مقالة منهجية

تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan

DOI:

10.3791/58945

⸱

سبتمبر 7, 2019

 ,  , 
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هنا هو البروتوكول الذي يجمع بين في المختبر العصبية بطانة نظام الثقافة المشتركة والدمج الأيضي للسيالوجيكان مع المجموعات الوظيفية bioorthogonal لتوسيع الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف وتسمية سطحها البروتينات السيالوجية للتصوير أو تحليل الطيف الكتلي لعلامات سطح الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجذعية العصبية والخلايا السلف (NSPCs) هي الأساس الخلوي للهياكل المعقدة ووظائف الدماغ. وهي تقع في محاريب متخصصة في الجسم الحي ويمكن عزلها وتوسيعها في المختبر، بمثابة مورد مهم لزراعة الخلايا لإصلاح تلف الدماغ. ومع ذلك، فإن الـ NSPCs غير متجانسة وغير محددة بوضوح على المستوى الجزيئي أو يتم تنقيتها بسبب عدم وجود علامات سطح الخلية المحددة. البروتوكول المقدم، الذي تم الإبلاغ عنه سابقاً، يجمع بين نظام الثقافة المشتركة العصبية البطانة مع طريقة وضع العلامات على الغليكان الأيضي لتحديد سطح sialoglycoproteome من NSPCs الأولية. يسمح نظام الثقافة المشتركة NSPC-endothelial بالتجديد الذاتي وتوسيع المراكز الوطنية للدعم والتغذية الأولية في المختبر،مما يولد عدداً كافياً من الـ NSPCs. المجموعات الوظيفية البيوثوغنالية. من خلال مقارنة sialoglycoproteome من NSPCs التجديد الذاتي توسعت في ثقافة مشتركة بطانة مع الثقافة العصبية المختلفة، ونحن تحديد قائمة من البروتينات الغشاء التي يتم إثراء في NSPCs. وينطوي البروتوكول بالتفصيل على ما يلي: (1) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية وثقافة مختلفة؛ (2) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (2) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطان 2) وضع العلامات مع azidosugar لكل O-أسيتيل N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz)؛ و 3) البيوتين الاقتران إلى sialoglycan المعدلة للتصوير بعد تثبيت الثقافة العصبية أو استخراج البروتين من الثقافة العصبية لتحليل الطيف الكتلي. ثم يتم اختيار المرشحين علامة سطح المخصب NSPC عن طريق التحليل المقارن لبيانات قياس الطيف الكتلي من كل من NSPC الموسعة والثقافات العصبية المتمايزة. هذا البروتوكول حساس للغاية لتحديد بروتينات الغشاء ذات الوفرة المنخفضة في مواد البداية، ويمكن تطبيقه على اكتشاف العلامات في أنظمة أخرى مع التعديلات المناسبة

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تعريف الخلايا الجذعية العصبية على أنها مجموعة خلايا متعددة القوى التي يمكن تجديدها ذاتيا للحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية والتفريق في الخلايا العصبية وغليا. وهي أنواع الخلايا الرئيسية في الجهاز العصبي ويمكن أن توفر إمكانات علاجية كبيرة في الطب التجديدي من خلال زرع الخلايا في العقول المريضة والمصابة1،2. مع تقدم التنمية ، يصبح عدد الخلايا الجذعية العصبية غيرمتجانسة 3،4، وتنخفض نسبة الخلايا الجذعية العصبية في الدماغ تدريجيا5. بشكل عام، توجد الخلايا الجذعية العصبية الجنينية وغيرها من الخلايا السلف العصبية، وتسمى مجتمعة الجذعية العصبية والخلايا السلف (NSPCs)، في المناطق الإنباتية، والمنطقة البطينية، والمنطقة التحتية في الفئران6. في الدماغ الجنيني، تولد الخلايا الجذعية العصبية الخلايا العصبية بشكل مباشر أو غير مباشر من خلال خلايا السلف المتوسطة (IPCs)، وفي بعض الأنواع من خلال الذرية المنطقة الفرعية الخارجية (oRGs)7،8. التوقيع الجزيئي المحدد، مورفولوجيا، الموقع في محراب الخلايا الجذعية، وإمكانات التمايز كلها تحدد دور كل نوع فرعي في تكوين الأعضاء في الدماغ والتطبيقات السريرية9. ومع ذلك، فإن علامات سطح الخلية المتاحة حاليالا يمكن أن تميز بشكل لا لبس فيه وتنقية أنواع فرعية مختلفة من NSPCs، مما يحد من فهم واستخدام هذه الأنواع الفرعية.

