مقالة منهجية

بوليومافيروس خلية ميركل العدوى والكشف

DOI:

10.3791/58950

⸱

فبراير 7, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لتصيب الابتدائي تنتجها من الخلايا الجلدية البشرية الليفية مع MCPyV. يشمل البروتوكول عزل الخلايا الليفية الجلدية، وإعداد فيريونس MCPyV والإصابة بعدوى الفيروس، وتلطيخ الفلورة والأسفار في التهجين الموقعي. ويمكن تمديد هذا البروتوكول وصف التفاعلات MCPyV-المضيف واكتشاف أنواع الخلايا الأخرى إينفيكتابل ب MCPyV.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تؤدي الإصابة polyomavirus (MCPyV) خلية ميركل إلى ميركل سرطان الخلية (MCC)، أحد أشكال سرطان الجلد شديدة عدوانية. الدراسات الميكانيكية إجراء تحقيقات كاملة في البيولوجيا الجزيئية MCPyV وآليات النمطان أعيقت بعدم وجود نماذج ثقافة الخلية الملائمة. وهنا يصف لنا مجموعة من البروتوكولات لأداء، واكتشاف الإصابة MCPyV خلايا الجلد البشرية الأساسية. وصف البروتوكولات عزلة الليفية الجلدية البشرية، إعداد فيريونس MCPyV المؤتلف، والكشف عن الإصابة بالفيروس تلطيخ (إذا كان) إيممونوفلوريسسينت وفي الموقع التهجين الحمض النووي سلسلة من ردود الفعل (HCR)، التي هي درجة عالية من الحساسية الأسفار في نهج الموقع التهجين (الأسماك). يمكن تكييفها مع البروتوكولات الملحقة هذه الوثيقة من الباحثين المهتمين التعرف على أنواع الخلايا أو خطوط الخلايا التي تدعم MCPyV العدوى الأخرى. وصف نهج الأسماك يمكن تكييفها أيضا للكشف عن مستويات منخفضة من السلطات الوطنية المعينة موجودة في جلد الإنسان المصابة الفيروسية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميركل خلية polyomavirus (MCPyV) هو فيروس الحمض النووي الصغيرة، مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي تم إقرانها مع سرطان جلد نادرة ولكن العدوانية، ميركل الخلية الكبدية (MCC)1،2. يتجاوز معدل الوفيات من لجنة التنسيق الإداري، حوالي 33%، سرطان الجلد3،4. وقد MCPyV جينوم دائرية ~ 5 كيلو بايت1،5 جزئين حسب منطقة تنظيمية غير الترميز (نكر) في أوائل وأواخر ترميز المناطق1. نكر يحتوي على أصل الفيروسية النسخ المتماثل (أوري) والمروجين ثنائي الاتجاه للنسخ الفيروسي6،7. المنطقة أوائل يشفر البروتينات مستضد ورم دعا كبير تي (LT)، تي الصغيرة (ش)، 57kT، ORF الملازم البديلة (ألتو)، فضلا عن أوتوريجولاتوري ميرنا1،،من89،10. ترميز المنطقة أواخر بروتينات قفيصه VP1 و VP211،،من1213. الملازم وشارع البروتينات MCPyV أفضل درس وأظهرت دعما لتكرار الحمض النووي الفيروسي والمستحثه MCPyV tumorigenesis5. ومن المرجح الاستنساخ إدماج MCPyV الدنا في الجينوم المضيفة، وقد لوحظ في تصل إلى 80 في المائة من مراكز مراقبة الرحلات، عاملاً سببياً للمصابات بفيروس الورم التنمية14،15.

حالات الإصابة بلجنة التنسيق الإداري ثلاثة إضعاف على مدى السنوات العشرين الماضية16. أعراض الإصابة MCPyV أيضا على نطاق واسع في عموم السكان17،،من1819. مع تزايد عدد التشخيصات لجنة التنسيق الإداري وتفشي العدوى MCPyV، هناك حاجة إلى تحسين فهمنا للفيروس وإمكاناتها النمطان. ومع ذلك، يظل العديد من جوانب البيولوجيا MCPyV وآليات النمطان غير مفهومة20. هذا إلى حد كبير لأن MCPyV يتطابق سيئة في الخلية أنشئت خطوط11،12،21،،من2223 ، وحتى وقت قريب، خلايا قادرة على دعم MCPyV الجلد ولم تكن الإصابة اكتشفت22. قد عرقلت الدراسات الميكانيكية للتحقيق الكامل MCPyV وتفاعلها مع الخلايا المضيفة بالافتقار إلى نظام الثقافة خلية لنشر الفيروسات5.

