خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

ملخص

ويصف هذا البروتوكول نهجاً خالية من المعايرة لتحديد كمية البروتين هومو أوليجوميريزاتيون في المختبر استناداً إلى الأسفار تقلب التحليل الطيفي باستخدام ضوء التجارية الفحص المجهري. يتم عرض الإعدادات الصحيحة اقتناء وأساليب التحليل.

الملخص

عدد والسطوع أسلوب التحليل الطيفي (جبهة القوى الاشتراكية) تقلب الأسفار خالية من المعايرة للكشف عن البروتين هومو-أوليجوميريزيشن. يمكن أن تستخدم استخدام مجهر [كنفوكل] تقليدية مزودة بكاشفات رقمية. ويرد بروتوكول لاستخدام التقنية في المختبر عن طريق حالة استخدام حيث يمكن رؤية عدد والسطوع دقة قياس حالة المسمى مفينوس FKBP12F36V أوليجوميريك قبل وبعد إضافة الدواء ديميريزينج AP20187. وتناقش أهمية استخدام المعلمات اقتناء مجهر الصحيحة وطرق تجهيزها وتحليل البيانات الصحيحة. على وجه الخصوص، يتم التشديد على أهمية اختيار التصحيح فوتوبليتشينج. ويمكن استخدام هذا الأسلوب غير مكلفة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين في العديد من السياقات البيولوجية.

المقدمة

البروتين-بروتين تفاعلات أنا المختبر ن

تقليديا، علم البلورات وتجارب الرنين المغناطيسي النووي جنبا إلى جنب مع الميكروسكوب الإلكتروني cryo (كريويم) هي التكنولوجيات التي اختارت أن تصف بدقة بنية ثلاثية الأبعاد للبروتينات ووظيفتها بالاستدلال التدقيق في تفاصيل هيكلية عالية الدقة الخاصة بهم. ومع ذلك، البروتينات، وليست هياكل ثابتة ويمكن أن تخضع لمجموعة متنوعة من التغييرات conformational والاهتزازات في الزمان والمكان. وهذا السبب في هيكلية المعلومات من بلورية أو بيانات كريوم تحتاج إلى أن تستكمل مع تقنيات أخرى (مثلاً، ديناميات الجزيئية المحاكاة وتقنيات جزيء واحد): ترتبط وظيفة البروتين في كونفورماشونال التغييرات والتفاعلات، وهذه المعلومات غير موجودة في بنية ثابتة. من أجل التحقيق للديناميات داخل الجزيئية، تقنيات استناداً إلى جزيء واحد "فورستر الرنين نقل الطاقة" (سمفريت) هي فعالة جداً¹. هذه النهج قادرين على تقييم مختلف الفئات السكانية الفرعية من جزيئات معقدة من وسائل الإعلام. هذا أمر مهم جداً، كما أن هذه التغيرات السريعة وتحدث أثناء الحصول على البيانات (أي، النانوسيكند إلى النطاق الثاني).

