يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بيض المخصب إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر للماوس

7.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58327

⸱

نوفمبر 1, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurobiology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 2Comparative Medicine Branch, National Institute of Environmental Health Sciences, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ماوس البويضات المخصبة والأجنة مرحلة مبكرة محمية بواسطة zona pellucida، مصفوفة بروتين سكري يشكل عائقا يحول دون إيصال الجينات. توضح هذه المقالة بروتوكول لتثقيب زونا بليزر ترانسدوسي الخلايا الجنينية مع ناقلات لينتيفيرال وخلق الفئران المعدلة وراثيا.

الملخص

لينتيفيروسيس ناقلات فعالة لإيصال الجينات إلى خلايا الثدييات. وبعد توصيل، الجينوم لينتيفيرال ستابلي أدمجت في كروموسوم المضيف ويتم تمريره إلى ذرية. وبالتالي، نواقل مثالية لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة و في فيفو تقديم مؤشرات، وتوصيل البيض خلية واحدة مخصبة لخلق الحيوانات المحورة وراثيا. ومع ذلك، الفأرة المخصبة البيض وأوائل مرحلة الأجنة محمية بواسطة بيلوسيدا زونا، مصفوفة بروتين سكري يشكل عائقا يحول دون إيصال الجينات لينتيفيرال. Lentiviruses كبيرة جداً لاختراق زونا وهي عادة ألقاه microinjection الجسيمات الفيروسية في تجويف بيريفيتيليني، والمسافة بين زونا والخلايا الجنينية. شرط التكنولوجيين ذوي المهارات العالية والمعدات المتخصصة قد التقليل من استخدام لينتيفيروسيس لتوصيل الجينات للأجنة الماوس. توضح هذه المقالة بروتوكول بيرميبيليزينج البيض الفأرة المخصبة تثقيب زونا بليزر. تثقيب الليزر لا ينتج أي ضرر على الأجنة ويسمح لينتيفيروسيس للوصول إلى الخلايا الجنينية لإيصال الجينات. يمكن أن تتطور لتصبح الكيسة في المختبر، وإذا كان مزروع في الفئران بسيودوبريجنانت، تتطور إلى الجراء المعدلة وراثيا الأجنة ترانسدوسيد. الليزر المستخدمة في هذا البروتوكول فعالة وسهلة الاستخدام. ودمج الخلايا الجنينية الماوس الجينات ألقاه lentiviruses ستابلي germline المعدية. هذا هو أسلوب بديل لإيجاد الفئران المعدلة وراثيا التي تتطلب لا ميكرومانيبوليشن و microinjection البويضات المخصبة.

المقدمة

هذا الأسلوب يوفر إرشادات مفصلة عن بيرميبيليزينج بيلوسيدا زونا البيض الفأرة المخصبة جعل الخلايا الجنينية موجوداً لإيصال الجينات التي لينتيفيروسيس. لينتيفيروسيس مصممة بطبيعتها لإيصال الجينات تتسم بالكفاءة لخلايا الثدييات. أنها تصيب الفاصل وعدم تقسيم الخلايا ودمج الجينوم لينتيفيرال الكروموسومات المضيف1. سهولة توسيع نطاق الخلايا المضيفة لينتيفيرال من بسيودوتيبينج lentivirus المؤتلف مع التهاب الفم الحويصلي الفيروس بروتين سكري (منظمة-ز)، سبب انتحاء واسعة من البروتين منظمة-ز2. وبعد توصيل، ستابلي الجينات لينتيفيرال متكاملة والتعبير عنها كجزء من الكروموسومات المضيف إنشاء أداة مثالية لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا. إذا سلمت إلى المرحلة المبكرة الخلايا الجنينية، الجينوم لينتيفيرال تكرارها والمعرب عنها في الكائن الحي كامل. وقد أدى إلى إنتاج الفئران والجرذان، والدجاج والسمان توصيل لينتيفيرال وخنزير3،،من45،،من67 من بين الأنواع الأخرى من الوراثي. ومع ذلك، يتطلب الأسلوب النموذجي لإيصال الجينات لينتيفيرال، الفنيين المهرة والمعدات المتخصصة للتغلب على الحاجز zona pellucida بتغليف الأجنة المرحلة المبكرة. والهدف العام لهذا الأسلوب لوصف كيفية بيرميبيليزي زونا استخدام ليزر لتسهيل إيصال الجينات لينتيفيرال.

