن حمار الماوس المضادة AF488 جسم الثانوية لتلطيخ من أوستيوكالسين. لتلطيخ نويات، استخدام الوسيلة المتصاعدة مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI).
      ملاحظة: إعداد عينات دون جسم الأولية كعناصر سلبية لتحاليل مجهرية.
    2. تحليل التعبير عن البروتينات بالليزر الفحص المجهري [كنفوكل]. إعدادات الفحص المجهري: الهدف 40 x مع الغمر النفط؛ الإثارة الليزر 488 نانومتر (بالنسبة AF488) و 405 نانومتر (ل DAPI).

3-تعداء هدفسكس

  1. وبعد الحصاد (1.4) الخلية، البذور هدفسكس على لوحة ثقافة 24-جيدا خلية 24 ساعة قبل تعداء.
    ملاحظة: ابتداء من كثافة الخلية حوالي 4 × 104 خلايا كل بئر. الخلايا ينبغي التوصل إلى التقاء ~ 80% في يوم تعداء.
    ملاحظة: البذور عينة خلية إضافية واحدة كمراقبة لتحليل تدفق سيتوميتريك.
  2. إعداد مجمعات تعداء
    ملاحظة: لمنع التلوث الناجم عن رنسيس، تنظيف مساحة العمل مباشرة قبل إعداد مجمعات تعداء استخدام رناسي إزالة التلوث الحل. استخدام مواد خالية من رناسي والحلول فقط.
    ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك.
    1. إعداد حل الأسهم مير (50 ميكرومتر): إعادة تعليق مير السلائف المسمى Cy3 (نمول 5) في المياه خالية من نوكلاس 100 ميليلتر. قاسمة الحصول على الحل مير الأسهم في كل منها مبالغ (5 ميليلتر) ومخزن في الظلام في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. تمييع pmol 40 من مير (0.8 ميليلتر من الحل الأسهم مير 50 ميكرومتر) في 66.7 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط. مزيج الحل بلطف
    3. تمييع 0.67 ميليلتر من الكاشف الأيوني تعداء على أساس المادة الدهنية في 66.7 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط. مزيج الحل بلطف واحتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
    4. بعد الحضانة، إضافة الكاشف تعداء المخفف مسبقاً إلى مير قبل المخفف. مزيج الحل بلطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
  3. إضافة مجمعات تعداء استعداد dropwise مباشرة إلى متوسط الثقافة في الخلايا. المزيج بلطف هزاز لوحة الثقافة خلية 24-جيدا ذهابا وإيابا.
  4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 20% س2 ل 24 ساعة.

4-تحليل تعداء

ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك.

  1. خلية الحصاد بعد تعداء
    ملاحظة: جمع كافة الحلول الخلية من عينة واحدة في أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل نفس.
    1. 24 ساعة بعد تعداء، جمع المادة طافية العينات في أنابيب الطرد المركزي الخاصة بكل منها.
    2. تغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد المركزي الخاصة بكل منها وإضافة 500 ميليلتر التربسين/يدتا (RT) إلى الخلايا. احتضان حلول 3 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. وقف تريبسينيزيشن بإضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة (RT) إلى الخلايا ونقل الحل في أنبوب الطرد المركزي الخاصة بكل منها. خلايا أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: من هذا الوقت، تبقى الخلايا والمواد الكاشفة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
  2. إعداد الخلايا لتحليل تدفق سيتوميتريك
    1. تجاهل المادة طافية. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميليلتر المصبوغة المخزن المؤقت (4 درجة مئوية) ونقل الخلية حل لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    2. إضافة 0.5 ميليلتر لصبغ رد الفعل أمين للعينات من أجل التمييز بين الخلايا الحية والميتة. مزيج الحل بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) إلى الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    4. تعليق إعادة الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) وإضافة 33 ميليلتر من منهاج عمل بيجين (4 في المائة). مزيج من الحلول وتخزينها على الجليد أو عند 4 درجة مئوية حتى تحليل تدفق سيتوميتريك.
  3. قياس التدفق سيتوميتريك للخلايا
    ملاحظة: أداء العمل التالية في غرفة مظللة بدلاً من ذلك. تبقى الخلايا على الجليد حتى القياس.
    1. نقل العينات إلى أنابيب مناسبة لتدفق سيتوميتريك القياسات.
    2. دراسة جدوى الخلية وكفاءة امتصاص مير cytometer تدفق استخدام. قياس على الأقل 2 x 104 الأحداث. استخدام استراتيجية النابضة هو مبين في الشكل 4.
      ملاحظة: استخدام خلايا أونترانسفيكتيد كمراقبة سلبية على ترتيب النابضة للخلايا Cy3 الإيجابية وعلى حساب موت الخلية الناجمة عن تعداء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، تعليمة عزلة مفصلة لحصاد هدفسكس من الأنسجة البشرية جريب طب الأسنان. نظراً لسهولة الوصول للمسام الأسنان أثناء الجراحة الروتينية، أنها مصدرا واعداً لاستخراج الخلايا الجذعية البالغة.