فقد اكتشفنا أن الليفية الجلدية البشرية الأولية (هي) المعزولة من القلفة البشرية الولدان دعم قوي MCPyV العدوى على حد سواء في المختبر و السابقين فيفو24. من هذه الدراسة، قمنا بإنشاء أول خلية ثقافة العدوى نموذج MCPyV24. وبناء على هذا النظام النموذجي، واظهرنا أن استحثاث جينات أية (MMP) مصفوفة من WNT/بيتا-كاتينين إشارات الطريق وغيرها من عوامل النمو يحفز الإصابة MCPyV. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن تراميتينيب خصم مجاهدي خلق التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير يعوق فعالية MCPyV العدوى5،25. من هذه الدراسات، كما أنشأنا مجموعة من البروتوكولات لعزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية24،25، إعداد MCPyV فيريونس11،12، أداء MCPyV العدوى في الخلايا الليفية الجلد البشري 24 , 25 وكشف MCPyV البروتينات التي إذا المصبوغة26. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تكييفها في الموقع الحمض النووي التهجين سلسلة من ردود الفعل (HCR) التكنولوجيا27 لتطوير تقنية أسماك حساسة للغاية (HCR-الحمض النووي الأسماك) للكشف عن MCPyV الحمض النووي في خلايا الجلد البشرية المصابة. هذه الأساليب الجديدة سوف تكون مفيدة لدراسة دورة المعدية MCPyV، فضلا عن الاستجابة الخلوية للإصابة MCPyV. الخلايا الخزان المضيفة الطبيعية التي تحافظ على العدوى MCPyV والخلايا التي تؤدي إلى أورام لجنة التنسيق الإداري ما زال مجهولاً. يمكن تطبيق التقنيات يصف لنا في هذه المخطوطة دراسة أنواع مختلفة من الخلايا البشرية لتحديد الخلايا الخزان ومنشأ الأورام لجنة التنسيق الإداري. يمكن أيضا استخدام اساليبنا المتبعة، مثل "الأسماك" HCR-الحمض النووي، وفي الكشف عن فيروسات الورم الحمض النووي الأخرى ووصف التفاعلات الخلية المضيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتم الحصول على فوريسكينس حديثي الولادة البشرية من مركز أبحاث الأمراض الجلدية بنسلفانيا. تم الحصول على الكبار الليفية البشرية من التخلص من الجلد الطبيعي بعد الجراحة. ووافق جميع البروتوكولات الملحقة بجامعة "بنسلفانيا مجلس المراجعة المؤسسية".

1-عزل الخلايا الليفية الجلد البشري

  1. استخدام مقص لتقليم قبالة النسيج تحت الجلد والدهون من القلفة الولدان البشرية وقطع العينة الجلد في إنصاف أو أرباع.
  2. احتضان الأنسجة في 5 مل من 10 ملغ/مل ديسباسي الثاني في برنامج تلفزيوني وتستكمل مع مضاد حيوي فطري في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  3. في صحن معقم 10 سم، منفصلة بعناية البشرة من طبقات الجلد باستخدام الملقط ميكروديسيكتيون.
  4. نقل الأنسجة الجلدية الناتجة إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 5 مل من 2 مغ/مل كولاجيناز اكتب الرابع المتوسط خالية من FBS وتستكمل مع مضاد حيوي فطري.
  5. احتضان العينة في 37 درجة مئوية في 5% CO2 لح 4-6 مع تهز الدوري حتى تبقى عدد قليل الأنسجة العيانية المجاميع.
  6. بيان بيبيتينج صعودا وهبوطاً (تريتوراتينج) بقوة عشر مرات ماصة 10 مل خلايا مفردة من الأدمة.
  7. الطرد المركزي في 180 x ز لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
  8. لوحة الخلايا ينتابها المتوسط دميم وتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% 1% لالجلوتامين في 37 درجة مئوية في 5% CO2.