بيض الثدييات محاطة بيلوسيدا زونا التي يصلب بعد الإخصاب لحماية البيض المخصب ضد بوليسبيرمي والحد من التفاعلات البيئية8،9. زونا أشكال حاجز الذي يحتفظ لينتيفيروسيس بعيداً عن الخلايا الجنينية حتى هي دبرت الأجنة الكيسة. المستزرعة الفأرة المخصبة يفقس البيض بعد 4 أيام ويجب أن يكون مزروع في الفئران بسيودوبريجنانت قبل الفقس للتطور الطبيعي في الجراء. ولذلك، لتوصيل، هي ميكروينجيكتيد لينتيفيروسيس قبل الفقس من زونا تجويف بيريفيتيليني، والمسافة بين زونا والخلايا الجنينية.

غالباً ما تتم إزالة بيلوسيدا زونا للاخصاب في الأنابيب من البويضات البشرية لزيادة معدل التسميد10. ومع ذلك، الكيميائية إزالة الماوس zona pellucida سلبا يؤثر نمو الجنين الماوس والضارة بالخلايا الجنينية11،12. طرق أخرى لإيصال الجينات إلى البيض الفأرة المخصبة التغلب على الحاجز zona pellucida microinjection المباشر للحمض النووي في نواة الخلية13. Pronuclear microinjection وسيلة فعالة لإيصال الجينات إلى الأجنة. ومع ذلك، منذ يقام كل الأجنة في مكان على حدة ل microinjection، يمكن الممارسة شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً لمستخدم مبتدئ.

أساليب أخرى مثل انهانسر وفوتوبوريشن مفيدة عابرة وإيصال الجينات القصيرة الأجل للماوس يخصب البيض14،،من1516. هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع لتوصيل المكونات كريسبر-Cas9 وريكومبيناسيس. ومع ذلك، لا يمكن استخدام التسليم انهانسر وفوتوبوريشن من الجينات كفاءة لخلق الوراثي. المني التي يتم جمعها من البربخ الماوس ثقب يمكن أيضا ترانسدوسيد من لينتيفيروسيس وتستخدم للاخصاب في المختبر لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا17،،من1819، 20.

في هذا البروتوكول، وتيسر إيصال الجينات لينتيفيرال للأجنة الماوس بيرميبيليزينج زونا استخدام ليزر. وقد وضعت الليزر زيكلون كمساعدة للاخصاب في الأنابيب 21 وزراعة الخلايا الجذعية الجنينية22. وهو جهاز صغير بسيط للإعداد وسهلة الاستخدام. مرة واحدة مثبتة على مجهر، تحتل المساحة من عدسة الهدف ويسمح البرنامج المصاحب لهدف الليزر بينما كانوا يبحثون عن طريق العدسات المجهر (انظر البروتوكول: الفرع 3). مرة واحدة هو مثقب زونا واسطة الليزر زيكلون، يمكن إدخال لينتيفيروسيس في ثقافة وسائل الإعلام ل إيصال الجينات23. يمكن استخدام لينتيفيروسيس متعددة في نفس الوقت تقديم عدة جينات لإدماج الكروموسومات.

هذا البروتوكول سوف تصف كيفية عزل والماوس الثقافة يخصب البيض، ويوضح استخدام الليزر لانثقاب بيلوسيدا زونا ويوضح توصيل الماوس الخلايا الجنينية بواسطة لينتيفيروسيس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الإجراءات الحيوان والعلاجات المستخدمة في هذا البروتوكول كانت متفقة مع المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية في المعاهد الوطنية للصحة/نيس وأقرها "رعاية الحيوانات" واستخدام اللجنة (ACUC) في المعاهد الوطنية للصحة/نيس، الحيوان البروتوكول 2010-0004.