نهجين رئيسيين تستخدم عادة لكشف وتحديد هذه التغييرات: البروتينات في الحل والسطح-التثبيت. للكشف عن التفاعلات بين الجزيئية وبصفة خاصة، عملية ثنائي الناجمة عن يغاندس، سمفريت ليست دائماً أفضل وسيلة. والواقع أن الحنق يعتمد ليس فقط على المسافة (إيتش وان زيرو شمال البحر الأبيض المتوسط) ولكن أيضا في اتجاه قطبانيه اثنين (المانحين ويقبلون، χ²) والتداخل بين الانبعاثات المانحين مع يقبلون امتصاص الأطياف²، ولكن ربما كان هذا الشرط الأخير أقل المهم شريطة أن يمكن experimentalist اختيار الزوجين الحنق الصحيح. وضع غير مؤات من سمفريت لسبر ثنائي هومو يأتي من العلامات من البروتين للفائدة: يمكن فقط أن تكون ثنائي سمفريت مغاير، الكشف عن نسبة تصل إلى 50% (أي، هترو-الحنق فقط ستكون قادرة على الكشف عن الجهات المانحة-يقبلون و المانحة يقبلون هومو-dimers لكن لا مانح أو يقبلون يقبلون، الذي هو الآخر 50 ٪ dimers). استخدام fluorescence ارتباط مطيافية (FCS) ومشتقاتها (فككس، إلخ³) للتأكد من البروتين نشر الثوابت وربط ثوابت في المختبر بديل آخر. ليست قادرة على كامل تقدير هومو-ثنائي أما هذه النهج، كما هو الحال في معامل التركز ونشرها، ونصف قطرها ونشر تدابير FCS واحد من الجسيمات نشرها هي سيئة للغاية تعتمد على الوزن الجزيئي؛ على سبيل المثال إلى زيادة الوقت في الوزن الجزيئي وسوف فقط ينطوي على تغيير إضعاف 2.15 في معامل نشر⁴. في حالة FCS اللونين أو فككس، سيتبين 50 في المائة فقط من هومو dimers لنفس السبب أعلاه. هي أكثر النهج العملي والكمية للكشف عن هومو-ثنائي في المختبر و في فيفو الحنق هومو⁵ وعدد والسطوع (ن وب)⁶. وبالنظر إلى أن الحنق هومو يتطلب استرداد الأجهزة المحددة من قيمة تباين (أي البصرية عناصر/محلل لاستعادة الاستقطاب متوازية ومتعامدة)، N & ب يرد هنا كتقنية ملائمة ل الكشف عن البروتين هومو-ثنائي والتجميع. يمكن أن يكون العاملين في المختبر و في فيفو مع مجموعة تجارية على حد سواء.

عدد والسطوع

وقد ن & ب تمت مراجعتها مؤخرا⁷. أن المراجعة ركزت على تطبيق هذه التقنية في الخلايا الحية. أنها جديرة بالاهتمام لإعادة إنتاج الشكلية الرياضية هنا كهذه المعادلات سوف تطبق على البيانات التي تم جمعها في المختبر. أولاً، من الضروري لتعريف بعض المصطلحات والكميات الرياضية:

• كيان هو مجموعة من الجزيئات التي ترتبط معا.
• اليورو سطوع كيان هو عدد الفوتونات تنبعث من كل وحدة زمنية (في الإطار).
• n هو عدد الكيانات الحالية.
• بيكسل معين على مدى سلسلة الصورة، < I > متوسط كثافة و σ² هو الفرق في شدته.

ثم، مع عد فوتون كاشفات وافتراض كيانات متحركة وأي خلفية،

حيث N هو عدد الظاهر و ب هو السطوع الظاهر. ينتج عن هذا

دلال et al. ⁸ أظهرت أنه مع المعدات التناظرية، يحتاج المرء ثلاثة شروط التصحيح: عامل Sوالخلفية الإزاحة₀σ ضجيج قراءات ². ثم، مرة أخرى بافتراض كيانات متحركة،

إعطاء

لاحظ أن المعادلة المذكورة أعلاه لمختلفة التي تعطي في دلال et al. ⁸ واستعراض لاحق. ⁷ أغفلت "في دلال" et al. S في المقام كان بسبب خطأ مطبعي واستنسخ هذا الخطأ في المراجعة. المعادلة أعلاه هو الصحيح. إرشادات لقياس S، تمنح σ والإزاحة₀² -جنبا إلى جنب مع شرح لمعانيها-دلال et al. ⁸

اليورو السطوع غير متناسب للدولة أوليجوميريك للكيانات التي نشرها: اليورو سيكون مرتين كما كبيرة ل dimers كما بالنسبة مونومرات، ثلاثة إضعاف كبير لأرتب كما بالنسبة مونومرات، مرتين كما كبيرة هيكساميرس كما لأرتب وهلم جرا. وبهذه الطريقة، قياس اليورو السطوع، واحد يمكن أن التحديد الكمي لأي نوع من مولتيميريزيشن.