ويحد من تحديد العلامات السطحية الأولية للمراكز الوطنية للدعم في مجال الحماية ثلاث عقبات رئيسية. الأول هو عدد الخلايا المحدودة من NSPCs في الأنسجة، مما يجعل من الصعب إعداد عينات بروتين سطح الخلية لتحليل قياس الطيف الكتلي المشترك. والقيد الثاني هو صعوبة إنتاج أنواع فرعية من الخلايا النقية لتوليد بيانات بروتين الغشاء الخاص بالنوع الفرعي. وأخيرا، فإن التحدي الثالث هو انخفاض نسبة البروتينات السطحية للخلايا في بروتينات الخلايا بأكملها، مما يعوق حساسياتها الكشف عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي.

للتغلب على هذه المشاكل، قمنا بتطوير نهج كيميائي لتخصيب وتحديد البروتينات السطحية للخلايا بشكل انتقائي في NSPCs الأولية عن طريق وضع العلامات الأيضية للبروتينات sialoglycoproteins10. لتوليد عدد كاف من النقاط الاستراتيجية الوطنية، استفدنا من بروتوكول راسخ لتوسيع والحفاظ على الـ NSPCs الجنينية الأولية في الدول غير المتمايزة في المختبر، من خلال المشاركة في زراعة NSPCs مع خطوط الخلايا البطانية الدماغ الماوس باستخدام دعم نفاذية مصفوفة إدراج(على سبيل المثال، transwell) نظام11. وعلى النقيض من ذلك، فإن NPSCs المستزرعة وحدها دون الخلايا البطانية تولد ذرية مختلفة11،12. وهكذا، يمكن تحليل عينات البروتين من هذين النظامين الثقافة نسبيا لتحديد البروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي في NSPCs والخلايا العصبية المتمايزة. كما يتم تعديل معظم البروتينات السطحية الخلية من قبل حمض السياليك13، غير طبيعي حمض السياليك السلائف التناظرية N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac4ManNAz) تم استخدامها لاختطاف المسار الأيضي المتأصلة بحيث الذاتية ، حديثا يتم تسمية sialoglycans توليفها مع مجموعات azido، وتوليد مقبض كيميائي14. من خلال التفاعلات الحيوية الأزيدو-الألكيين بوساطة، والتي تترافق الكائنات الحية إلى السيالوجيكانات، يمكن تصور البروتينات السطحية للخلايا وإثرائها لتحديد البروتيوميك من خلال فلوروفور أو مصفوفة14.

هنا، نقوم بتلطيخ تحليل هلام SDS-PAGE للسطح sialoglycoproteome من NSPCs الموسعة في ثقافة مشتركة بطانة وخلايا مختلفة في نظام غير ثقافة مشتركة. نحن أيضا تنقية انتقائية سطح sialoglycoproteome في نظامين الثقافة للمقارنة البروتيومية. بروتوكولنا، مقارنة مع التقليدية المستندة إلى الطرد المركزي خلية سطح البروتوكولاتتنقية 15،يزيد من فعالية استخراج عن طريق الحد من إجراءات استخراج البروتين السطحي من خلال اقتران علامة محددة وتقارب تنقيه. وفي الوقت نفسه، فإنه يزيد من نقاء استخراج البروتينات سطح الخلية على أساس فرضية أن sialylation يحدث في الغالب في البروتينات سطح الخلية. على الرغم من أن العوامل البطانية لا يمكن أن تمنع تماما التفريق بين NSPCs الموسعة، فإن الدراسة المقارنة بين الثقافة المشتركة والثقافة المتمايزة توفر طريقة ملائمة لتحديد البروتينات السطحية الغنية بالخلايا الجذعية دون الحاجة إلى تحليل البروتينات من NPCs تنقية من قبل FACS16. ونحن نعتقد أن هذا النهج يمكن تطبيقه على دراسات البروتينات السطحية في أنظمة أخرى مع التعديلات المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها) من جامعة Tsinghua وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية للIACUC. وقد تم اعتماد مرفق الحيوانات المختبرية في جامعة تسينغهوا من قبل رابطة تقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوانات الدولية). لمراحل الأجنة، تم حساب منتصف اليوم من القابس المهبلي المحدد على أنه يوم جنيني 0.5 (E0.5).