هدفسكس معزولة وأظهرت جميع الخصائص الموصوفة لتعريف MSCs13. في الواقع، كانت خلايا بلاستيكية ملتصقة تحت وصف ظروف الثقافة وعرضها مورفولوجيا تشبه تنتجها الخلايا الليفية (الشكل 1). وكشف تحليل تدف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية البالغة حاليا في التركيز لمعالجة العديد من الأمراض التنكسية. على وجه الخصوص، العظام نخاع (بي أم)-المستمدة من الخلايا الجذعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) و MSCs، قيد التحقيق السريرية مكثف47. ومع ذلك، حصاد BM هو إجراء جائر تسبب الألم في موقع التبرع وقد تؤدي إلى الأحداث الضائرة48. في الآونة الأخيرة، برز أنسجة الأسنان بعد الولادة كالرواية والوصول إليها بسهولة من مصدر للخلايا الجذعية. سيظهر لتلبية جميع MSC خصائص هذه الخلايا الجذعية طب الأسنان ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل "البرنامج فورون المركز الطبي الجامعي روستوك" (889018) ومؤسسة رطبة (2016-11). وبالإضافة إلى ذلك، بعد الظهر، والثالثة التي يدعمها الفدرالية (كبار الشخصيات + 00240).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الفأر المضاد للجسم المضاد للإنسان CD105: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488Clone SN6 ، الماوس أحادي النسيلة
IgG1 الجسم المضاد للتحكم السلبي: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA928A488أحادي
النسيلة APC Mouse Anti-Human CD29 الأجسام المضادةBD Biosciences559883استنساخ MAR4 ، ماوس APC أحادي النسيلة
IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابه الأجسام المضادةBD Biosciences555751استنساخ MOPC-21 ، أحادي النسيلة
PE Mouse Anti-Human CD73 الأجسام المضادةBD Biosciences550257استنساخ AD2 ، ماوس PE أحادي النسيلة
IgG1 ، & kappa ؛ الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتشابهBD Biosciences555749استنساخ MOPC-21 ، أحادي النسيلة
PE-Cy7 الفأر المضاد للإنسان CD117 الأجسام المضادةBD Biosciences339217استنساخ 104D2 ،
ماوس أحادي النسيلة PE-Cy7 IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابه الأجسام المضادةBD Biosciences557872استنساخ MOPC-21 ، أحادي النسيلة
PerCP-Cy5.5 الفأر المضاد للإنسان CD44 الأجسام المضادةBD Biosciences560531استنساخ G44-26 ، أحادي النسيلة
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b ، & kappa ؛ الأجسام المضادة للتحكم في النمطالمتماثل BD Biosciences558304استنساخ 27-35 ، أحادي النسيلة
PerCP-Cy5.5 ماوس مضاد للإنسان CD90   ؛ الأجسام المضادةBD Biosciences561557استنساخ 5E10 ، ماوس أحادي النسيلة
PerCP-Cy5.5 IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابه الأجسام المضادةBD Biosciences55095استنساخ MOPC-21 ، أحادي النسيلة
V500 الفأر المضاد للإنسان CD45 الأجسام المضادةBD Biosciences560777استنساخ HI30 ، أحادي
V500 Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشاوي الأجسام المضادةBD Biosciences560787استنساخ X40 ، كاشف حجب FcR أحادي النسيلة
،Miltenyi Biotecالبشري 130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200.5M ، درجة الحموضة 8.0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE0.22 & micro ؛ م ، معقم بالإشعاع ، بولي إيثر سلفون
BSASigma-AldrichA7906
PFAMerck Millipore1040051000
مجموعة أدوات تحديد الخلايا الجذعية الوسيطة البشريةR& D SystemsSC006
RNase حل إزالة التلوث ؛ حل إزالة التلوث RNaseZap RNaseThermo Fisher ScientificAM9780
Cy3-labeled presuffor miR ؛ Cy3 Dye-Label Pre-miR التحكم السلبي # 1Thermo Fisher ScientificAM171205 نانومول
Pre-miR miRNA Precursor Precursor Negative Control # 1Thermo Fisher ScientificAM171105 nmol
كاشف تعداء قائم على الدهون الموجبة ؛ ليبوفيكتامين 2000 كاشف التعداءالحراري فيشر العلمي11668019
وسط مصل مخفض. Opti-MEM I Reduced SerumMedium Thermo Fisher Scientific31985070
الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055متعدد النسيلة
المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتص للغاية ، Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202
متعدد النسيلة التركيب الوسيط ؛ Fluoroshield مع DAPISigma-AldrichF6057-20MLالأنسجة المتوسطة
ELYRA PS.1 LSM 780 مجهر متحد البؤرZeiss
BD FACS LSRII مقياس التدفق الخلويBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
ZEN2011 SoftwareZeiss
Trypsin / EDTA (0.05٪ / 0.02٪) BiochromL2143في PBS ، بدون / س: Ca < sup>2 + < / sup> ، Mg 2 + < / sup>
صبغة تفاعلية أمين ؛ يعيش / ميت & تجارة; طقم وصمة عار الخلية الميتة القريبة من الأشعة تحت الحمراء القابل للإصلاحThermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo FisherScientific 10010023درجة الحموضة: 7.4 ؛ ث / س: Ca و Mg
P-S-G (100x) ThermoFisher Scientific10378016
الوسط القاعدي. Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutent Mix F-12Thermo Fisher Scientific11039021
Antibiotic، ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
Collagenase النوع الأولThermo Fisher Scientific17100017
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
فلتر ، مرشح حقنة Sterifix 0.2 & micro ؛ مبراون4099206
50   أنبوب الطرد المركزي المخروطي ملSarstedt62،547،254
15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطيSarstedt62،554،502
قارورة زراعة الخلية 75 سم 2< / sup>Sarstedt833،910،002
قارورة زراعة الخلية ، 25 سم 2< / sup>Sarstedt833،911،002
وسط التجميد ، BiofreezeBiochromF 2270
CryotubesThermo Fisher Scientific3772671.8 مل
محلول تريبان الأزرقSigma-AldrichT81540.4٪
غرفة العدبول مارينفيلد
مخدر موضعي ، زيلوسيتين (هيدروكلوريد ليدوكائين) 2٪ مع إبينفرين (أدرينالين) 0.001٪محلول Mibe
NaClبراون0.9
فيكريل ساتورز ، فيكريل رابيدإيثيكون3 - 0
النسيلة الحمار تركيب ٪

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096(2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015(2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114(2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183(2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005(2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326(2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300(2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902(2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063(2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406(2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154(2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879(2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113(2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dental Follicle Stem CellsStem Cell IsolationEnzymatic DigestionMicroRNA TransfectionCationic Lipid TransfectionFlow Cytometry AnalysisStem Cell CharacterizationMesenchymal Stromal CellsCell Culture ProtocolGenetic Modification

Related Articles