إذا كان هناك خليط دول oligomeric العدد الحالي، وسطوع غير قادر على استرداد فرادى الدول oligomeric الحالية. هذا وجود قيود على هذا الأسلوب.

ديتريند برمجية خوارزمية وناندب

وأكد أهمية تصحيح فوتوبليتشينج وقد تم سابقا⁹. فوتوبليتشينج حتما يحدث أثناء تجارب الخفيفة الميكروسكوب في الوقت الفاصل بين الوضع؛ على حد سواء في الخلايا الحية و في المختبر. وقد وصف العديد من النهج في الأدب لتصحيح للتبييض⁷. تقنية التصفية أسي مع الاختيار التلقائي للمعلمة ديتريندينج تي هو أفضل الحالية. وتتكامل في ناندب⁹البرمجيات الحرة والمفتوحة المصدر. البرامج التي تتطلب المستخدم من اختيار يدوياً على معلمة ديتريندينج في الواقع، يمكن أن يؤدي إلى نتائج غير صحيحة لأن هذا الاختيار المعلمة سيكون على الأرجح تعسفية وغير صحيحة. الخوارزمية تلقائياً بفحص البيانات وتحدد المعلمة المناسبة لذلك، دون الحاجة إلى تدخل المستخدم⁹. حتى مع أفضل خيار لتجانس المعلمة، ديتريندينج حدودها وتعمل جيدا فقط مع النسب المئوية فوتوبليتشينج أقل من 25%، كما هو موضح بالمحاكاة⁹. من المثير للاهتمام، عند استخدام روتين ديتريندينج التلقائي، دقة أن واحدة يمكن أن تعمل مع قيم الإضاءة المنخفضة (حتى ب < 1.01)، ومن ثم انخفاض كثافة ولا تزال تكون دقيقة بما يكفي تحديد مقدار هومو-ثنائي.

فوتوبليتشينج يسبب أيضا مشكلة أخرى: وجود فلوروفوريس فوتوبليتشيد في مولتيمير معقدة. وهذا يجعل مثلاً تريمير تبدو وكأنها ديمر عند واحدة من الوحدات الثلاث في تريمير غير الفلورية. هور ومولر¹⁰ أظهر كيفية تصحيح هذا وجرى التشديد أيضا على هذا التصحيح في استعراض لاحق⁷. ويتضمن البرنامج ناندب هذا التصحيح⁹.

FKBP12 F36V نظام

FKBP12F36V هو بروتين الذي لا أوليجوميريزي بطبيعة الحال ولكن من المعروف أن ديميريزي عند إضافة ال^11،AP20187 المخدرات (المعروفة اختصاراً BB ديميريزينج يجند)¹². وهذا يجعل من حالة اختبار مثالية لعدد والسطوع: مع المسمى FKBP12F36V، مضاعفة oligomeric الدولة ينبغي أن تراعي عند إضافة BB.