ملاحظة: يتم زراعة جميع الخلايا في حاضنة الخلية في ظل ظروف 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

1. إعداد ثقافة البطانة الماوس في إدراج دعم نفاذية

ملاحظة: يتم الحفاظ على خلايا BEND3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

  1. إعداد BEND3 خلية متوسطة (BM) عن طريق إضافة 50 مل من FBS و 5 مل من البنسلين-ستربيتوميسين في 500 مل من DMEM ومزيج جيدا.
  2. يستنشق الوسط من الطبق ويغسل ثقافة الخلايا BEND3 مع 1 مل من PBS مرة واحدة. إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA في الخلايا وحضانة الخلايا لمدة 4 دقائق في 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 1 مل من BM في الخلايا لتحييد التربسين-EDTA والماصة صعودا وهبوطا بلطف لتفكك الخلايا تماما. نقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي جديد 15 مل وبيليه عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق في 400 × ز.
  4. يستنشق supernatant من الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا مع 9 مل من BM الطازجة، ثم إضافة 1 مل من تعليق الخلية في إدراج دعم نفاذية واحدة. إضافة آخر 2 مل من BM الطازجة لكل بئر في الغرفة السفلى من المصفوفة. الاستمرار في ثقافة الخلايا ليوم واحد.

