يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد 68Ga المسمى ارجينين جليكاين اسبارتاتي (إدارات)-الببتيد للأوعية

6.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58218

⸱

يناير 7, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Applied RI, Korea Institute of Radiological and Medical Sciences

في هذه المقالة

ملخص

إنتغرين3 βvα هو نوع من البروتين الالتصاق التي يتم التعبير عنها عاليا على تنشيط خلايا بطانية تمر الأوعية. وهكذا، تقييم سلامة إنتغرين ذو أهمية كبيرة في علاج الأورام. هنا، نحن نقدم طريقة لإعداد 68Ga المسمى راديوبيبتيديس وأسلوب لتقييم فعاليتها البيولوجية.

الملخص

إنتغرين3 βvα جزيء التصاق هيتيروديميريك المعنية بالهجرة خلية الورم والأوعية. هو overexpressed في إنتغرين في الأوعية ورم خلايا بطانية، حيث أنها عادة بتركيز منخفض. يجعل هذا التعبير محددة αvبيتا3 العلامات البيولوجية صالحة للأوعية والتصوير من المخدرات. كطريقة تصوير فنية، يوفر التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) تغيير معلومات حول البيوكيميائية والفسيولوجية في فيفو، نظراً لحساسية عالية فريدة من نوعها على نطاق nanomolar. ومن ثم، المستندة إلى راديوميتال الصيدلية الحيوانات الأليفة تلقي اهتماما كبيرا للتحديد الكمي غير الغازية ورم تولد الأوعية. وتقدم هذه الورقة بروتوكول منهجية لإعداد ببتيد المسمى راديوميتال جديدة للتقييم لتولد الأوعية. هذا البروتوكول يحتوي على معلومات حول موثوقية الكيمياء الإشعاعية والانجذاب، وامتصاص الخلية، والاستقرار المصل وخصائص الحرائك الدوائية. 68Ga-إدارات-الببتيد واحد من يغاندس الحيوانات الأليفة الممثل نحوvα β3 إنتغرين. نقدم لك هنا، وضع بروتوكول لإعداد 68Ga-إدارات-الببتيد وتقييم فعاليتها البيولوجية.

المقدمة

تولد الأوعية هو عملية بيولوجية التي تتميز بتطوير أوعية دموية جديدة. من بين العديد من العوامل أنجيوجينيتيك،vα β3 إنتغرين مقترن اختزاع، نظراً إنتغرين يتم التعبير عن درجة عالية في سفن ورم الأوعية ولكن غائب في أنسجة طبيعية1.

راديولابيليد ملزم مستقبلات الببتيدات مع المجال ارجينين جليكاين اسبارتاتي (إدارات)، التي لها صلة عالية تجاهvα β3 إنتغرين المستقبلات، وتعتبر واعدة الأوعية التصوير وكلاء2،3 , 4 , 5 , 6 , 7-تم إنشاء العديد من المواد المشعة للحيوانات الأليفة، وقد تم التحقق من خصائصه البيولوجية في مختلف النماذج الحيوانية8،،،من910،11. من حيث النويدات مشعة، 68Ga مزايا عديدة على النظائر المشعة الأخرى. أولاً، أنه إمكانية عالية للمستخدمين وهو مفيد اقتصاديا لأنه ليس مطلوباً سيكلوترون. وثانيا، تنتج 68Ga-على أساس المواد المشعة عالية الدقة المكانية بالمقارنة مع فوتون واحد يحسب التصوير المقطعي (SPECT)، مما يتيح تحديد أكثر دقة. وأخيراً، قد يكون نصف دقيقة 67.71 68Ga كافية لإعداد الببتيدات الصغيرة أو البروتينات.

لإنتاج معقدة مستقرة مع 68Ga، وضعت العديد من تشيلاتورس. Chelators الممثل هي حمض 1,4,8,11-تيتراعزاسيكلوتيتراديكانيتيتراسيتيك (تيتا)، حمض 1,4,7,10-تيترازاسيكلودوديكاني-1,4,7,10-تيتراسيتيك (DOTA)، وحمض 1,4,7-تريازاسيكلونوناني-1,4,7-ترياسيتيك (الملاحظة)، ديثيلينيتريامينبينتاسيتيك حمض (دتبا)، ونون، ن '--di(2-hydroxybenzyl) الإيثيلنديامين-N, N'-حمض دياسيتيك (هبيد). وقد أبلغ الملاحظة لتشكيل مجموعة معقدة جداً مستقرة مع 68Ga (سجل الاستقرار المستمر 30.98)12،،من1314.