البروتوكول

1-FKBP12 F36V-مفينوس تنقية

1. تحويل الخلايا بليس (DE3) مع ناقل pET22b التي تحتوي على مونوميريزيد البشرية FKBP12F36V¹² والطرفي ن His6 ومفينوس العلامات (ناقلات متاحة عند الطلب). لوحة الخلايا على أجار رطل وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين و 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول.
2. تحويل المستعمرات تحولت إلى ثقافة كاتب مل 100 رطل وتنمو ل 16-20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
3. تمييع الثقافة كاتب كثيفة (OD600 > 1) 1: 100 في المتوسط رطل (2 × 500 مل دفعات) وتنمو لمدة 2-3 ساعات ل OD600 = 0.6-0.8 (37 درجة مئوية، 200 لفة في الدقيقة).
4. بارد من الثقافات على الجليد. حمل مع 250 ميكرون إيبتج وتنمو لمدة 16-20 ساعة في 21 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة.
5. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 20 دقيقة.
6. ريسوسبيند بيليه في 40 مل من المخزن المؤقت ايماك (20 مم فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول مم 3، 1 مم β-ميركابتوثانول) وتستكمل مع مثبطات البروتياز يدتا خالية (1 قرص كل خلية بيليه).
7. Sonicate الخلايا (500 واط، 20 كيلوهرتز، 40% السعة، 9 ثانية في 11 s إيقاف لمدة 15 دقيقة) على المواد القابلة للذوبان الجليدي والحصاد بالطرد المركزي في 20,000 x ز.
8. نقل القابلة للذوبان قارورة مخروطية الشكل وإضافة 2 مل راتنج (انظر الجدول للمواد). احتضان لمدة ساعة واحدة مع تناوب 105 لفة في الدقيقة
   ملاحظة: كما يمكن استخدام النيكل سيفاروسي لهذه الخطوة ايماك.
9. حصاد الراتنج وتغسل مع 250 مل من المخزن المؤقت ايماك A تليها 500 مل من ايماك المخزن المؤقت ب (20 مم فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول ملم 7، 1 مم β-ميركابتوثانول).
   ملاحظة: زيادة على ايميدازول 50 مم في حالة استخدام الراتنج سيفاروسي النيكل.
10. الوت معلم His6 البروتين باستخدام المخزن المؤقت ايماك ج (20 مم فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 300 ملم، 1 مم β-ميركابتوثانول).
11. حقن على استبعاد حجم العمود (انظر الجدول للمواد) اكويليبراتيد في 10 مم هيبيس pH 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم DTT. وقد FKBP12F36V شطف الذروة في مل 87.71 في العمود استخدمنا.
12. تقييم نقاوة عبر صفحة الحزب الديمقراطي الصربي وتجمع وتركز كما هو مطلوب.

2-إعداد مصفوفة لوحة مولتيويل

1. ذوبان الجليد FKBP12F36V المنقي (أو يسمى بروتين فائدة) من-80 درجة مئوية.
2. تعد حلاً 100 نانومتر تنقية FKBP12F36V (10 ملم متوسطة، حبيس pH 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم DTT). Sonicate والطرد المركزي (الدوران السريع 13,000 لفة في الدقيقة) لمنع تشكيل المجاميع.
3. "الماصة؛" 100-200 ميليلتر في تشكيل غرفة مراقبة جيدا 8 مع أسفل زجاج.
4. إضافة ديميريزير BB النهائي بتركيزات من 10، 20، 40، 80، 100، 150، 300 و 500 نانومتر^12،13.
5. كمرجع، تعد حلاً 100 نانومتر مفينوس وحدة لتقييم الآثار المحتملة على التجميع وهطول الأمطار واسترداد قيمة سطوع مونومر مع الحصول على نفس الإعدادات.

3. اقتناء المعايرة مجاناً [كنفوكل]