2. إعداد الماوس الابتدائية القشرية NSPCs الثقافة

  1. إعداد لوحة الثقافة، والباباين الهضم المتوسطة، والقشرية أتباع الثقافة المتوسطة (AM)
    1. طبقة 6-لوحات جيدا مع بولي-L-يسين (PLL) عن طريق إضافة 1 مل من محلول PLL في جيدا في لوحات 6 جيدا. ثم، احتضان لوحات في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. نقل الحل PLL في أنبوب مخروطي 15 مل. غسل لوحات 3 مرات مع الماء المقطر مزدوجة. تجفيف الأطباق ووضعها جانبا حتى استخدامها.
    3. إعداد وسط هضم البابين عن طريق إضافة 50 U من البابين، 50 درجة مئوية من L-الجلوتامين، و 50 ميكرولتر من 100 ملغ / مل أسيتيل-L-سيستين في 5 مل من DMEM. اخلطي المتوسط لفترة وجيزة وسخنيه إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتنشيط الإنزيم.
    4. إعداد الخلية القشرية التمسك الثقافة المتوسطة (AM): إضافة 500 ميكرولتر من L-الجلوتامين، 500 ميكرولتر من بيروفات الصوديوم، 500 ميكرولتر من 100 ملغ / مل N-أسيتيل-L-سيستين، 500 ميكرولتر من N2، 1 مل من B27، و 5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل bFGF في 50 مل من DMEM. يُمزج المزيج المتوسط جيداً ويُسخّن إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. إعداد الخلايا القشرية الدماغية الأولية والطلاء اللاحق
    1. التضحية بفأر حامل E10.5 موقوتة عن طريق خلع عنق الرحم.
      ملاحظة: في E10.5، تنتشر غالبية الخلايا NSPCs في القشرة الدماغية، مما يؤدي إلى استنساخ كبيرة من ذرية في المختبر.
    2. تعقيم البطن بنسبة 75٪ الإيثانول. استخدام مقص غرامة وملقط مسننة صغيرة لفتح البطن عن طريق قطع الجلد والعضلات الكامنة على طول الجانب الأيمن من الخط الأوسط. إزالة الرحم من تجويف البطن بلطف مع ملقط مسننة وقطع من تجويف البطن مع مقص غرامة.
    3. اغسل الرحم بـ 40 مل من HBSS قبل التبريد في طبق بيتري 10 سم. ثم نقل الرحم إلى طبق بيتري جديد 10 سم وغسله مرة أخرى مع 40 مل من HBSS المبردة مسبقا.
    4. نقل الرحم إلى طبق بيتري جديد 10 سم مع 40 مل من HBSS المبردة مسبقا. إزالة الأجنة من الرحم والغشاء السلوي، ثم قطع رؤوس الأجنة قبالة من جذوع مع microforceps المجوهرات.
    5. اغسل الرؤوس بـ 40 مل من HBSS pre-chills ونقل الرؤوس إلى طبق بيتري جديد 10 سم مع 40 مل من HBSS قبل المبردة. استخدام microforceps المجوهرات لقشر الجلد والغضاريف التي تغطي العقول، ثم قطع القشريات الدماغية قبالة وجمعها في أنبوب مخروطي 15 مل مع HBSS قبل المبردة.
    6. بيليه القشرية عن طريق الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية و 300 × ز. يستنشق supernatant من الأنبوب، ثم إضافة تنشيط الباباين الهضم المتوسطة و 15 درجة مئوية من 4 ملغ / مل DNase الأول في بيليه الأنسجة.
    7. إعادة تعليق بيليه الأنسجة لفترة وجيزة عن طريق دوامة لطيف. حضانة الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الوقت، تخفيف الأنسجة عن طريق دوامة قصيرة كل 10 دقيقة.
      ملاحظة: في نهاية عملية الهضم ، يجب ألا تكون هناك قطع أنسجة مرئية في الأنبوب.
    8. بيليه الخلايا القشرية عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية و 450 × ز. يستنشق supernatant من الأنبوب وغسل بيليه الخلية مع DMEM المبردة مسبقا. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
      ملاحظة: أثناء الهضم والغسيل، وتوخي الحذر من ماصة الأنسجة وخلية بيليه تقريبا لتجنب الإضرار الخلايا مع قوة قص قوية.
    9. قم بإستقان الـ supernatant من الأنبوب ثم أضف 1.5 مل من HBSS المبردة مسبقًا إلى الأنبوب. فصل بيليه الخلية القشرية في خلايا واحدة مع الأنابيب لطيف. عد رقم الزنزانة بمقياس الهيموكيتومات.
    10. إضافة 2 مل من AM و 2 × 104 الخلايا القشرية في جيدا في لوحات 6 جيدا. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 3 ساعة للسماح للخلايا نعلق على لوحة.

3. إنشاء العصبية بطانة الثقافة المشتركة وAc4ManNAz نظام وضع العلامات

  1. يوم واحد بعد طلاء BEND3 الخلايا في إدراج، يستنشق بلطف المتوسطة في الغرفة السفلى أولا، ثم إدراج. اغسل يُغلى الإدراج 3 مرات مع DMEM المُسخّن مسبقاً. اغسل السطح الخارجي للإدراج عن طريق الفرّة مع DMEM الدافئة مسبقاً.
  2. إضافة 1 مل من AM pre-warmed في إدراج واحد، ثم نقل إدراج في الآبار مع الخلايا القشرية الأولية. احتضان الثقافة المشتركة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 12 ساعة.
  3. حل Ac4ManNAz في DMSO لتحقيق تركيز المخزون من 200 mM. 12 ح بعد إعداد العصبية بطانة الثقافة المشتركة، إضافة 1 درجة مئوية من Ac4ManNAz الأسهم لكل غرفة أسفل و 0.5 درجة مئوية من المخزون لكل إدراج في الثقافة المشتركة. تُرج الأطباق على الفور وبلطف لخلط المتوسطة جيداً. بالنسبة لخلايا التحكم، أضف وحدة تخزين متساوية من DMSO.
  4. زراعة الخلايا لمدة 5 أيام أخرى في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. إعداد AM مع 10x bFGF كوسيلة إعادة التغذية (RM). خلال هذا الوقت، إضافة 100 درجة مئوية من RM لكل إدراج و 200 درجة مئوية من RM لكل غرفة أسفل لإعادة تغذية الخلايا البطانية والعصبية كل يوم. أثناء ال [رفيد], لا يزوّد [أك]4[منز] أو [دمسو] داخل الثقافة.