2-المؤتلف إعداد virion MCPyV

  1. خلاصة 50 ميكروغرام من بلازميد pR17b (التي تحمل الجينوم MCPyV) مع 250 يو من بامهي-التردد في وحدة تخزين 200 ميليلتر (ح 4 في 37 درجة مئوية) لفصل الجينوم الفيروسي من ناقلات العمود الفقري (الشكل 2).
  2. إضافة 1200 ميليلتر من المخزن المؤقت PB (تستكمل مع 10 ميليلتر من 3 م NaAc، pH 5.2) للحمض النووي هضمها وتنقية أعمدة الدوران مينيبريب ما يزيد على 2 (20 ميكروغرام قدرة الحمض النووي). الوت بلازميد هضمها pR17b من كل عمود مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، pH8.0، يدتا 1 مم).
  3. إعداد رد فعل ربط في أنبوب الطرد مركزي 50 مل. إضافة 400 ميليلتر لتنقية بلازميد الحمض النووي من الخطوة 2، 2، 8.6 مل x T4 1.05 ليجاسى المخزن المؤقت و 6 ميليلتر من ليجاسى ارتفاع تركيز T4. احتضان في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. إضافة 45 مل من المخزن المؤقت PB (تستكمل مع 10 ميليلتر من 3 م NaAc، pH 5.2) إلى عملية ربط واستخدام مشعب فراغ لتحميل من خلال أعمدة الدوران مينيبريب 2. الوت كل عمود مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. ويتوقع عائد من حوالي 30 ميكروغرام للحمض النووي.
  5. في وقت متأخر بعد الظهر/المساء، طبق البذور 6 × 106 293TT28 الخلايا إلى 10 سم تحتوي على دميم المتوسطة وتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% 1% لتر-الجلوتامين دون هيجروميسين باء
  6. في صباح اليوم التالي، التأكد من أن الخلايا هي حوالي 50% المتلاقية. ترانسفيكت باستخدام ميليلتر 66 من تعداء كاشف (1.1 ميليلتر/سم2)، 12 ميكروغرام من MCPyV الواصلة إعادة عزل الحمض النووي R17b من الخطوة 2، 4، 8.4 ميكروغرام من ش التعبير بلازميد بمتب و 9.6 ميكروغرام من الملازم التعبير بلازميد بادل *29.
  7. عندما تكون الخلايا transfected المتلاقية تقريبا، وفي اليوم التالي، تريبسينيزي الخلايا ونقلها إلى طبق 15 سم لاستمرار التوسع.
  8. بشكل اختياري اتخاذ عدد قليل من الخلايا 293TT على التوسع وأداء إذا تلطيخ للملازم MCPyV (CM2B4) و VP1 (MCV VP1 الأرنب30) لتحديد كفاءة تعداء. في هذه المرحلة، قد تكون نووية الملازم إشارة مرئية ولكن التعبير VP1 ربما لن تكون قابلة للكشف.
  9. عندما يصبح الطبق 15 سم تقريبا روافد (عادة 5-6 أيام بعد تعداء الأولية)، تحويل الخلايا إلى ثلاثة أطباق 15 سم. حصاد الخلايا من الأطباق 15 سم عندما تصبح تقريبا المتلاقية ويتبع البروتوكول الحصاد الفيروسات أدناه.
    ملاحظة: بشكل اختياري تنفيذ مراقبة الجودة إذا كما هو موضح في الخطوة 2.8. ينبغي أن تكون معظم الخلايا MCPyV LT و VP1 إيجابية في هذه المرحلة.
  10. حصاد الفيروس، تريبسينيزي الخلايا، وتدور في 180 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وإزالة المادة طافية. إضافة خلية واحدة بيليه حجم دببس-ملغ (دببس مع 9.5 مم مجكل2 و 1 x مضاد حيوي فطري). قم بإضافة كبريتات الأمونيوم 25 مم (من 1 م الأس الهيدروجيني 9 حل أسهم) تليها 0.5% X-100 تريتون (من 10% أسهم حلاً)، 0.1% بينزوناسي و 0.1% من "الدناز" ATP-تعتمد على. يخلط جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  11. احتضان المخلوط لمدة 15 دقيقة على الجليد ومن ثم إضافة حجم 0.17 5 م كلوريد الصوديوم. خلط واحتضان على الجليد لآخر 15 دقيقة تدور لمدة 10 دقيقة في س 12,000 ز في الطرد مركزي 4 درجات مئوية. إذا لم تكن المادة طافية واضحة، برفق عكس الأنبوب وكرر الخطوة الغزل. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
  12. ريسوسبيند بيليه باستخدام وحدة تخزين واحدة من دببس وتستكمل مع 0.8 م كلوريد الصوديوم، وتدور مرة أخرى، كما هو موضح في الخطوة 2.11.
  13. الجمع بين سوبيرناتانتس من الخطوة 2.11 و 2.12، وتدور أكثر من مرة واحدة كما هو موضح في الخطوة 2.11.
  14. في رقيقة الجدار 5 مل بوليالومير أنابيب صب تدرجات إيوديكسانول من أونديرلايينج (33%، 27%، ثم 39 في المائة) ~0.7 مل خطوات استخدام المحاقن 3 مل مزودة بإبرة طويلة أو ماصة p1000.
  15. تحميل 3 مل من توضيح المادة المحتوية على الفيروس طافية على استعداد إيوديكسانول التدرج.
  16. تدور عن 3.5 ح في س 234,000 ز و 16 درجة مئوية في دوار SW55ti. تعيين التسارع والتباطؤ بطء.
  17. بعد تنبيذ فائق، جمع 12 الكسور في أنابيب سيليكونيزيد (كل جزء هو ~ 400 ميليلتر).
  18. تحليل الكسور لوجود فيروس بكاشف دسدنا و/أو لطخة غربية ل VP1 (MCV VP1 الأرنب30). تجمع الكسور التدرج مع ذروة دسدنا و/أو محتوى VP1 وتميز المخزون قبل PCR الكمي لحساب الجينوم الفيروسي أي ما يعادل31. تخزين MCPyV virion المخزون في-80 درجة مئوية.

