مقالة منهجية

إنشاء نموذج الماوس ثنائي الأنسنة TK-NOG لمسببات أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية

8.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58645

⸱

سبتمبر 11, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لإنشاء الفئران أنسنة مع كل من الجهاز المناعي البشري وخلايا الكبد. الفئران المزدوجة التي تعاني من نقص المناعة التي تحققت عن طريق الحقن داخل الطحال من خلايا الكبد البشرية وCD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم عرضة للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 وتلخيص تلف الكبد كما لوحظ في المرضى المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية.

الملخص

وعلى الرغم من زيادة العمر المتوقع للمرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1)، فقد برز مرض الكبد كسبب شائع لاعتلالهم. ولا يزال علم أمراض المناعة في الكبد الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 بعيد المنال. يمكن للنماذج الحيوانية الصغيرة xenograft مع خلايا الكبد البشرية والجهاز المناعي البشري تلخيص البيولوجيا البشرية من مسببات الأمراض المرض. هنا، يتم وصف بروتوكول لإنشاء نموذج الماوس المزدوج أنسنة من خلال خلايا الكبد البشرية وCD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم / الخلايا السلف (HSPCs) زرع، لدراسة أمراض المناعة الكبد كما لوحظ في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. ولتحقيق إعادة تشكيل مزدوجة، فإن الذكور من المعارف التقليدية - NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK) يتم حقن الفئران داخل الحالبة بجرعات غانسيكلوفير (GCV) للقضاء على خلايا الكبد المعدلة وراثيا الماوس، ومع treosulfan لتكييف nonmyeloablative، وكلاهما تسهيل نمو خلايا الكبد البشرية (HEP) وتطوير الجهاز المناعي البشري (HIS). يتم تقييم مستويات الزلال البشري (ALB) لتطعيم الكبد، ووجود الخلايا المناعية البشرية في الدم التي تم الكشف عنها عن طريق قياس التدفق يؤكد إنشاء الجهاز المناعي البشري. النموذج الذي تم تطويره باستخدام البروتوكول الموضح هنا يشبه مكونات متعددة من تلف الكبد من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1. ويمكن أن يثبت أن إنشائها ضروري لإجراء دراسات عن العدوى المشتركة بفيروس التهاب الكبد ولتقييم العقاقير المضادة للفيروسات ومضادات الفيروسات العكوسة.

المقدمة

ومنذ ظهور العلاج المضاد للفيروسات العكوسة، حدث انخفاض كبير في الوفيات المتصلة بالعدوى الأحادية لفيروس نقص المناعة البشرية -1. ومع ذلك، فقد برز مرض الكبد كسبب شائع للاعتلال في المرضى المصابين بفيروس نقصالمناعةالبشرية1،2. العدوى المشتركة لفيروسات التهاب الكبد مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 هي أكثر شيوعا، مما يمثل 10٪ - 30٪ من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية في الولايات المتحدة3،4،5.

وتحد خصوصية المضيف لفيروسات فيروس نقص المناعة البشرية-1 والتهاب الكبد من فائدة النماذج الحيوانية الصغيرة في دراسة الأمراض المعدية الخاصة بالإنسان أو للتحقيق في جوانب متعددة من مسببات أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية-1. الفئران التي تعاني من نقص المناعة التي تسمح بتطعيم الخلايا البشرية و / أو الأنسجة (تسمى نماذج الماوس أنسنة) هي نماذج حيوانية مقبولة للدراسات ما قبل السريرية6،7،8. منذ إدخال الفئران الأنسنة في أوائل 2000s، دراسات ما قبل السريرية متعددة من سمية الكبد البشري cholestatic، مسببات الأمراض الخاصة بالإنسان، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 والاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية، فيروس ابشتاين بار، التهاب الكبد، وغيرها الأمراض المعدية، وقد تم التحقيق في هذه الفئران6،9،10،11. وقد وضعت نماذج الماوس متعددة لCD34+ HSPCs و / أو زرع خلايا الكبد البشرية منذ فترة طويلة، وقد تحسنت مع مرور الوقت لدراسة مسببات الأمراض من فيروس التهاب الكبد B (HBV) المرتبطة بمرض الكبد12، 13 , 14.وتستند عدة نماذج لزراعة HSPC وخلايا الكبد البشرية (HEP) على سلالات، والمعروفة باسم NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15,Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12,and fah-/- NOD rag1-/- [إيل2رغهمل] فأرة16. ومع ذلك، فإن لكل نموذج مزاياه وقيوده الخاصة؛ على سبيل المثال، الفئران ذات الأنسنة المزدوجة AFC8 لـ HEPs والخلايا الجذعية البشرية (HSCs) على خلفية Balb/C-Rag2-/- γc-/- الخلفية تمكن من تطعيم الخلايا المناعية وHSCs بنجاح، ولكن هناك غياب مستضد محدد T- و B-الخلية استجابة في هذا النموذج12. وتشمل الشواغل الرئيسية في إعادة تشكيل الفئران ذات الأنسنة المزدوجة الطعوم دون المستوى الأمثل، وعدم وجود نماذج مناسبة لدعم الأنسجة المختلفة، والظروف غير المتطابقة، ورفض المناعة، أو مرض الكسب غير المشروعمقابلالمضيف (GVHD)، والتقنية الصعوبات، مثل التلاعب محفوفة بالمخاطر مع حديثي الولادة وارتفاع معدلات الوفيات بسبب تشوهات التمثيل الغذائي13.

على الرغم من أن الفئران أنسنة قد استخدمت لبحوث فيروس نقص المناعة البشرية لسنوات عديدة17،18،19، واستخدام الفئران أنسنة لدراسة تلف الكبد الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 كان محدودا20. أبلغنا سابقا إنشاء نموذج الماوس TK-NOG المزدوج أنسنة وتطبيقها في أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية8. هذا النموذج يظهر الطعوم قوية من الكبد والخلايا المناعية ويلخص مسببات الأمراض عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. تقدم هذه المناقشة بروتوكولًا مفصلًا، بما في ذلك الخطوات الأكثر أهمية في زرع خلايا الكبد البشرية. كما يُقدَّم وصف للمركبات ذات الـ HSPCs اللازمة لنجاح عملية الطعوم من الملوثات التي تكون خالية من الحشرات وإنشاء نظام مناعي وظيفي في فئران TK-NOG. يتم تفصيل استخدام هذه الفئران لدراسة مسببات الأمراض المناعية الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. يتم استخدام الفئران الذكور TK-NOG تحمل فيروس الهربس البسيط محددة نوع 1 كيناز الثيميدين (HSV-TK) transgene. خلايا كبد الماوس التي تعبر عن هذا الترانسجين يمكن بسهولة أن تُقال بعد التعرض لفترة وجيزة لجرعة غير سامة من GCV. يتم الحفاظ على خلايا الكبد البشرية المزروعة بشكل مستمر داخل كبد الفأر دون أدوية خارجية21. كما يتم شروط مسبقة الفئران مع جرعات nonmyeloablative من treosulfan لخلق مكانة في نخاع العظام الماوس للخلايا البشرية8. يتم حقن الفئران TK-NOG نقص المناعة داخل مع HEPs وHSPCs متعددة القوى. ثم يتم رصد الفئران بانتظام لإعادة تشكيل الدم والكبد عن طريق علم الدم المناعي وقياسات مستويات المصل الإنسان الزلال، على التوالي. يتم حقن الفئران مع إعادة تشكيل ناجحة لأكثر من 15٪ لكل من الخلايا المناعية البشرية وHEPs داخل احصام الله مع فيروس نقص المناعة البشرية-1. يمكن تقييم تأثير فيروس نقص المناعة البشرية على الكبد في وقت مبكر من 4 - 5 أسابيع بعد العدوى. ومن الأهمية بمكان ملاحظة أنه، نظرا لاستخدام فيروس نقص المناعة البشرية-1، يجب اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة أثناء التعامل مع الفيروس وحقنه في الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في المركز الطبي لجامعة نبراسكا.

ملاحظة: الحصول على موافقة من IACUC المحلية قبل إجراء التجارب على الحيوانات.

1- معالجة دم الحبل السري وعزل ة الإنسان

  1. تنفيذ جميع خطوات البروتوكول في ظل ظروف معقمة في خزانات تدفق laminar.
  2. تناول دم الحبل السري (CB) الذي تم جمعه في الأنابيب المعمرة وجعل حجم الصوت يصل إلى 35 مل عن طريق إضافة ملحية عازلة من الفوسفات (PBS). طبقة العينة على رأس الخلايا الليمفاوية فصل المتوسطة (LSM) كما هو موضح في الشكل 1 والطرد المركزي LSM مع CB الطبقات في 400 × ز لمدة 35 دقيقة في 4 درجة مئوية مع عدم وجود الفرامل.
    ملاحظة: تمييع الدم بعناية وبلطف لتجنب الخلط في الواجهة.
  3. إزالة أعلى LSM وطبقة البلازما بعناية ونقل واجهة معطف برتقالي أبيض إلى أنبوب جديد باستخدام ماصة نقل.
  4. إعادة تعليق معطف برتقالي في 30 - 40 مل من الجليد الباردة العازلة (PBS + 0.5٪ ألبوم المصل البقري [BSA] + 2 M حمض الإيثيلين ديامينتيراسيتيك [EDTA]). باستخدام ماصة، الجمع بين 20 درجة مئوية من تعليق الخلية مع 20 درجة مئوية من 0.4٪ الأزرق تريبان وماصة 10 €L من الخليط في الافتتاح الخارجي لأي من الغرفتين من شريحة العد وإدراج الشريحة في عداد الخلية الآلي لحساب الخلايا.
    ملاحظة: استخدام الجليد الباردة العازلة في جميع الخطوات، كما أنه يساعد على الحفاظ على الخلايا قابلة للحياة.
  5. طرد مركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية واستنشاق supernatant بعناية. ثم، إضافة 300 درجة مئوية من الجليد الباردة العازلة.
  6. إضافة 100 درجة مئوية من مستقبلات Fc الإنسان حجب الكاشف و 100 درجة مئوية من أحادية النسيلة الماوس المضادة للإنسان CD34 الأجسام المضادة للجسم المترافق microbeads لمدة تصل إلى 1 × 108 خلايا (انظر جدول المواد). الحضانة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية، إضافة 10 مل من الجليد الباردة العازلة لغسل الخلايا، والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: توسيع هذا وفقا لرقم الخلية في حالة وجود أكثر من 1 × 108 الخلايا.
  7. إزالة بعناية supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 500 درجة مئوية من العازلة، والمضي قدما في خطوة الفصل المغناطيسي لإثراء HSPCs.
  8. ضع عمود LS اختيار إيجابي (راجع جدول المواد)في حقل فرز الخلايا المغنطيسية ومررها باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت.
  9. تحميل العينة إلى العمود LS التي يمكن أن فخ microbeads ملزمة CD34 + الإنسان في عينات والسماح لها بالتدفق تحت تأثير الجاذبية في أنبوب جمع.
  10. غسل العمود 3X مع المخزن المؤقت وجمع elute في نفس أنبوب جمع CD34- جزء من الخلايا.
  11. قم بالغطس في العمود باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت للوصول إلى CD34+ الخلايا في أنبوب تجميع جديد. كرر الإجراء لتحقيق نقاء >90%.
  12. عد CD34+ الخلايا باستخدام صبغة الأزرق تريبان في مقياس الهيموشتوي. بعد العد، الطرد المركزي CD34+ الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل supernatant.
  13. إعادة تعليق CD34+ الخلايا في 25 ميكرولتر من PBS لحقن لاستخدامها على الفور في زرع أو حفظ الخلايا بالتبريد بتركيز 1-2 مليون /مل في تجميد المتوسطة (روزويل بارك معهد ميموريال معهد المتوسطة [RPMI 1640 المتوسطة] + 50٪ الجنين مصل البقر (FBS) + 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) لمزيد من الاستخدام في زرع.
    ملاحظة: إعادة سرد الخلايا القابلة للحياة دائمًا قبل استخدامها في الزرع.
  14. للتحقق من نقاء CD34+ elute، واتخاذ 50 درجة مئوية من التعليق واحتضانه مع 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD34 المضادة للبشرية PE مترافق لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. بعد حضانة الأجسام المضادة، وغسل الخلايا الملونة مع PBS، وإعادة تعليقها في 100 درجة مئوية من PBS، ومن ثم، والمضي قدما لأداء قياس التدفق. إضافة أنبوب إضافي من الخلايا مع عدم وجود الأجسام المضادة لتصميم البوابة في مقياس التدفق.
  15. بعد الاكتساب، قم بتحليل البيانات عن طريق تحديد المنطقة ذات الأهمية على مخطط تشتت أمامي (FSC) وتشتت جانبي (SSC)، متبوعاً بإضافة خلايا واحدة على قطع الأراضي التي تحتوي على منطقة FSC وارتفاع FSC. بوابة CD34-الخلايا الإيجابية على خلايا واحدة في قناة PE ومؤامرة منطقة SSC.

2. إعداد خلايا الكبد البشرية لزرعها

  1. إزالة خلايا الكبد المحفوظة بالتبريد من النيتروجين السائل، وغمر القارورة بسرعة في حمام الماء، وذوبان لمدة 90 - 120 ق تقريبا.
  2. إزالة غطاء القارورة وصب خلايا الكبد المذابة في أنبوب مخروطي 50 مل من وسط ذوبان الدافئة.
  3. تعليق الخلايا عن طريق هز أنبوب 50 مل باليد لبضع ثوان.
    ملاحظة: لا دوامة الأنبوب.
  4. بيليه الخلايا في 100 × ز لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا الكريات في PBS مع 0.1٪ BSA وتجميعها مع HSPCs الطازجة أو المذابة (نسبة 10:1) في PBS في حجم نهائي من 80 درجة مئوية / الماوس.

3. مناولة الحيوانات، والفحص، والنماذج الجينية، والعلاج لزرع HSPC وخلايا الكبد البشرية

  1. التعامل مع الحيوانات
    1. نتيجة لنقص المناعة الشديد، تولد، منزل، والتعامل مع الفئران TK-NOG في ظل ظروف العقيم.
    2. ارتداء دائما معطف المختبر، والقفازات، ويغطي الأحذية، وقناع الوجه لمنع العدوى مع الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض المحتملة.
    3. استخدام قفازات معقمة والأدوات لعملية جراحية والتعامل مع الحيوانات عنقمية طوال الجراحة.
  2. اختيار فئران TK-NOG للتجربة
    1. الحفاظ على مستعمرة سلالة TK-NOG عن طريق تربية الفئران TK-NOG الإناث مع الذكور غير TK-NOG القمامة واختيار الذرية المعدلة وراثيا عن طريق علم الوراثة.
      ملاحظة: إجراء النماذج الجينية (انظر الخطوة 3-3) لتحديد وجود أو عدم وجود الجين المتحول في الفئران الذكور والإناث حديثي الولادة في وقت الوهن.
    2. اختيار الذكور في 6-8 أسابيع من العمر للزرع بسبب حساسيتهم العالية لاستنفاد GCV بوساطة من HSV-TK transgene التعبير عن خلايا الكبد21.
    3. الأذن العلامة الفئران في وقت الوين أو الجراحة لتسهيل تحديد الهوية. لاحظ أسفل الوزن والحالة الصحية للالحيوانات.
  3. الكتابة الجينية لوجود ترانسجين HSV-TK باستخدام تفاعل متسلسل بوليميراز في الوقت الحقيقي
    1. أداء النماذج الجينية في وقت الوين (عادة في 3 - 4 أسابيع من العمر). للكتابة الجينية، قطع قطعة من أذن الماوس في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية تدفق laminar للحفاظ على العقم واستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجينومي.
    2. تضخيم الحمض النووي الجينومي المستخرج من قطعة الأذن في خليط رد فعل 20 ميكرولتر إلى الشاشة لانتقال HSV-TK تحت سيطرة المروج الزلال البشري عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من التمهيدي إلى الأمام 5'-CCATGCACGTTTATTTTGG-3 '، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي 5'-TAAGTTGCAGCGCGCGTC-3'، 0.5 ميكرولتر من FAM التحقيق 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 '، و 10 ميكرولتر من مزيج رئيسي على تفاعل البوليميراز سلسلة في الوقت الحقيقي (PCR) أداة22.
    3. تعيين إعدادات PCR في الوقت الحقيقي على النحو التالي: 60 درجة مئوية لمدة 30 ق (مرحلة القراءة المسبقة)، 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (مرحلة الانتظار)، 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ق و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (مرحلة PCR)، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ق (مرحلة ما بعد القراءة).
      ملاحظة: وتعتبر دورة العتبة (Ct) أقل من 22 إيجابية بالنسبة للترانسجين HSV-TK.
  4. العلاج باستخدام غانسيكلوفير وتروسولفان
    1. باستخدام إبرة 27 G، حقن الفئران TK-NOG مع حقن GCV داخل الصفاق (6 ملغ / كغ) 2X يوميا في اليوم 7 وفي اليوم 5 في 100 ميكرولتر من المالحة قبل الجراحة لاستنفاد الخلايا النضوية المعدلة وراثيا الفئران (كما هو مبين في الاستراتيجية التجريبية في الشكل 2)23 .
    2. في الأيام 3 و2 و1 قبل الجراحة، الفئران المسبقة مع جرعات داخل الصفاق nonmyeloablative من treosulfan (1.5 غرام / كغ / يوم) في 100 ميكرولتر من المالحة، وذلك باستخدام إبرة 27 G.
    3. قبل يوم واحد من الجراحة، رسم اثنين إلى ثلاث قطرات (~ 100 درجة مئوية) من الدم من الوريد تحت الفك السفلي عن طريق وخز مع 5 ملم لانسيت، وعزل المصل عن طريق الطرد المركزي (1500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية) لألانين أمينوترانسفيراز (ALT) اختبار لتقييم degr هه من تلف الكبد.
  5. التحضير للجراحة
    1. استخدم كليبرز لثقب فرو الماوس المحيط بموقع الشق (على يسار الجدار العضد) قبل الجراحة.
    2. ضبط تدفق الأكسجين إلى 1 لتر / دقيقة وتدفق isoflurane إلى 3٪ - 5٪ في غرفة التعريفي باستخدام آلة تخدير الماوس. ضع فأرة واحدة في كل مرة في غرفة الحث للتخدير.
    3. إرفاق أحد طرفي أنبوب تمديد معقمة (مع قدرة عقد 550 درجة مئوية من التعليق؛ انظر جدول المواد للمواصفات) إلى إبرة 30 G والطرف الآخر إلى حقنة 1 مل.
    4. ملء الحقنة مع تعليق (80 درجة مئوية / الماوس) من HEPs المجمعة وHSPCs (انظر القسم 2)، تناسب الحقنة في درجة من ماصة الاستغناء المتكررة، وضبط موزع لتوزيع 10 ميكرولتر في كل الصحافة.
    5. مرة واحدة يتم التخدير الفئران (عادة بعد 3 - 4 دقيقة)، والتبديل تدفق isoflurane إلى مخروط الأنف والحد من معدل تدفق isoflurane إلى 2٪ - 3٪.
  6. زرع الصفيحات من HSPCs البشرية وخلايا الكبد في الفئران
    1. تنفيذ جميع خطوات الجراحة في مجلس الوزراء تدفق اللامينار في ظل ظروف معقمة.
    2. وضع الستائر المعقمة نظيفة على سطح العمل وفرك الجانب الأيسر من الجسم من كل فأر مع 10٪ بوفيدون اليود تليها 70٪ كحول isopropyl، قبل إجراء شق.
    3. إجراء شق صغير (~ 1 - 1.5 سم في الطول و 5 ملم عميق) في الجلد والعضلات والسوريوم على يسار الجدار العضد مع مقص نوع فانا لدخول تجويف العضد حوالي 5 ملم تحت الحافة السفلى من القفص الصدري.
    4. حدد موقع الطحال، وسحبه قليلا مع ملقط إلى منطقة العمليات لسهولة الوصول إليها، وإدراج إبرة 30 G في القطب السفلي من الطحال.
    5. فتح الغطاس من ماصة الاستغناء والاستغناء 10 ميكرولتر من حجم في وقت واحد، مع حد 60 - 80 درجة مئوية لكل الطحال. سحب الإبرة ببطء ومقطع الطحال مع مقاطع الربط باستخدام قضيب الربط.
    6. دفع الطحال مرة أخرى إلى تجويف الجسم مع تطبيق القطن يميل مبللة مع PBS معقمة.
    7. أغلق طبقة العضلات من جدار البطن باستخدام خياطة قابلة للامتصاص توقف نمط خياطة (وليس المستمر). إنجاز إغلاق الجلد مع نمط خياطة توقف باستخدام الغرز غير قابلة للامتصاص.
    8. استخدام منصات المياه الدافئة تعميم لحماية الفئران من انخفاض حرارة الجسم بعد الجراحة.
    9. إزالة الغرز غير القابلة للامتصاص 10-14 يوما بعد الجراحة.
  7. الرعاية بعد العملية الجراحية
    1. عندما يوقظ الحيوان المزروع، حقن البوبرينورفين مسكن (0.1 ملغ / كغ) داخل اقبول، 2X في اليوم لمدة 3 أيام متتالية.
    2. مراقبة الحيوانات على الأقل 1X في اليوم حتى يعودوا إلى الظروف البدنية العادية.
      ملاحظة: تحقق من وزن جسم كل الحيوان، لأن بعض الفئران قد تفقد الوزن بعد الجراحة. عادة ما تستعيد الفئران وزنها الأصلي في 1 إلى 2 أسابيع.

4. التحقق من صحة الطعوم من الكبد البشري من قبل ELISA والجهاز المناعي البشري عن طريق قياس التدفق

ملاحظة: تقييم إعادة تشكيل الكبد البشري والجهاز المناعي شهريا، بدءا من 1 شهر ما بعد الزرع عن طريق فحص المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) وقياس التدفق الخلوي، على التوالي.

  1. جمع عينات الدم من الوريد تحت الفك السفلي باستخدام الرمح في أنابيب EDTA، والطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. عزل المصل للتحقق من مستويات الزلال البشري لتقييم كفاءة تطعيم كبد الفأر لخلايا الكبد البشرية المزروعة، وذلك باستخدام مجموعة الكم ELISA الزلال البشري (انظر جدول المواد)باتباع الشركة المصنعة تعليمات.
    ملاحظة: لا تتخلى عن بيليه واستخدام الخلايا الكريات لتحليل قياس التدفق للخلايا لتقييم إعادة تشكيل الجهاز المناعي البشري.
  2. إعادة تعليق بيليه الخلية بدون مصل في 35 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (PBS + 2٪ FBS) وملطخة بـ 5 ميكرولتر من CD45 الخاص بالماوس (تركيز 0.5 ملغم/مل)، 5 ميكرولتر لكل من الأجسام المضادة الخاصة بالإنسان CD45 (0.1 ملغ/مل)، CD3 (0.2 مغ/مل)، CD8 (0.1 مغ/مل)، وCD19 (0.5 ملغ/مل) ، و20 ميكرولتر من CD4 (0.25 ملغم/مل) وCD14 (0.25 ملغم/مل) لكل منهما لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، للتحقق من تطور نظام مناعي وظيفي من CD34+ HSPCs.
    ملاحظة: النظر في إضافة أنبوب إضافي واحد من الخلايا غير الملطخة لتحديد gating من الخلايا الملونة.
  3. بعد الحضانة، نقل تعليق الملون (~ 100 درجة مئوية) في أنبوب قياس السيتومترية تدفق جولة القاع البوليسترين واستخدام 2 مل من 1X lysis العازلة (انظر جدول المواد)عن طريق تخفيف 1 جزء من 10X lysis العازلة مع 9 أجزاء من الماء المقطر وحضانة 10 - 15 دقيقة لخلايا الدم الحمراء.
    ملاحظة: مراقبة العكر لتقييم الانليس من خلايا الدم الحمراء. بمجرد أن تصبح العينة واضحة، يتم اكتمال اللليس.
  4. بعد lysis، إضافة 3 مل من المخزن المؤقت FACS في الأنبوب والطرد المركزي في 300 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه. كرر الغسيل عن طريق إضافة 3 مل من المخزن المؤقت FACS إلى بيليه والطرد المركزي في 300 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. إصلاح الخلايا في طازجة أدلى 1٪ بارافورمالدهايد (PFA) والحصول على الخلايا الملونة على مقياس التدفق، وتحليلها مع برنامج التدفق.
  6. للتحليل، حدد الخلايا الليمفاوية gating على مؤامرة FSC / SSC، تليها خلية واحدة gating على FSC-منطقة / FSC-الارتفاع.
  7. وعلاوة على ذلك، فإن بوابة CD45 الخاصة بالإنسان (hCD45) على السكان من خلية واحدة وتشمل CD45 خاصة بالماوس (mCD45) لاستبعاد الخلايا من أصل المورين. وضع استراتيجية gating من السكان الملونين على أساس gating من الخلايا غير الملطخة.
  8. بوابة hCD45+ خلايا لتحديد تواتر خلايا CD3+ T وCD19+ B الخلايا. خلايا البوابة T لتحديد مجموعات فرعية CD4 و CD8. لتقييم الخلايا الأحادية، بوابة على hCD45 لتحديد CD14+ الخلايا الأحادية.

5. عدوى فيروس نقص المناعة البشرية من الفئران TK-NOG وتأثيرها على الكبد البشري والجهاز المناعي

  1. التعامل مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 وجميع الفئران المصابة في منشأة معينة للسلامة البيولوجية من المستوى 2.
    تحذير: الأوتوكلاف والتخلص من جميع النفايات المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في أكياس الخطر البيولوجي المزدوج. لأسباب تتعلق بالسلامة، ارتداء قفازات مقاومة للقطع أثناء تسليم الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.
  2. ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE)، بما في ذلك ثوب الغطاء المتاح، ويغطي الأحذية، وقناع الوجه، والقفازات المزدوجة في جميع الأوقات أثناء العمل مع الفيروس.
  3. حدد الفئران مع إعادة تشكيل أكثر من 15٪ من CD45 الإنسان+ الخلايا (اختبارها في الخطوة 4.7) ومع وجود الزلال البشري في المصل للعدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 (اختبارها في الخطوة 4.1).
  4. حقن الفئران مع 1 × 103 إلى 1 × 104 الأنسجة زراعة الجرعات المعدية 50 (TCID50) HIV-1ADA في حجم 100 - 200 درجة مئوية لكل فأرة، داخل اقابي.
  5. قتل الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 5 أسابيع بعد العدوى باستخدام isoflurane (مع تركيز بخار الإيسوفلوران من >5٪).
  6. بعد قتل الفئران، وجمع الدم في أنابيب EDTA عن طريق ثقب القلب لعزل المصل، لمعرفة تأثير فيروس نقص المناعة البشرية-1 على الكبد عن طريق تقييم مستويات الزلال ينسّف هُنا من قبل ELISA (انظر الخطوة 4.1) وخلايا الدم للتحقق من وجود تغييرات في المناعة البشرية الخلايا التي تستخدم قياس التدفق (راجع الخطوات 4.2 -4.8).
    ملاحظة: تقييم الحمل الفيروسي المحيطي 5 أسابيع بعد العدوى على محلل حيوي للتأكد مما إذا كانت الفئران مصابة.
  7. بعد سحب الدم، استئصال الكبد من الفئران القتل الرحيم.
  8. لاستئصال الكبد ، كشف تجويف البطن عن طريق إجراء شق من 1.5 - 2 سم طويلة و 0.5 سم عميقة في الجلد والعضلات والخطاط ، من xyphoid. جعل قطع عمودي على العمود الفقري بين الكبد والحجاب الحاجز. رفع الكبد ولقطع أي أغشية تعلق على المعدة والأمعاء.
  9. جمع وإصلاح الكبد في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها واتبع بروتوكول المناعية الكيميائية القياسية لتقييم تأثير فيروس نقص المناعة البشرية على CK18+ خلايا الكبد باستخدام الإنسان محددة CK18 الأجسام المضادة8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إنشاء نموذج الماوس المزدوج أنسنة مع الكبد البشري والخلايا المناعية يمكن رصدها بسهولة في كل خطوة مع ELISA بسيطة جدا والتدفق قياس الخلايا، على التوالي. يتم إجراء قياس التدفق المنتظم لتقييم تطور جهاز المناعة الوظيفي ورؤية تأثير العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية على الخلايا المناعية. في الفئران ذات الأنسنة المزدوجة، يمكن أن تتراوح تطوير الخلايا المناعية الوظيفية من 15٪ إلى 90٪ من بوابة الخلايا الليمفاوية. وتظهر المجموعات الفرعية التمثيلية للخلايا المناعية في قطع النقاط(ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الكبد يتعرض للخطر وتلف في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية24. النماذج الحيوانية الصغيرة التجريبية لدراسة أمراض الكبد البشري في وجود فيروس نقص المناعة البشرية-1 محدودة للغاية، على الرغم من توافر عدد قليل من النماذج الحيوانية المزروعة بصورة مشتركة مع CD34+ HSPCs وخلايا الكبد7،12، 25. في التجارب المختبرية، وتظهر خلايا الكبد أن يكون منخفض المستوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 العدوى

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل منحة المعهد الوطني للصحة R24OD018546 (إلى L.Y.P. وS.G.). يود المؤلفون أن يشكروا ويزي لي، دكتوراه، للمساعدة في الإجراءات الجراحية، أماندا برانش وودز، بي.س.، يان تشنغ لعلم المناعة، أعضاء مرفق أبحاث قياس الخلايا التابع للأمم المتحدة المدير فيليب هليسلي، دكتوراه، فيكتوريا ب. سميث، ب. س. وسامانثا وول، ب. س. ، أعضاء مرفق الفحص المجهري المتقدم جانيس أ. تايلور، ب. س. وجيمس ر. تالاسكا، B.S.، للحصول على الدعم التقني. ويقر المؤلفان بالدكتورمامورو يتو وهيروشي سوميزو من وكالة الأحوال الجوية الدولية لتوفيرالفئران TK-NOG والدكتور يواكيم بومغارت لتوفير هالة التريوسولفان. ويشكر المؤلفون الدكتور أدريان كوسترز، من اللجنة، على مساهمتها التحريرية في المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
27 G1 / 2 "إبرBD biosciences305109
30 G1 / 2" إبرBD Biosciences305106
5 مل بوليسترين   ؛ أنبوب دائري القاع 12 مم × 75 مم نمطCorning352054
BD 1 مل حقنة توبركولين بدون إبرةBD العلوم البيولوجية309659
BD FACS صفيف bioanalyzer   ؛BD Biosciencesلفحص نقاء خلايا CD34+< / sup> المملوءة بالخلايا  
BD FACS صفيف البرمجياتBD BiosciencesSoftware لتحليل خلية CD34+< / sup> على مصفوفة
FACS BD FACS حلالتحلل BD Biosciences349202لتحلل خلايا الدم الحمراء
BD LSR IIBD Biosciencesأداة للحصول على عينات قياس التدفق
الخلوي BD & nbsp ؛ أنبوب جمع الدم البلاستيكي بالفراغBD biosciencesBD 367874لجمع دم الحبل
السري مصل الأبقار الألبومين   ؛Sigma-aldrichA9576
مادة خاضعة للرقابةبوبرينورفين
CD14-PEBD Biosciences555398خاص بالإنسان
CD19-BV605BD Biosciences562653خاص بمجموعة
MicroBead CD34 البشرية ،Miltenyi Biotec130-046-702لعزل   ؛   CD34 < sup > + < / sup> HSPC
CD34-PE ، الجسمMiltenyi Biotecالبشري 130-081-002المستخدم للتحقق من نقاء خلايا CD34 < sup > + < / sup>   ؛
CD3-AF700BD Biosciences557943خاص ب
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105خاص ب
CD4-APCBiosciences555349خاص ب
CD8-BV421BD Biosciencesالبشري 562428خاص
بشرائح عد الخلاياBio-rad1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue KitThermofisher CS11204 علميةلاستخراج الحمض النووي الجيني من قطعة الأذن
نظام Cobas Amplicor v1.5 & nbsp ؛Roche Molecular DiagnosticsBioanalyzer لقياس الحمل الفيروسي
أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية   McKesson24-106-2S
السيتوكيراتين -18 (CK18) DAKOM7010خاص ب
DMSO البشري (ثنائي ميثيل سلفوكسيد)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
مجموعة تمديد Microbore Slide Clamp (s) قفل لور ذكر ثابت. L: 60 بوصة L: 152 سم PV: 0.55 مل مسار السوائل معقمBD biosciences30914متصل بتوزيع الماصة وتحميلها مع HSPC و HEP suspesion
FACS Diva الإصدار 6BDBiosciences برنامج مقياس التدفق الخلوي المطلوب ل   الحصول على عينة
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Gibco10438026
برنامج تحليل FLOWJO
v10.2		FLOWJO ، LLCبرنامج تحليل قياس التدفق الخلوي
GanciclovirAPP Pharmaceuticals، Inc.315110Prescripition المخدرات
Greiner MiniCollect EDTA TubesGreiner bio-one450475
خلايا الكبد ذوبان المتوسطة مختبرات أبحاث المثلث  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip AppliersTeleflex537061لعقد مقاطع الربط
Hospira Sterile Water للحقنACE Surgical Supply Co.، Inc.001-1187لتخفيف البوبرينورفين (مسكن الألم)
كمية الألبومين البشري ELISAمختبرات البيثيلE80-129لتقييم مستويات الألبومين البشري في مصل الفئران
مثلث خلايا الكبد البشرية HUCP1  خلايا الكبد البشرية المحفوظة بالتبريد, الحث المؤهل 
مقص القزحية ، مستقيمتيد بيلا ، إنك.13295
LancetMEDIpointGoldenrod 5 mm
LS columns Miltenyi Biotec130-042-401تستخدم لاحتجاز CD34+< / sup> ميكروبيدات (اختيار إيجابي)وسيط
فصل الخلايا الليمفاوية (LSM)MP Biomedicals50494لعزل     الخلايا الليمفاوية من الدم المحيطي
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303يحمل فاصل Qudro MACS وأعمدة LS
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605يستخدم لعمل شق على الجلد لفضح الطحال
Dissecting LegpsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5157 لتثبيت وسحب الطحال من التجويف البريتوني
الماوس CD45-FITCBD Biosciences553080الخاص بالماوس
(محلول ملحي مخزن بالفوسفات)HycloneSH30256.02
فاصل Qudro MACS Miltenyi Biotec130-090-976يحمل أربعة أعمدة LS RPMI
1640 متوسطGibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR  النظمالتطبيقية المستخدمة  إلى  النمط الجيني
سلسلة السائر المتكررة الاستغناء عن ماصة 1 ملDYMAX CORPT15469المستخدمة في  الاستغناء  HSPC و HEP supension بطريقة خاضعة للرقابة
خياطة PGA خياطة امتصاصية اصطناعيةهنري شاين صحة41178خياطة الجلد والبريتونيوم
TaqMan Gene Expression Master MixThermofisher العلمي4369016
TC20 عداد الخلايا الآليBio-rad1450102
TK-NOG الفئران  مقدمة من المعهد المركزي لحيوانات التجارب (CIEA، اليابان؛ د. مامورو إيتو وهيروشي سوميزو)
TreosulfanMedac GmbHمقدمة من  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
مقص صغير من نوع Trypan BlueBio-rad1450022
Vannas، مستقيم، 80 مم LTed Pella، Inc.1346يستخدم لعمل شق على الجلد لفضح الطحال
Weck hemoclip مشابك ربط التيتانيوم التقليديةخياطة523700لربط الطحال بعد الحقن
ومسكن للألم المضاد BD البشري البشرية مجموعة مختبرات أبحاث Micro PBS أداة الحيوية

المراجع

  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820(2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817(2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

dual humanized ELISA CD34 HIV 1

مقالات ذات صلة