1-الأعمال التحضيرية

  1. إعداد/شراء المؤتلف لينتيفيروسيس عدم نشر تحمل الجينات الخاصة بك للفائدة. في هذه الدراسة، لينتيفيروس SBI511 التعبير عن البروتين copepod أخضر نيون (كوبجفب؛ مختصر للتجارة والنقل) من استطالة استخدمت عامل 1a المروج لتوصيل. البروتوكولات القياسية2 استخدمت لإنتاج وعيار لينتيفيروسيس في التتر أعلى من الوحدات 1e8 ترانسدوسينج كل مل (تي يو/mL).
    ملاحظة: يجب توخي الحذر والتبييض كل المواد التي كانت على اتصال مع لينتيفيروسيس. الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للمعهد الخاص بك للاستخدام الأمن والتعامل مع لينتيفيروسيس.
  2. إعداد تربية زوج من سلالة الماوس المطلوب اليوم قبل الحصاد الأجنة. واستخدمت في هذه التجربة، C57BL/6J سلالة من الفئران. لا يعاملون الفئران الإناث المستخدمة المبايض وجمع قناة مع أي هرمونات سوبيروفوليشن.
  3. ح 2-24 قبل حصاد البيض الفأرة المخصبة، إعداد عدة لوحات قطره24 (كسم) "متوسطة البوتاسيوم الأمثل البسيط" على النحو التالي: إضافة قطره 50 ميكروليتر من متوسطة كسم في وسط صحن المعالجة بزراعة الأنسجة 35 ملم والغطاء مع 2 مل من ديميثيلبوليسيلوكساني (DMPS5X) ومكان في 37 سج و 5% CO2، 5% O2 و 90% N2 حجته.
    ملاحظة: استخدام المتاح لوحات العقيمة، وتجاهل عقب التعرض إلى لينتيفيروسيس.
  4. إعداد 1 x الحل للبروتين السكري المثبط في المتوسط M2 من حل الأسهم (100 x, 30 ملغ/مل، تخزين في-20 درجة مئوية). أعد 100 × الحل مخزون المياه.
  5. ح 24 وظيفة توصيل الليزر-بمساعدة من البيض الفأرة المخصبة، إعداد تربية أزواج بين الفئران الذكور والإناث استؤصل الاسهر لديهم لإعداد الفئران الإناث بسيودوبريجنانت.

2-عزل الفأرة المخصبة البيض

  1. ح 16 – 24 وظيفة التزاوج، حدد الفئران الإناث مع المقابس المهبل يدل على نجاح التزاوج ومعاملة إنسانية euthanize25. وقد euthanized الفئران المستخدمة في هذه الدراسة بخلع عنق الرحم تحت العميق استنشاق أول أكسيد الكربون2 أو إيسوفلوراني.
  2. عزل المبايض وأوفيدوكتس وفقا للبروتوكولات القياسية25.
  3. نقل المبيض وأوفيدوكتس إلى طبق 35 ملم تحتوي على وسائط الإعلام M2.
  4. لكل المبيض، تمزق ampulla أربا بالإفراج عن البيض المخصب محاطة بخلايا الركام.
  5. نقل البويضات المخصبة وخلايا الركام إلى 35 مم طبق يحتوي على البروتين السكري المثبط x 1 في المتوسط M2 واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 – 5 دقائق.
  6. بيبيت يخصب البيض صعودا وهبوطاً للإفراج عن الخلايا الركام.
  7. نقل البويضات المخصبة إلى طبق 35 ملم التي تحتوي على وسائط الإعلام M2 وبيبيت صعودا وهبوطاً ليغسل البروتين السكري المثبط.
  8. نقل البويضات المخصبة إلى طبق 35 ملم التي تحتوي على كسم وبيبيت صعودا وهبوطاً يغسل بقية وسائط الإعلام M2 والبروتين السكري المثبط.
  9. نقل البويضات المخصبة إلى لوحات قطره كسم استعدادا من الخطوة 1، 3.
    ملاحظة: يجب أن يوضع البيض الفأرة المخصبة في كسوم في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية و 5% CO2، % 5 س2 و 90% ن2 حجته. إزالة لوحات من الحاضنة لمدة أطول من 15 دقيقة سيؤدي إلى أضرار للأجنة.
  10. السماح للبيض المخصب لاسترداد ح 2 في الحاضنة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