1. بدء تشغيل النظام [كنفوكل] (الشكل 1). أي ضوء نظام [كنفوكل] مجهر مسح مزودة بكاشفات الرقمية أو التناظرية تتسم جيدا للكشف عن⁸، وقادرة على حفظ وقت يسكن مستمر لكل بكسل المكتسبة سوف تعمل.
2. تعيين مسار شعاع الإثارة:
   1. قم بتشغيل 514 nm الليزر ومجموعة في nW 20-100 السلطة على خروج الهدف (بالنسبة FKBP12F36V-مفينوس).
   2. حدد هدف 63X1.4NA أو ذوي الياقات البيضاء وتصحيح الماء غمر هدف مصممة لسفح المنحدر القاري.
   3. قم بتشغيل HyD، APD أو معايرة PMT كاشف. كاشفات قادر على عد فوتون الأفضل، كما في هذه الحالة، حساب S، σ والإزاحة₀² غير ضرورية.
   4. حدد الإطار الانبعاثات من 520-560 نانومتر
   5. تعيين الثقب في وحدة مهواة 1 نانومتر الانبعاثات ~ 545 المقابلة.
   6. قم بتعيين وضع اقتناء 16 × 16 بكسل
   7. تعيين بكسل يسكن الوقت t_يسكن أن استوفى تي_الإطار >> تي_د >> تي_{الإسهاب}، حيث _D هو الإقامة وقت نشرها البروتين و طن هو _الإطار معدل الإطار. وتناظر هذا الإعداد الوقت يسكن بالمايكروثانية ~ 13.
      ملاحظة: بعض الشركات المصنعة التجارية قد الماسحات الضوئية التي تم حفظ لم يسكن-الوقت كل بكسل المستمر. هذا الثبات حاسم بالنسبة لأسلوب العمل.
   8. تعيين حجم بكسل في ~ 120 نانومتر.
   9. حدد وضع اكتساب إكسيت وتحديد عدد الإطارات التي يتعين اكتسابها لاقتناء وكذلك (على سبيل المثال 5,000).
   10. إذا كان مزودًا النظام وضع الفائق، إدخال إحداثيات كل بئر والعدد من المقتنيات كل بئر لأتمتة هذه العملية.
       ملاحظة: كن حذراً لضمان وجود موزع المياه إذا استخدام هدفا غمر.
   11. إذا كان مزودًا النظام نظام التروية، تحميل حل BB وبرنامج التروية لبدء الحق بعد الإطار^ال 5000 لتقييم حركية ثنائي مع اكتساب مثلاً 10000 صور.
3. إضافة قطره نفط إلى هدف الغمر النفط/المياه إذا كانت الاستفادة من ذوي الياقات البيضاء وتصحيح الماء غمر هدف مصممة لسفح المنحدر القاري.
4. جبل الدائرة 8 المراقبة جيدا في المرحلة.
5. حدد البئر الصحيح والتركيز على الحل.
   ملاحظة: هامة: تجنب التركيز قريبة من الزجاج السفلي لتفادي انعكاس وتشتت. عند التركيز على أعمق في الحل، قم بفصل خيار التركيز الآلي.
6. البدء في اقتناء وحفظ المكدس الناتج من الصور في تنسيق TIFF.