4. تلطيخ الفلورسنت المناعي من البروتينات السيالوجية في NSPCs الأولية الموسعة والخلايا العصبية المتمايزة

  1. إعداد BTTAA-CuSO4 مجمع 1 30X الأسهم التي تحتوي على 1.5 MM CuSO4 و 9 M BTTAA في الماء المقطر المزدوج. إعداد جديد البيوتين المترافق العازلة 1 التي تحتوي على 50 ميكرومتر البيوتين الألكيين، 2.5 مليون متر أسكوربات الصوديوم، و 1X BTTAA-CuSO4 مجمع في PBS.
  2. قم بإزالة الإدراجات من لوحات الثقافة المشتركة. يستنشق وسط الثقافة من الآبار السفلية ويغسل الخلايا العصبية مرة واحدة مع PBS قبل تسخينها.
  3. إستنشق الـ(بي بي إس) من الآبار إضافة 1 مل من قبل المبردة 4٪ بارافورماللديهايد PBS الحل في جيدا في الخلايا وإصلاح الخلايا في RT لمدة 10 دقيقة. ثم، وغسل الخلايا 3 مرات مع PBS المبردة مسبقا.
  4. يستنشق PBS من الآبار وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت الملتصق بالبيوتين الطازج 1 لكل بئر في الخلايا. حضانة الخلايا في RT لمدة 10 دقائق.
  5. يستنشق العازلة رد الفعل من الآبار. غسل الخلايا 3 مرات مع PBS. إعداد العازلة تلطيخ تحتوي على 1٪ FBS و 1 ميكروغرام / مل اليكسا فلور 647-streptavidin. إضافة 1 مل من وصمة عار العازلة في جيدا في الخلايا وحضانة الخلايا في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. قم بإستئني المخزن المؤقت التلطيخ من الآبار والخلايا المغسولة 3 مرات مع PBS المبردة مسبقاً. إعداد العازلة حظر تحتوي على 5٪ BSA و 0.3٪ المنظفات غير الأيونية-100 في PBS. إضافة 1 مل من حظر العازلة في جيدا في الخلايا وحضانة في RT لمدة 10 دقيقة.
  7. إعداد حل الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة للعش والمضادة لبيتا توبولين الثالث معا في العازلة حظر بنسب 1:20 و 1:1000، على التوالي. إزالة المخزن المؤقت حظر من الآبار وإضافة 1 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسية لكل بئر في الخلايا. حضانة الخلايا في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  8. إزالة الحل الأساسي الأجسام المضادة من الآبار. غسل الخلايا 3 مرات مع PBS المبردة مسبقا. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس IgG1، اليكسا فلور 546 الماعز المضادة للماوس IgG2b، وDAPI معا في حظر العازلة في تخفيف 1:1000. يستنشق PBS من الآبار وإضافة 1 مل حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر في الخلايا. حضانة الخلايا في RT لمدة 2 ساعة.
  9. قم بإستئني محلول الأجسام المضادة من الآبار واغسل الخلايا 3 مرات مع PBS المبردة مسبقاً. بعد ذلك، تكون الخلايا جاهزة لالتقاط الصور.

5. تنقية البروتينات Sialoglyco من NSPCs الأولية الموسعة والخلايا العصبية المتمايزة

  1. إعداد BTTAA-CuSO4 مجمع 2 15X الأسهم التي تحتوي على 1.5 mM CuSO4 و 3 M M BTTAA في الماء المقطر مزدوجة. إعداد البروتين إعادة تعليق العازلة A تحتوي على 4٪ SDS و 10 MM EDTA في الماء المقطر مزدوجة؛ البروتين إعادة تعليق العازلة B تحتوي على 150 مل كلوريد الفينيل، 50 mM ثلاثي إيثانولامين، و 1٪ بوليأوكسي إيثيلين أوليل الأثير (على سبيل المثال، Brij97) في الماء المقطر مزدوجة مع درجة الحموضة 7.4. قبل الاستخدام، قم بخلط المخزن المؤقت A:buffer B = 1:8 (vol/vol) لإعداد المخزن المؤقت لإعادة تعليق البروتين الكامل. إعداد البروتين غسل العازلة 1 التي تحتوي على 2٪ SDS في PBS. بروتين غسل العازلة 2 التي تحتوي على 8 M اليوريا في 250 mM بيكربونات الأمونيوم (ABC)؛ والبروتين غسل العازلة 3 التي تحتوي على 2.5 M NaCl في PBS.
  2. قم بإزالة الإدراجات من لوحات الثقافة المشتركة. يستنشق وسط الثقافة من الآبار السفلية ويغسل الخلايا العصبية مرة واحدة مع PBS المبردة مسبقا.
  3. قم بإستئني الـ PBS من الآبار وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA المبرد مسبقًا لكل بئر في الأطباق. احتضان لوحات على الجليد لمدة 5 دقائق. بيليه الحطام الخلية عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية و 12،000 × ز.
  4. نقل supernatant إلى أنابيب جديدة 1.5 مل. تحديد تركيز البروتين مع مجموعة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ضبط تركيز البروتين إلى 1 ملغ / مل.
  5. إضافة 100 م ألكيين البيوتين، 2.5 مليون متر أسكوربات الصوديوم، و 1X BTTAA-CuSO4 مجمع 2 إلى 1 مل من تحلل البروتين وخلط الحل جيدا. احتضان المزيج في RT لمدة 1 ساعة.
  6. نقل حل رد الفعل في 20 مل من الميثانول المبردة مسبقا في أنبوب مخروطي 50 مل. يُخلط المزيج جيداً ويُحضن عند -30 درجة مئوية بين عشية وضحاها للتعجيل بالبروتينات.
  7. بيليه البروتين يعجل بالطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية و 4500 × ز. اغسل يبيليه البروتين مرتين مع 20 مل من الميثانول المبردة مسبقا. يستنشق الـ"سوبرناينت" من الأنبوب إعادة تعليق بيليه البروتين مع 4 مل من البروتين إعادة تعليق العازلة ونقل البروتين تعليق في أنبوب مخروطي جديد 15 مل.
  8. خذ 50 ميكرولتر من حبات streptavidin وغسلها 3 مرات مع PBS. إضافة الخرز غسلها في إعادة تعليق البروتين. احتضان الحل في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعة على الدوار الرأسي بسرعة دوران 20 دورة في الدقيقة.
  9. غسل الخرز بالتتابع مع 6 أنواع من المخازن المؤقتة: البروتين غسل العازلة 1، البروتين غسل العازلة 2، البروتين غسل العازلة 3، 0.5 M ABC، 0.25 M ABC و 0.05 M ABC.
  10. بعد الغسيل، إعادة تعليق الخرز مع 20 درجة مئوية من PBS ونقل الخرز إلى أنبوب جديد 1.5 مل. إضافة 20 درجة مئوية من 2X البروتين تحميل العازلة في الخرز وعلاج في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم يجب أن تخضع عينات البروتين إلى SDS-PAGE وملطخة مع Coomassie الأزرق الرائع R-250 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قطع البروتينات في هلام كما هو مبين من قبل Coomassie الأزرق اللامع R-250 لتحليل الطيف الكتلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراء الكامل للتوسع في المختبر ووضع العلامات الأيضية من NSPCs الجنينية الأولية يستغرق 6 أيام(الشكل 1A). جودة خط الخلية BEND3 وNSPCs الأولية المعزولة حديثا هي المفتاح لتجربة ناجحة. خلايا BEND3 هي مصدر العوامل القابلة للذوبان التي تحفز التجديد