3-انثقاب الفأرة المخصبة البيض مع الليزر زيكلون

  1. إعداد ومعايرة الليزر زيكلون وفقا لتوصية الشركة المصنعة. الأخرى أشعة الليزر، ويستخدم عادة للاخصاب في الأنابيب ، يمكن أن تكون بديلاً لليزر زيكلون التسلخات البويضات المخصبة.
    1. إرفاق سلك مربع تحكم الليزر إلى جهاز ليزر في المجهر.
    2. إرفاق مربع تحكم الليزر إلى الكمبيوتر الذي يشغل البرنامج الليزر عبر منفذ USB. 3.1.3. قم بتوصيل وحدة التحكم بالليزر وتشغيله.
    3. النظر من خلال العدسة، التسلخات عينة اختبار (مثلاً الجاف-محو علامات على شريحة زجاجية).
    4. تستخدم سائق المسمار صغيرة (المضمنة في أدوات الليزر) لضبط X وموقف Y من الليزر بحيث تتطابق مع LED الضوء مرئياً من خلال العدسة مجهر ومعايرة الليزر.
  2. ضع لوحة إسقاط كسم التي تحتوي على البيض الفأرة المخصبة في مرحلة مجهر. لا تحتفظ باللوحة خارج الحاضنة لمدة أطول من 15 دقيقة.
  3. ننظر من خلال العدسة مجهر وضمان أن zona pellucida للجنين في التركيز والليزر LED الضوء مرئياً.
  4. الانتقال من مرحلة مجهر لاستهداف زونا مع الصمام الخفيفة/الليزر.
  5. استخدام برامج الكمبيوتر تعيين الليزر زيكلون إلى 250 ميكروثانية.
  6. قم بضبط حجم الصمام الخفيفة إلى الأبعاد المطلوبة (إعداد 5 في هذه التجربة).
  7. انثقب زونا للبويضة المخصبة كل ثلاث مرات مع الليزر. ويمكن زونا أما مثقوبة أو ضعفت. استخدام الإعدادات أعلاه، سوف تنتج الليزر حفرة قطرها 10 ميكرومترات (الشكل 2).
    ملاحظة: هدف قريب من الجسم القطبي يبقى الليزر بعيداً عن الخلية الجنينية.
  8. السماح للبيض المخصب لاسترداد ح 2 في حاضنة استنبات الأنسجة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

4-توصيل الماوس يخصب البيض بعد انثقاب الليزر زيكلون

  1. بيبيت 2 ميكروليتر من مركزة لينتيفيروس (أكبر من عيار 1e8 تو/mL) إلى انخفاض كسم 50 ميكروليتر. عدم بيبيت صعودا وهبوطاً. سهولة إرفاق البويضات المخصبة بنصيحة بيبيت. استناداً إلى تجربتنا، وحدات 1e5-5e5 ترانسدوسينج من لينتيفيروس في وحدة تخزين أقل من 3 ميكروليتر الأمثل لإيصال الجينات.
  2. تسمح البويضات المخصبة أن تتطور إلى الكيسة لمدة 4 أيام في الحاضنة. لا حاجة لتغيير الوسائط.

5-غير الجراحية نقل الأجنة ترانسدوسيد الماوس للفئران الحوامل الزائفة

  1. استخدام بسيودوبريجنانت الفئران، بعد التزاوج، يوم 3.5 إعداد في الخطوة 1، 5.
  2. استخدام جهاز لنقل الجنين غير الجراحية (نسيت) لزرع الأجنة الماوس في الفئران بسيودوبريجنانت.
    1. باستخدام مجهر الجراحية أو تشريح، إدراج منظار المهبل رؤية عنق الرحم.
    2. أدخل جهاز نقل الجنين غير الجراحية (نسيت) حوالي 5 ملم في عنق الرحم وإيداع الأجنة في حجم حوالي 2 ميكروليتر.
      ملاحظة: تستخدم لنقل كل جهاز نسيت عقيمة والتخلص منها بعد الإجراء. يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة في التلاعب بالأجنة العقيمة.
  3. نقل الكيسة صحية 10 – 15 في حجم 2 ميكروليتر كسوم لكل الفئران بسيودوبريجنانت.
  4. الاستمرار في رصد وقياس زيادة الوزن في الفئران بسيودوبريجنانت في الأيام التالية لتحديد ما إذا نسيت كانت ناجحة.
  5. استرداد الجراء بالسماح للفئران الحامل أن تلد طبيعيا أو إجراء قيصرية بعد نقل الجنين2617 يوما. عملية قيصرية ضروري غالباً ما إذا كان يوجد عدد قليل جداً من الأجنة وأنها تنمو كبيرة جداً للولادة الطبيعية.
  6. جمع الأنسجة من الجراء عن التنميط لتحديد معدل ترانسجينيسيس27.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن التحقق من وضع البيض معزولة ترانسدوسيد الفأرة المخصبة تحت المجهر يوميا (الشكل 1). وضع أجنة صحية في الكيسة في غضون 3 – 4 أيام. في هذا البروتوكول، وضع 60 – 70% أجنة غير المعالجة في الكيسة23. من أصل 114 الأجنة ترانسدوسيد مثقوبة الليزر، تطورت 54 الكيسة (نسبة 47 في المائة) وأعرب 46 blastocysts التجارة والنقل (46/54 = 85%)23.

