O9--1 خط خلية crest العصبي ماوس مولتيبوتينت. هنا يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة لاستزراع خلايا O9--1، والتفريق بين الخلايا O9-1 في أنواع محددة من الخلايا والتلاعب وراثيا O9-1 الخلايا باستخدام siRNA بوساطة ضربة قاضية أو تحرير الجينوم كريسبر-Cas9.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استزراع والتلاعب بالخلايا Crest العصبي O9-1
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
وتهاجر الخلايا العصبية كريست (الصافية) الخلايا الجذعية البالغة multipotent التي يمكن أن تفرق في أنواع مختلفة من الخلايا وتؤدي إلى العديد من الأنسجة والأعضاء. خط الخلية O9-1 مشتق من الذاتية الفأر الجنينية البلدان المتبرعة الصافية ويحافظ على مولتيبوتينسي. بيد أن ظروف ثقافة معينة، خلايا O9-1 يمكن أن تفرق في أنواع مختلفة من الخلايا وأن تستخدم في طائفة واسعة من التطبيقات البحثية. في الآونة الأخيرة، مع الجمع بين الدراسات الماوس وخلية O9--1، أننا أظهرنا أن فرس النهر مما يشير إلى مسار المستجيبة ياب وطاز تلعب أدواراً هامة في التنمية الجمجمة المستمدة من قمة العصبية. على الرغم من أن عملية تثقيف للخلايا O9-1 أكثر تعقيداً من التي تستخدم لخطوط الخلايا الأخرى، خط الخلية O9-1 نموذج قوية للتحقيق في البلدان المتبرعة الصافية في المختبر. نقدم هنا، على بروتوكول لاستزراع خط الخلية O9-1 المحافظة على ستيمنيس، فضلا عن البروتوكولات للتفريق بين الخلايا O9-1 إلى أنواع الخلايا المختلفة، مثل خلايا العضلات الملساء وخلايا الاوستيوبلاستس. وبالإضافة إلى ذلك، يرد وصف بروتوكولات لإجراء دراسات فقدان لوظيفة الجينات في الخلايا O9-1 باستخدام الحذف كريسبر-Cas9 وضربه قاضية بوساطة الرنا التدخل الصغيرة.
المقدمة
الخلايا العصبية كريست (الصافية) هي الخلايا الجذعية مثل multipotent مع قدرة المهاجرة رائعة ووجود عابر أثناء التطور الجنيني. البلدان المتبرعة الصافية تنشأ بين الأديم الظاهر السطحي والانبوب العصبي وتهاجر إلى مناطق أخرى للجنين أثناء التطور الجنيني1. استناداً إلى تلك المجالات الوظيفية، ويمكن تصنيف البلدان المتبرعة الصافية إلى عدة أنواع مختلفة، بما في ذلك الجمجمة والجذع، تحفيزه، وعجزي، والقلب البلدان المتبرعة الصافية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن البلدان المتبرعة الصافية تفرق في الأنساب خلية متعددة، مثل خلايا العضلات الملساء، وخلايا العظام، والخلايا العصبية، وتؤدي إلى مختلف الأنسجة2،3. تنمية البلد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد قبل زراعة الخلايا O9-1
ملاحظة: القاعدية الوسائط المستخدمة لزراعة الخلايا O9-1 يجب أن يكون قد تكيف ب Sandos فطري الفئران ثيوجوانيني/واباين-مقاومة (ستو) الماوس تنتجها الخلايا الليفية الخلايا؛ ولذلك، تحتاج خلايا ستو الحصول عليها وإعدادها كما هو موضح أدناه قبل البدء في زراعة الخلايا O9-1.
-
ستو الخلية النشطة والثقافة
- إعداد الوسائط لاستزراع الخلايا ستو النشطة بجعل كاملة دولبيكو تعديل النسور (دميم) مع 7% مصل بقرى الجنين (FBS) (الخلايا الجذعية الجنينية ثقافة الصف)، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، ومم 2 لتر-الجلوتامين (تركيزات النهائي يتم الإشارة إلى).
ملاحظة: يتم استخدام متوسط ست....
- إعداد الوسائط لاستزراع الخلايا ستو النشطة بجعل كاملة دولبيكو تعديل النسور (دميم) مع 7% مصل بقرى الجنين (FBS) (الخلايا الجذعية الجنينية ثقافة الصف)، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، ومم 2 لتر-الجلوتامين (تركيزات النهائي يتم الإشارة إلى).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وكان هدف تجاربنا ضربة قاضية والضربة القاضية دراسة آثار ياب طاز الخسارة-من-وظيفة وفي الخلايا O9--1. قبل التجارب ضربة قاضية والضربة القاضية، لدينا للتأكد من أن التحضير لوسائط الإعلام القاعدية، وخلايا الثقافة O9-1 كما هو موضح أعلاه (على سبيل المثال، الغشاء مصفوفة الاحتياجات لتغطية لوحة كاملة كما هو مبين في الشكل 1، والخلايا O9-1 استردادها من النتروجين السائل كما هو مبين في الشكل 2). نحن أجرى تجارب ضربة قاضية كما هو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لجنة التنسيق الوطنية أحد مساهمين الرئيسيين وتنوعاً لمختلف الأنسجة والأعضاء خلال morphogenesis الجنينية. خط الخلية O9-1 يحافظ على قدرته على التفريق في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ويحاكي في فيفو خصائص البلدان المتبرعة الصافية، يجعلها أداة مفيدة في المختبر لدراسة وظيفة الجينات والتنظيم الجزيئي في البلدان المتبرعة الصافية. قد تتوافق مع حالة مختلفة من الخلايا O9-1 إلى مختلف العصبي كريست ذرية في فيفو، تبعاً لظروف الثقافة من الخلايا O9--1. يمكن الحفاظ على الخلايا O9-1 في حالة multipotent عندما مث.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
نيكول ستانسل، دكتوراه، ELS، المنشورات العلمية في معهد القلب تكساس، تقدم الدعم التحريري. ونشكر أيضا مصادر التمويل التالية: "منحة تطوير عالم مركز جمعية القلب الأمريكية الوطنية" (14SDG19840000 إلى وانغ ياء)، "جائزة البحوث لورانس" 2014 من رولانت وبيردون لورانس العظام المرض البرنامج من تكساس (إلى وانغ جيه )، والمعاهد الوطنية للصحة (DE026561 و DE025873 إلى وانغ جي، DE016320، و DE019650 إلى ماكسسون ر.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خلايا التغذية النشطة STO | ATCC | ATCC CRL-1503 | متوفر أيضا في شكل ميتومايسين C معطل ، كتالوج # ATCC 56-X |
| O9-1 فأر خط خلية القمة العصبية القحفية | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، لا جلوتامين | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM ، ارتفاع نسبة الجلوكوز | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (مصل الأبقار الجنينية) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| الجيلاتين من جلد الخنازير | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25٪ في HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco) بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم | Lonza | 17-512F | |
| MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (MEM NEAA) 100Xx | Gibco | 11140-050 | |
| بيروفات الصوديوم (100 ملم) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) 106< / sup> وحدة / مل | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| عامل نمو الخلايا الليفية البشرية المؤتلف الأساسي (rhFGF-basic) | R & D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1x) | Gibco | 31985-070 | |
| الحد الأدنى من الوسط الأساسي ، ألفا 1x مع أملاح إيرل ، الريبونوكليوسيدات ، الديوكسي ريبونوكليوسيدات ، و L-الجلوتامين | كورنينج | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus بركة غير مستهدفة | دارماكون | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (مصل ربلة الساق الجنينية) ITS | |||
| (الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم) | |||
| TGF-b3 | |||
| حمض | |||
| BMP2 (بروتين مورفوجيني للعظام 2) | |||
| B-27 |
المراجع
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