3-العدوى

  1. الحفاظ على الابتدائي الليفية الجلدية البشرية في دميم مع مصل العجل الجنين 10%، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% و 1% لتر-الجلوتامين. عند الوصول إلى التقاء، انقسام الخلايا الليفية 1:4 دون الغزل إلى أسفل.
    ملاحظة: لأعلى كفاءة الإصابة MCPyV، استخدام الخلايا الليفية الأولية بين 5 و 12 أن يتم تقسيم نشاط في الوقت لطلاء الممرات.
  2. لتصيب الإنسان الليفية الجلدية، نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع دببس.
  3. أضف 1 مل من 0.05% التربسين-أدتا إلى الطبق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  4. فحص تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي نزوله الطبق.
  5. أضف 10 مل من DMEM/F12 المتوسطة التي تحتوي على 20 نانوغرام/مل مماثلة، 20 نانوغرام/مل بفجف و 3 ميكرومتر CHIR99021، كل منها حفز MCPyV الإصابة24، إلى الطبق ونقل الحل خلية في أنبوب 15 مل.
  6. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 180 س ز 2 دقيقة، وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في المتوسط DMEM/F12 تحتوي على 20 نانوغرام/مليلتر مماثلة، 20 نانوغرام/مل بفجف و 3µM CHIR99021 2-4 × 104 خلايا كل مل.
  7. البذور 200 ميليلتر من تعليق خلية تستكمل مع 1 ملغ/مل كولاجيناز النوع الرابع في كل بئر من صفيحة 96-جيدا. ذوبان الجليد MCPyV virion الأسهم على الجليد. إضافة 109 الجينوم الفيروسي مكافئات فيريونس MCPyV (المحسوبة في الخطوة 2.18) كل 1 ميليلتر من إيوديكسانول لكل الخلايا 2,500 إلى 5000 للإصابة.   اضغط على الجانب من اللوحة برفق ووضع اللوحة في الحاضنة.
  8. تضاف بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 لح 48-72، 20% FBS لكل بئر.
  9. السماح بالعدوى إلى المضي قدما في 37 درجة مئوية في 5% CO2 لح 72-96.

4-تلوين إيمونوفلوريسسينت

  1. إصلاح الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 9 مع بارافورمالدهيد 3% في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
  2. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين.
  3. احتضان الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لحجب permeabilization (0.5% X-100 تريتون، جيش صرب البوسنة 3% في برنامج تلفزيوني تصفيتها عن طريق 0.22 ميكرومتر تصفية) في RT ح 1.
  4. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية التالية: الفأر الملازم MCPyV مكافحة [مونوكلونل] (CM2B4) (1: 1000) والارنب MCPyV مكافحة [بولكلونل] جسم VP1 (1:2000)، في RT ح 3.
  5. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  6. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية: 594 فلور الماعز الماوس المضادة IgG (1: 1000) وفلور 488 الماعز المضادة الأرنب مفتش (1: 500) على RT ح 1.
  7. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  8. كونتيرستين الخلايا مع 0.5 ميكروغرام/مل DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، هيدروكلوريد).
  9. جبل كوفيرسليبس على الزجاج الشرائح وتحليل استخدام مجهر مقلوب الأسفار.

5-في الموقع الحمض النووي-المجلس الأعلى للجمهورية

ملاحظة: يتطلب هذا الأسلوب أن يكون المصنف الخلايا في كوفيرسليبس. لهذا الغرض، قد الارتقاء بالإصابة بالشروط الموضحة أعلاه (الخطوة 3)، على شكل لوحة 24-جيدا.

  1. إصلاح الخلايا المستزرعة في كوفيرسليبس مع 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة أغسل كوفيرسليبس مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم تعاملهم مع الإيثانول 70% بيرميبيليزي الخلايا عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يمكن أن تظل عينات الثابتة في هذه الدولة لعدة أيام.
  2. قبل هجن عينات الاستعاضة عن الإيثانول بمسبار التهجين المخزن المؤقت وحضانة لمدة 60 دقيقة في الرايت
  3. تمييع probe(s) (1 ميكرومتر) (الجدول 1) في التهجين مسبار المخزن المؤقت الحل في تمييع 1: 500 30 دقيقة قبل نهاية الخطوة السابقة التهجين واحتضان عند 45 درجة مئوية.
  4. في نهاية إينكوباتيونس، "الماصة؛" ~ 10 ميكروليتر من هذا المزيج المخفف المسبار كل ساترة على شرائح المجهر. مكان كوفيرسليبس، جانب الخلية إلى أسفل، على بهم قطرات كل منهما من مسبار التهجين مزيج. ختم الحواف وظهورهم كوفيرسليبس على الشرائح مع ليبرالية مبلغ الأسمنت والمطاط.
  5. الحرارة الشرائح مع تحقيقات إضافية في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق عن طريق تحديد الشرائح على الجانب المسطح من كتلة الحرارة. نقل الشرائح إلى دائرة هوميديفيد واحتضان عند 45 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لجعل غرفة هوميديفيد بسيطة، يثبط طفيفة مناشف ورقية معقمة مع dH2س ومكان في الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك أن الأختام مع طوقا مطاط.
    ملاحظة: أثناء تدفئة الأسمنت المطاط يمكن فقاعة بإيجاز. ومع ذلك، ضمان أن لا يكسر الختم.
  6. عناية قشر بعيداً من الأسمنت المطاطي بالملقط ووضع الجانب الخلية كوفيرسليبس حتى الظهر في آبار صفيحة 24-جيدا. أغسل كوفيرسليبس بمسبار يغسل المخزن المؤقت في الرايت ثلاث مرات.
  7. احتضان ساترة في المخزن المؤقت للتضخيم (200 ميليلتر في لوحات 24-جيدا) في الرايت 30-60 دقيقة.
  8. يصلب في الوقت نفسه، كل من دبابيس الشعر المسمى اليغنوكليوتيد هما الاعتراف بالمسابير (الجدول 1) في أنابيب PCR منفصلة بالتدفئة إلى 94 درجة مئوية ل 90 s وتبريد RT لمدة 30 دقيقة مع حماية من الضوء. مزيج من دبابيس الشعر اثنين في المخزن المؤقت للتضخيم، كل منهما في إضعاف 01:50.
  9. جعل سطح لرد فعل التضخيم التي تمتد البارافين الفيلم على وجه فتح غطاء لوحة 24-جيدا. "الماصة؛" 50-100 ميليلتر قطرات من الخليط دبوس/التضخيم المخزن المؤقت على الفيلم البارافين لكل ساترة. استخدام الملقط لإزالة كوفيرسليبس عناية من الحل قبل التضخيم. الجاف ساترة بلمس الحافة إلى مسح المتاح المليئة بالثغرات، ووضع الجانب خلية لأسفل على الحبرية التضخيم.
  10. ضع غطاء لوحة عقد في كوفيرسليبس في غرفة هوميديفيد واحتضان بين عشية وضحاها في RT في الظلام.
  11. العودة كوفيرسليبس إلى الآبار مرة أخرى. احتضان العينات مع 5 x SSCT [5 × سترات الصوديوم (SSC) كلوريد الصوديوم 0.1% 20 توين التي تمت تصفيتها من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر] التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام/مل DAPI ح 1 في الرايت أغسل العينات مرتين مع 5 x SSCT في الرايت
  12. جبل في كوفيرسليبس على شرائح المجهر. تحليل الخلايا والعينات باستخدام مجهر مقلوب الأسفار صورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة عزلة السكان متجانسة تقريبا من هي (الشكل 1). كما يتبين من تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، تقريبا 100% من الخلايا الجلدية البشرية المعزولة باستخدام الشروط الموصوفة في هذا البروتوكول كان إيجابيا الملون لعلامات جلدية تنتجها الخلايا الليفية وفيمنتين والكولاجين أنا24، ولكن السلبية للإنسان علامة keratinocyte القلفة K14 (الشكل 1). ويبين الشكل 2 عملية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأساليب المذكورة أعلاه، بما في ذلك عزل الخلايا الليفية الجلد من أنسجة جلد الإنسان، إعداد المؤتلف MCPyV فيريونس، وعدوى الخلايا المستزرعة وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت، وأسلوب أسماك حساسة مقتبس من HCR التكنولوجيا، التي وينبغي أن تمكن الباحثين من تحليل MCPyV العدوى27. إحدى الخطوات الأكثر أهمية لتحقيق MCPyV العدوى في المختبر هو إنتاج الاستعدادات virion عيار عالية. باستخدام البروتوكول لإعداد المؤتلف فيريونس MCPyV الموصوفة هنا، يمكننا أن نحقق التتر الفيروسية 1012 الجينوم النسخ لكل مل من المذيب

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف يود أن يشكر الدكتور مينارد هيرلين (معهد ويستار) والدكتور م. سيليست سيمون (جامعة بنسلفانيا) لتوفير الكواشف والدعم التقني. كما نشكر أعضاء مختبراتنا لمناقشة مفيدة. وكان يدعمها هذا العمل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01CA187718 و R01CA148768 و R01CA142723)، ومنح دعم مركز السرطان NCI (NCI P30 CA016520)، وجائزة "كفار بنسلفانيا" (P30 منظمة العفو الدولية 045008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصل ربلة الساق الجنينيةHyCloneSH30071.03
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I ، 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamine
DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومThermo Fisher Scientific14190136
0.05٪ Trypsin-EDTAThermo فيشر ساينتفيك25300-054
DMEM / F12 متوسطThermo Fisher Scientific11330-032
بروتين EGF البشري المؤتلف ، CFR & D systems236-EG-200يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية
CHIR99021كايمان كيميكال13122يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية
CHIR99021سيجماSML1046يحفظ في -80 درجة مئوية
كولاجيناز النوع الرابعثيرمو فيشر العلمي17104019
ديسباز IIروش4942078001
مضاد حيوي مضاد للفطرياتثيرمو فيشر Scientific15240-062حماية من الضوء
DMEM متوسطThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للفأر IgGThermo Fisher ScientificA11032الحماية من الضوء
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgGThermo Fisher ScientificA11034الحماية من الضوء
OptiPrep كثافة التدرج المتوسطةSigmaD1556حماية من الضوء
ParaformaldehydeSigmaP6148
مضاد ل MCPyV LT (CM2B4)سانتا كروزsc-136172Lot # B2717
MCV VP1 أرنبمصل متعدد النسيلة الأرنب # 10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
عوامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، Corning المؤتلف البشري354060يخزن عند درجة حرارة -80 درجة مئوية
Benzonase NucleaseSigmaE8263
DNase EPICENTRE الآمن على ATPEPICENTREE3101K
المخزن المؤقت لتهجين المسبارالتقنيات
التضخيم المخزن المؤقتالجزيئية
دبابيس الشعر المسمى Alexa 594التقنيات الجزيئيةB4الحماية من الضوء
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA كاشفThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
العمود الأزرق miniprep تدورQiagen27104
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602
المعتمد على ATP الجزيئية التقنيات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974(2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161(2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181(2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558(2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499(2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468(2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112(2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة