قد تورط في التوازن المتقدرية ميتوفاجي، تدهور انتقائية من الميتوكوندريا، وهو رفع الضوابط التنظيمية في مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. ومع ذلك، ملاءمة الأساليب التجريبية لقياس النشاط ميتوفاجي محدودة للغاية. هنا، نحن نقدم مقايسة حساسة لقياس نشاط ميتوفاجي باستخدام التدفق الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس ميتوفاجي الحساسة بالتدفق الخلوي استخدام تعتمد على درجة الحموضة "مراسل الفلورسنت" طن متري-كيما
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ميتوفاجي عملية إزالة انتقائية من الميتوكوندريا معطوب أو غير الضرورية باستخدام جهاز أوتوفاجي. وجدت روابط وثيقة بين ميتوفاجي المعيبة والأمراض البشرية المختلفة، بما في ذلك أمراض الأعصاب والسرطان والأمراض الأيضية. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن ميتوفاجي وتشارك في العمليات الخلوية العادية، مثل التمايز والتنمية. ومع ذلك، بدور محدد والآليات الجزيئية الكامنة وراء ميتوفاجي تتطلب مزيدا من الدراسة. ولذلك، من المهم لتطوير طريقة قوية وملائمة لقياس التغيرات في النشاط ميتوفاجي. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لتقييم كمي النشاط ميتوفاجي من خلال التدفق الخلوي استخدام البروتين الفلورسنت الميتوكوندريا التي تستهدف كيما (طن متري-كيما). ويمكن تحليل هذا الفحص الخلوي تدفق النشاط ميتوفاجي أكثر سرعة وحساسية من الأساليب التقليدية القائمة على الميكروسكوب أو إيمونوبلوتينج. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتحليل النشاط ميتوفاجي في مختلف أنواع الخلايا.
المقدمة
الميتوكوندريا هي العضيات التي تعتبر ضرورية لتكاثر الخلايا وعلم وظائف الأعضاء. الميتوكوندريا المسؤولة عن توليد أكثر من 80 في المائة إمدادات ATP عن طريق الفسفرة، وكما أنها توفر مختلف المواد الوسيطة الأيضية للتركيب الحيوي والاستقلاب1،2. بالإضافة إلى أدوارها في إمدادات الطاقة والايض، الميتوكوندريا تلعب أدواراً مركزية في العديد من العمليات الهامة الأخرى، بما في ذلك توليد الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية، وتنظيم موت الخلية وداخل الخلية Ca2 + ديناميات3 . وكانت التعديلات في الوظيفة المتقدرية المرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك السرطان والسكري وأمراض الأعصاب المختلفة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-توليد خلايا هيلا معربا عن ميتو-كيما (طن متري-كيما)
-
إعداد lentivirus طن متري-كيما
- معطف صحن ثقافة 100 ملم بإضافة 2 مل من 0.001 ٪ بولي-L-يسين/الفوسفات-مخزنة المالحة (PBS) والسماح لها بالوقوف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل بولي-L-يسين باستخدام ماصة زجاجية متصل بفراغ وغسل الطبق الثقافة بإضافة 2 مل من 1 x PBS.
- لوحة 1.5 × 106 HEK293T الخلايا في ثقافة المغلفة طبق مع 10 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين، والثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة2 CO لمدة يوم واحد.
- ترانسفيكت ميكروغرام 2 طن متري-كيما بلازميد لينتيفيرال
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد مثال على تحليل التدفق الخلوي ميتوفاجي ااحد المستحثة في خلايا هيلا باركين في الشكل 4. استخدام أسلوب التحليل الخلوي التدفق الوارد وصفها أعلاه، يمكننا الكشف عن زيادة هائلة في الخلايا ميتوفاجيك في بوابة "عالية". النسبة المئوية للخلايا في بوابة "عالية" زاد أكثر من 10 إضعاف بالمقارنة مع الخلايا التحكم غير المعالجة (الشكل 4 أ). هذه الزيادة في النشاط ميتوفاجي ألغى تماما بالعلاج المشترك مع بافيلوميسين A (واو) (ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقدم هنا، طريقة سريعة وحساسة لاستخدام التدفق الخلوي لقياس النشاط ميتوفاجي الخلوية في الخلايا معربا عن كيما طن متري. يحمل الخلايا تمر بمستوى عال من ميتوفاجي زيادة نسبة PE-CF594 (561 nm)/BV605 (405 nm) الإثارة. وهكذا، يمكن التعبير عن نشاط ميتوفاجي بالنسبة المئوية للخلايا العارضة ارتفاع نسبة 561/405. قمنا بحساب النسبة المئوية للخلايا في منطقة بوابة "عالية" في مؤامرة دوت من PE-CF594 (561 nm) مقابل BV605 (405 نانومتر)، وأظهرت النتائج أن المعاملة مع ااحد الناجم عن زيادة في ميتوفاجي في خلايا هيلا باركين. أظهرنا سابقا أن overexp.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل بمنحه من "مؤسسة أبحاث كوريا الوطنية" (2016R1D1A1B03931949) (لشين ياء)، ومؤسسة "البحوث الوطنية" في كوريا (جبهة الخلاص الوطني) منحة ممولة من government(MSIT) كوريا (رقم 2016R1A2B2008887 ورقم 2016R1A5A2007009) (إلى J.Y .)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > الكواشف < / قوي > | |||
| بولي إل ليسين | سيجما ألدريتش | P2636 | |
| FBS | جيبكو | 16000-044 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | ويلجين | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos العلمي | R0531 | |
| 0.45 & م حقنة مرشح | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| بوليبرين | سيجما ألدريتش | H9268 | 8 ملغ / مل |
| بورومايسين | سيجما ألدريتش | P8833 | 2 مجم / مل & nbsp ؛ |
| كاربونيل سيانيد إم-كلوروفينيل هيدرازين (CCCP) | سيجما ألدريتش | C2759 | 10 ملي مولار |
| تريبسين-EDTA | ويلجين | LS015-01 | |
| <قوي>المعدات< / قوي> | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (الإصدار 8.0.1) |
المراجع
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