وكانت الأجنة الماوس مثقوبة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

قدرة لينتيفيروسيس على الاندماج على جينوم مضيف يجعلها متجه مثالية لإيصال الجينات مستقرة. يمكن أن تحمل ناقلات لينتيفيرال يصل إلى 8.5 كيلوبس زوج (kbp) المواد الجينية التي يمكن أن تستوعب المروجين خلية محددة أو إيندوسيبلي أو علامات التحديد مويتيس الفلورسنت. يمكن إجراء نسخ متماثل كجزء من جينوم مضيف بهم أدرجت المواد الجينية وتنظيمها للتعبير عن أو إلغاء تنشيطه في النقاط الزمنية المطلوبة. هذه المتجهات السماح الزمانية المكانية من التحكم في التعبير الجيني في مراحل مختلفة من التنمية ولينتيفيروسيس العلامة التجارية كأدوات قوية لإيصال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا البحث "برنامج البحوث الداخلية" للمعهد الوطني للصحة (NIH)، "الوطني معهد لعلوم الصحة البيئية" (نيس). ونحن ممتنون للدكتور روبرت بيتروفيتش والدكتور جيسون وليامز لقراءة نقدية للمخطوطات ونصائح مفيدة. كما نود أن نعترف وأشكر الدكتور بيرند اللمعان ولب خروج المغلوب ومرفق التدفق الخلوي، مجهرية Fluorescence ومركز التصوير وتسهيلات "نسبية الطب فرع" نيس لمساهماتهم الفنية. ونود أن نشكر السيد ديفيد غولدنغ من "فرع الطب المقارن" والسيدة لويس ويريك من مركز التصوير في نيس على تزويدنا بالصور والرسوم التوضيحية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CD510B-1 نظام البلازميدBiosciencesCD510B-1يستخدم لتعبئة الفيروس العدسي الذي يعبر عن EF1a-copGFP
ثنائي ميثيل بولي سيلوكسانسيجماDMPS5Xزراعة الأجنة
هيالورونيدازسيجماH3506المستخدمة لإزالة الخلايا الركامية
XYCloneليزر هاميلتون ثورن بيوساينستثقيب البيض
المخضع للفأرجهاز نقل الأجنة غير الجراحي (NSET)ParaTechs60010NSET من الأجنة
<قوي > KSOM متوسط < / قوي >MilliporeMR-020P-5F
زراعة الأجنة <قوية>تكوين KSOM: < / قوي >< قوي > ملغ / 100 مل < / قوي >
كلوريدالصوديوم 555
KCl18.5
KH2PO44.75
MgSO4 7H2O4.95
CaCl2 2H2O25
NaHCO3210
Glucose3.6
Na-Pyruvate2.2
DL-حمض اللاكتيك ، ملح0.174 مل 10
ملي EDTA100 & micro ؛ L
ستربتومايسين5
بنسلين6.3
0.5٪ فينول أحمر0.1 مل
L-Glutamine14.6
MEM أحماض1 مل
MEM غير أساسي AA0.5 مل
BSA100
<قوي> M2 متوسط < / قوي >MilliporeMR-015-Dزراعة الأجنة
<قوية>تكوين M2: < / قوي >< قوي > ملغ / 100 مل < / قوي >
كلوريد25.1
كبريتات المغنيسيوم (اللامائية)16.5
كلوريد35.6
فوسفات البوتاسيوم ، أحادي القاعدة16.2
بيكربونات35
كلوريد553.2
ألبومين ، جزء400
D-Glucose100
Na-HEPES54.3
فينول أحمر1.1
حمض3.6
DL-حمض295
الصوديوم أمينية أساسية الكالسيوم البوتاسيوم الصوديوم الصوديوم البقر البيروفيتيك اللاكتيك

المراجع

  1. Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
  2. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
  3. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  4. Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
  5. McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26(2010).
  6. Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335(2012).
  7. Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817(2012).
  8. Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
  9. Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
  10. Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
  11. Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
  12. Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
  13. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  14. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382(2014).
  15. Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677(2011).
  16. Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513(2014).
  17. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  18. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
  19. Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
  20. Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
  21. Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892(2014).
  22. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20(2006).
  23. Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
  24. Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
  25. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
  26. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
  27. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  28. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
  29. Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
  30. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الثقب بالليزرالمنطقة الشفافةإنشاء فئران معدلة وراثياًعزل الأجنةوسط KSOMليزر XYCloneتطور الكيسة الأروميةالانتقال عبر الخط الجرثومي
بيض المخصب إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر للماوس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.