والغرض من هذه الدراسة تقديم بروتوكول موجزة لتطوير راديوبيبتيدي الجديد (الشكل 1). على سبيل مثال، نحن نستعد 68المسمى Ga إدارات-الببتيدات والأساليب الحالية للتقييم البيولوجي لهذه المماثلات في نموذج إكسينوجرافت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات امتثالا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات البحوث تحت بروتوكولات وافق معهد كوريا للإشعاع ولجنة الدراسات الحيوانية العلوم الطبية. جميع الكواشف والمواد المذيبة التي تم شراؤها واستخدامها دون مزيد من تنقية. الملاحظة-إدارات-الببتيدات أعدت وفقا لأساليب الأدب15.

تنبيه: 68Ga تنبعث البوزيترون وأشعة غاما. يجب أن تضطلع جميع التجارب، بما في ذلك الاتصال المباشر أو غير المباشر مع المواد المشعة، تدريب، والسماح للموظفين فقط. عند التعامل مع المواد المشعة، ينبغي استخدام معدات واقية مناسبة والتدريع وشارة دوسيميتير الإشعاع وخواتم ومقياس الدراسة استقصائية.

1-راديولابيلينج إدارات-الببتيدات مع 68GaCl3

ملاحظة: 68Ga (t1/2 = 68 دقيقة، β+ = 89%، والمفوضية الأوروبية = 11 ٪) تم الحصول عليها من 68Ga/68شركة جنرال الكتريك مولد.

  1. الوت 68GaCl3 من المولد مع 4 مل من 0.05 M HCl.
  2. تطهير مع غاز النيتروجين عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة الجافة 68GaCl3 (333 بيكيريل، 1 مل) في قنينة رد فعل 5 مل.
  3. إضافة حل لإدارات-الببتيد (100 ميكروغرام) في خلات الصوديوم 1 م (100 ميليلتر، الأس الهيدروجيني 5-6) إلى رد فعل القنينة التي تحتوي على 68GaCl3 من الخطوة 1، 2.
  4. حرارة الخليط رد الفعل عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم بارد عليه وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. تنقية المنتج الخام مع كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]). استخدم النظام التالية: عمود C-18، بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة، ومنحدر تدرج من الاسيتو الانيتريل 1.17%/min (5-40% في 30 دقيقة)، ومكونات شطف: A = 0.1% حامض trifluoroacetic (تفا) في الاسيتو الانيتريل، ب = 0.1% تفا في المياه.
    ملاحظة: [هبلك] مجهز بجهاز كشف صفيف الضوئي وجهاز للكشف عن النشاط إشعاعي. وجمعت 68Ga-إدارات-الببتيد في وقت احتفاظ 12.5 دقيقة (الشكل 2).
  6. تنقية الناتجة عن 68Ga-إدارات-الببتيد باستخدام نظام استخراج مرحلة صلبة.
    1. تمرير حل عن طريق خرطوشة عكس مرحلة C18 وتغسل مع 2 مل من المحلول الملحي.
    2. الوتي 68Ga-إدارات-الببتيد مع 0.7 مل إيثانول 95%. إزالة المذيب عند 80 درجة مئوية تحت غاز النيتروجين لمدة 20 دقيقة، وإعادة تشكيل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) قبل الاستخدام.
    3. تصفية راديولابيليد المنتج من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرون معقمة ووضع في 1 مل المحلول الملحي المعقم.
  7. تحقق عائد الكيمياء الإشعاعية بإذاعة طبقة رقيقة اللوني (TLC).
    1. بقعة 1 ميليلتر على صفيحة لوني طبقة رقيقة فورية (شروع، 10 سم في الطول). وضع اللوحة في دائرة التي تحتوي على الوينت (حمض الستريك 0.1 متر مائي، pH 5.0) حتى 9 سم بعيداً عن مكان الحادث.
      ملاحظة: الاحتفاظ بعامل 68Ga-إدارات-الببتيد 0 وهو معامل الاستبقاء الممتص 68Ga3 + 1.
  8. حساب النشاط المحدد النهائي من نسبة النشاط الإشعاعي المقابلة لعدم النشاط الإشعاعي مبق/نمول.
    ملاحظة: بعد حقن 100 ميليلتر من صياغتها 68Ga-إدارات-الببتيد إلى [هبلك]، تم حساب كمية المكون غير مشعة من منحنى المعايرة القياسية باستخدام نونراديواكتيفي Ga-إدارات-الببتيد.

2-امتصاص الخلايا في المختبر

ملاحظة: كانت تزرع الخلايا جليوبلاستوما البشرية "الخبيثة الدبقي" (U87MG) أوبسالا 87 في وسائل الإعلام النسر معدلة دولبيكو ل (دميم)، وتستكمل مع 10% الجنين البقري 1% ومصل البنسلين-ستربتوميسين. كانت تزرع الخلايا في أطباق 150 مم في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد CO 5%2. خلايا تم حصادها أو تقسيم بواسطة تريبسينيزيشن: التربسين 0.25% (w/v) والايثيلين 0.02% (w/v) حمض (يدتا) في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.

  1. خلايا U87MG البذور في لوحات 6-جيدا في كثافة 1 × 106 خلايا/حسنا.
  2. احتضان الخلايا مع 68Ga-إدارات-الببتيد (111 بيكيريل) عند 37 درجة مئوية ل 30، 60، 90، و 120 دقيقة تحضير عينات في ثلاث نسخ.
  3. تغسل الخلايا 2 x مع 2 مل من برنامج تلفزيوني والحصاد من تريبسينيزيشن. استخدام التربسين 0.25% (w/v) وحمض الإيثيلين 0.02% (w/v) (يدتا) في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
  4. جمع في تعليق خلية (500 ميليلتر) والتدبير في عداد γ.
  5. حساب نسبة استيعاب المجمع بالخلايا بنسبة % (التهم الموجهة إليه في حساب مجموع الخلايا).

3. في المختبر الاستقرار المصل

  1. إضافة 500 ميليلتر من المصل الماوس الطازجة، 500 ميليلتر من مصل الدم البشري و 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. احتضان هذا الخليط في 37 درجة مئوية ح 2.
  2. تقييم قبل شروع في فترات زمنية محددة (30، 60، 90، و 120 دقيقة). بقعة 1-2 ميليلتر قاسمة المخلوط إلى لوحة شروع (المرحلة المتنقلة: حمض الستريك 0.1 M). وضع لوحة كما في الخطوة 1، 7.
    ملاحظة: من المتوقع 68Ga3 + للانتقال مع جبهة المذيب، بينما سيظل المجمع المسمى في الأصل.

4-تحديد الانجذاب

  1. إضافة 68Ga-إدارات-الببتيد (3.7 مبق، 3.7 ميليلتر) إلى نظام تفريق الأوكتانول-برنامج تلفزيوني (1:1، v/v، المجموع 1 مل).
  2. مزيج القنينات بشدة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. أخذ 100 ميليلتر عينات من كل طبقة، وقياس النشاط الإشعاعي بعداد γ. قيمة المبلغ عنها سجل ف يستند إلى متوسط ثلاث عينات.

5-الورم النموذجي

ملاحظة: بالب/ج الفئران عارية (6-8 أسابيع القديمة، أنثى، n = 23) واستخدمت لهذه الدراسة. الفئران واستخدمت فيما بعد لدراسات الحيوانات الأليفة (n = 3) وبيوديستريبوشن (n = 20) عندما بلغ حجم الورم 200-300 ملم3 (1-2 أسابيع بعد زرع).

  1. تحميل خلايا الورم إلى 28 ز، محاقن الأنسولين 1/2 بوصة.
  2. حقن الخلايا U87MG (5 × 106) في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في منطقة الذراع الأيسر.
  3. تخدير الماوس مع إيسوفلوراني 2% في غاز الأكسجين أثناء حقن الخلية.
    1. تأكد من أن الماوس قد تم تخديره بفقدان سحب دواسة منعكس التالية معسر مع الملقط بين أصابع القدم حق هند. لا تترك حيوان غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.

6-التقدير الكمي في فيفو β αv3 "إنتغرين استخدام الحيوانات الأليفة"

  1. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني 2% في الأوكسجين.
    1. تأكد من أن الماوس قد تم تخديره بفقدان سحب دواسة منعكس التالية معسر مع الملقط بين أصابع القدم حق هند. لا تترك حيوان غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
  2. وضع رأسه في وسط الهزال الحيوانات الأليفة.
  3. عن طريق الوريد إدارة 68الحل Ga-إدارات-الببتيد (7.4 مبق، 200 ميليلتر) إلى xenograft الماوس نموذج عن طريق الوريد الذيل لمدة 1 دقيقة.
  4. في الوقت نفسه، إجراء فحص الحيوانات الأليفة في وضع قائمة (المسح الضوئي الديناميكي) لمدة 150 دقيقة.
    ملاحظة: تم إعادة البيانات الخام الحيوانات الأليفة بإطار الزمني المعرفة من قبل المستخدم (أيكل 30 دقيقة). بعد تفحص الحيوانات الأليفة، تفحص المحسوبة الدقيقة التصوير المقطعي (CT) (50 كفب من الأشعة السينية، 0.16 mA) أجريت لتصحيح التوهين.

7-بيوديستريبوشن السابقين فيفو

  1. حقن الوريد ذيل من طراز الماوس xenograft 68Ga-إدارات-الببتيد (مبق 0.37، 200 ميليلتر). تخدير الماوس مع إيسوفلوراني 2% في غاز الأكسجين أثناء الحقن.
    ملاحظة: بالب/ج الفئران عارية، كما هو موضح في القسم 5، كانت مقسمة إلى أربع مجموعات، والتضحية بها في نقاط زمنية مختلفة (n = 5 كل مجموعة).
  2. تنبيه الفئران فورا بعد إقامة 68Ga-إدارات-الببتيد والتضحية بهم في 30، 60، 90، وبوستينجيكشن 120 دقيقة مع القتل الرحيم ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: تم استخراج أنسجة الفائدة. وكانت الأهداف المحددة الدم، العضلات، القلب والرئة، والكبد، والطحال، المعدة، الأمعاء، الكلي، العظام، والورم.
  3. وزن الأنسجة، وقياس النشاط الإشعاعي بعداد γ.
    ملاحظة: النتائج أبديت كجرعة حقن نسبة كل غرام من الأنسجة (% معرف/g).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عملية إزالة معدن ثقيل من 68GaCl3 مع الملاحظة-إدارات-الببتيد مباشرة، وكان العائد راديولابيلينج 99%. وأزيلت الشوائب رد فعل بنجاح كما هو موضح في الشكل 2. الكيمياء الإشعاعية نقاء 68Ga-إدارات-الببتيد كان أكبر من 99 في المائة، ونشاط محدد في نهاية التوليف 90-130 مبق/نمول (الشكل 3).

قيم امتصاص الخلية ل 68Ga-إدارات-الببتيد كانت 1.49%, ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في الوقت الحاضر دراسة، وقدمنا بروتوكول لإعداد راديوبيبتيدي استهدافvα β3 إنتغرين وتقييمه البيولوجية. تطوير الأدوية التقليدية ينطوي على إجراءات معقدة. أنه يتطلب كمية كبيرة من المواد المرجعية ووقت تقييم طويلة نسبيا. على الرغم من أن المنهجية المقترحة لا يمكن أن تحل محل عملية التقييم الدقيق، يمكن استخدام هذا النظام لأغراض الفرز. واقترح هذا النظام سيقلل إلى حد كبير بالوقت والتكلفة.

على مدى العقد الماضي، درست العديد من إدارات-الببتيدات راديولابيليد على نطاق واسع راديوتراسيرس لتص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذا العمل كان يدعمها الأبحاث النووية وبرنامج التنمية الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) منحة ممولة من الحكومة الكورية (رقم 2017M2A2A6A02019904).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
68Ga/68Ge مولدITGCompany-10mCi 
محلول كلوريد الهيدروجينSigma-aldrich84429
أسيتات الصوديومSigma-aldrichS2889
C18 خرطوشة الطور العكسيWatersWAT020515
0.22-& mu ؛ م مرشح معقمMillliporeSLGV033RS
الماسح الضوئي Radio-TLCBioscanAR2000
ورقة ITLCAgilentSGI001
حامض الستريكSigma-aldrich251275
HPLCWaters-Waters1525 يحتوي على مضخة ثنائية ، مصفوفة الصمام الثنائي للصور (Waters 2998) ، كاشف النشاط الإشعاعي (Raytest ، Gabi)
AcetonitrileJ.T. بيكر14-650-359
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما ألدريتش302031
النسر المعدلة من Dulbecco   ؛Thermo fisher Scientific11965092
مصل الأبقار الجنينيThermo fisher Scientific16000044
T175 قوارير  كورنينجCLS431080
التربسين-EDTA (0.25٪)ثيرمو فيشر25200072
البنسلين - الستربتومايسينثيرمو فيشر15240112
؛ عدادبيركين إلمر-1480 معالج 3
حقنة إنسونلينبيكتون ديكنسون326105
مضخة سينرينجهارفارد جهاز70-4500
مايكرو PET / CTسيمنز إنفيون-
وسائط علمي علمي جاما

المراجع

  1. Friedlander, M., et al. Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins. Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).
  2. Janssen, M. L., et al. Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model. Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).
  3. Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).
  4. Garanger, E., et al. New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).
  5. Dijkgraaf, I., et al. PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).
  6. Liu, Z., et al. 68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).
  7. Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).
  8. Liu, S., et al. Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates. Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).
  9. Haubner, R., et al. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).
  10. Sivolapenko, G. B., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide. Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).
  11. Haubner, R., et al. Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography. Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).
  12. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles. Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).
  13. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
  14. Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. 68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography. Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).
  15. Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
  16. Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الوسم بالجاليوم 68تخليق ببتيد RGDتصوير تكوّن الأوعية الدمويةالمستحضرات الصيدلانية الإشعاعية للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيترونيتحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداءمقايسة الامتصاص الخلوياختبار الاستقرار في المصلقياس محبة الدهونالتوزع الحيوي في الورمالحصيلة الكيميائية الإشعاعية
إعداد 68Ga المسمى ارجينين جليكاين اسبارتاتي (إدارات)-الببتيد للأوعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.