4-ديتريند و "سطوع التحليل" استخدام ناندب حزمة R

1. كما تحقق جودة تجهيزها، استخدم إيماجيج¹⁴ إلقاء نظرة على الصور واسترداد التشكيل الجانبي لكثافة، كما هو مبين في الشكل 2. وهذا مفيد لتحديد ما إذا كان أو لم يكن قد حدث الكثير فوتوبليتشينج. إذا كان هناك الكثير من تبييض، البيانات ليست مناسبة لإجراء مزيد من التحليل.
   ملاحظة: يمكن أيضا أن إيماجيج مفيد لتحويل الصور إلى TIFF من الأشكال التجارية. ناندب البرنامج الموصوف أدناه يمكن أن تعمل فقط مع ملفات TIFF.
2. تنزيل وتثبيت^15،رستوديو والتطوير¹⁶. فمن الأفضل لتنزيل وتثبيت R أولاً، ثم رستوديو.
   ملاحظة: ما يلي وصف لكيفية استخدام حزمة ناندب R. معرفة اللغة R غير مطلوب لاستخدام ناندب، إلا أنه جعل الحياة أسهل.
3. قم بتثبيت حزمة ناندب.
   1. فتح رستوديو وفي وحدة التحكم، اكتب install.packages("nandb") والانتظار للتثبيت.
4. للتعرف على ناندب
   1. استعراض دليل¹⁷.
   2. قم بمراجعة التعليمات RStudio المدمج للوظائف المختلفة. تكون الدالة الأكثر احتمالاً لاستخدامها سيكون باستخدام brightness(). عرض ملف التعليمات لهذه الوظيفة عن طريق كتابة؟ brightness() في وحدة التحكم.
5. حساب السطوع
   1. ويقول أحد يحتوي على ملف صورة على سطح المكتب تسمى img001.tif (لاحظ أن 'ناندب' يعمل فقط مع ملفات TIFF). يمكن حساب واحد سطوع الصورة:
      ب <--السطوع ("~/Desktop/img001.tif"، تاو = "تلقائي")
      1. هذا يعين سطوع الصورة إلى ب متغير في ر. تاو = "تلقائي" يضمن أن الصورة هي ديترينديد بشكل صحيح قبل حساب السطوع. الشيء الأكثر شيوعاً من هنا لحساب متوسط أو متوسط سطوع الصورة. واحد يمكن القيام بذلك عن طريق كتابة mean(b) أو median(b). واحدة ويمكنك أيضا كتابة سطوع الصورة إلى سطح المكتب باستخدام
         ijtiff::write_tif (ب، "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. ويقول أحد لديه مجلد كامل من الصور images_folder على سطح المكتب، ويحتاج المرء لحساب برايتنيسيس من هذه الصور والكتابة سطوع الصور كملفات TIFF. ثم انظر؟ brightness_folder(). هذه الدالة عمليات مجلد بأكمله في كل مرة:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder"، تاو = "تلقائي")
      هذا أمر جيد لا سيما لأولئك الذين لديهم برمجيات أنهم يفضلون للبحث والتطوير، لأنه تتم معالجة كافة الملفات في أمر واحد واحد، ومن ثم واحدة يمكن مواصلة العمل مع الصور TIFF سطوع الإخراج في البرنامج الذي تم اختياره، سواء كان إيماجيج¹⁴ ، بيثون أو أي شيء آخر.

النتائج

سطوع ديتريندينج وأحادي

متى تم اكتساب البيانات، واحد يمكن بدء سطوع العمليات الحسابية لتحديد حالة أوليجوميريك من بروتين الفائدة في الحل. حتى ولو قد لا يكون تأثير تبييض في حل جذري كما أنها يمكن أن تكون في فيفو، تتبع كثافة سوف لا تزال لديها ربما لا يعني ثابتة، ربما بسبب تأثيرات فوتوفيسيكال تتصل فلوروفوري،¹⁸ لكن الأسباب الكامنة وراء هذا ليست مفهومة تماما. وهذا له تأثير عند حساب السطوع...

المناقشة

ن & ب أسلوب للكشف عن استخدام الضوء التجارية المسح مجاهر [كنفوكل] مزودة بأجهزة رقمية للكشف عن مولتيميريزيشن. وهذا النهج جذابة للغاية مقارنة بنقطة واحدة FCS وفككس وسمفريت لأنها المجانية المعايرة وحساب سطوع واضح ومباشر وتركيز مستقلة⁶. بيد أنه من أهمية كبرى، لتصحيح لتقلبات كثافة تبيض وطويلة الأجل قبل تنفيذ العمليات الحسابية سطوع⁹؛ زيادة طفيفة من سطوع سبب ابيضاض وغيرها من الأعمال الفنية يمكن أن يساء تفسيرها كتغيير في الدولة oligomeric (كما يتضح في الشكل 2

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
RosettaTM (DE3) pLysS cells	Novagen	70956-3
Ampicillin	Sigma Aldrich	PubChem معرف المادة 329824407
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	PubChem معرف المادة: 24892250
LB ثقافة بداية	QIAGEN
LB متوسط	QIAGEN	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329815691
IMAC buffer	Medicago	09-1010-10
مثبطات البروتياز الخالية من EDTA	سيجما ألدريتش	11873580001
راتنج تالون	Clonetech
النيكل سيفاروز	GE Healthcare
S200 16/60 عمود	GE Healthcare
زجاج قاع 8 طبق مراقبة بئر	نفس	المصدر 80827