الذاتي وانتشار الشركات غير القابلة للذوبان. وينبغي التأكد من أن الخلايا BEND3 خالية من أي تلوث وتقسيم بنشاط مع الحد الأدنى من موت الخلايا قبل المشاركة في زراعة الخلايا العصبية. ويجب أن تكون المراكز الوطنية للدعم في مجال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم عادة علامات السطح لتسمية وتنقية أنواع محددة من الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي17،18. اكتشاف علامات السطح يساهم إلى حد كبير في الطب التجديدي وأبحاث الخلايا الجذعية من خلال توفير الأدوات الجزيئية لإثراء انتقائي لسكان الخلايا الجذعية من الأنسجة العادية أو المرضية وأطباق الثقافة، وتقديم خلية نقية الموارد للاستخدام السريري أو دراسة الخصائص البيولوجية. ومع ذلك، كان التقدم في تطوير علامات السطح لبحوث الخلايا الجذعية العصبية بطيئا بسبب صعوبة في عزل الخلايا الجذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 1 باء و 1 جيم و 1 هاء و 1 واو مستنسخة من باي وآخرون . 10 سنوات بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. نشكر يي هاو في مختبر X.C. لتحرير الرقم. ويدعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 91753206 إلى Q. S. وX.C., No. 31371093 to Q.S., and Nos. 21425204 and 21672013 to X. C.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BEND3ATCCCRL-229
DMEMGibco11960044
L-glutamineGibco250300811٪
بيروفات الصوديومSigmaP52801٪
N2 مكملGibco175020481 إلى 100
N-acetyl-L-cysteineSigmaA72501 ملي غراء
ورثينجتونLS00372610 وحدة / مل
B27 مكملغذائي جيبكو175040441 إلى 50
بولي إل ليسينسيجماP4707
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسيةجيبكوPHG026110 نانوغرام / مل
بنسلين ستربتومايسينجيبكو151401221٪
مصل الأبقار الجنينيجيبكو1009914110٪
HBSSGibco14175095
Tripsin-EDTA ، 0.25٪Gibco25200056
DPBSGibco14190094
TranswellCorning3450
ParaformaldehydeSigma1581274٪
SucroseSangonA100335
DAPIGibco62248
RIPA عازلةThermo Scientific89900
SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت 2xSolarbioP1018
6-well plateCorning3335
Tris-Glycine protein gelinvitrogenxp00100box
Mouse أحادي النسيلة المضاد لدراسةالنمو Nestin Hybridoma BankRat-4011 إلى 20
الفأر أحادي النسيلة المضاد للبيتا توبولين IIISigmaT88601 إلى 1,000
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG1invitrogenA-211211 إلى 1,000
Alexa Fluor 546 الماعز المضاد للفأر IgG2binvitrogenA-211431 إلى 1,000
الألبومين البقري VAmresco0332
Triton X-100Amresco0694
BCA طقم الفحصThermo Scientific23225
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSigmaD2650
Brij97علاء الدينB129088
CuSO4< / sub>Sigma209198
ألكين البيوتينانقر فوق أدوات الكيمياءTA105
BTTAAانقر فوق أدوات الكيمياء1236
Ac4ManNAzانقر فوق أدوات الكيمياء1084100 & M
9AzSiaمركبة في المختبر
أسكوربات الصوديومSigmaA4034
الميثانولSigma34860
EDTASangonA100322
NaClSangonA100241
SDSSangonA100227
Alexa Flour 647-strreptavidinالمترافقinvitrogenS213741 إلى 1,000
TriethanolamineSigmaV900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen60210
بيكربونات الأمونيومSigma9830
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Scientific20278
IsofluraneRWD Life Science Co.970-00026-00
DNase ISigmaDN2512 & micro; جم / مل
اليورياسيجماU5378

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365(2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة