نقدم هنا، بروتوكولا لتصيب الابتدائي تنتجها من الخلايا الجلدية البشرية الليفية مع MCPyV. يشمل البروتوكول عزل الخلايا الليفية الجلدية، وإعداد فيريونس MCPyV والإصابة بعدوى الفيروس، وتلطيخ الفلورة والأسفار في التهجين الموقعي. ويمكن تمديد هذا البروتوكول وصف التفاعلات MCPyV-المضيف واكتشاف أنواع الخلايا الأخرى إينفيكتابل ب MCPyV.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بوليومافيروس خلية ميركل العدوى والكشف
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تؤدي الإصابة polyomavirus (MCPyV) خلية ميركل إلى ميركل سرطان الخلية (MCC)، أحد أشكال سرطان الجلد شديدة عدوانية. الدراسات الميكانيكية إجراء تحقيقات كاملة في البيولوجيا الجزيئية MCPyV وآليات النمطان أعيقت بعدم وجود نماذج ثقافة الخلية الملائمة. وهنا يصف لنا مجموعة من البروتوكولات لأداء، واكتشاف الإصابة MCPyV خلايا الجلد البشرية الأساسية. وصف البروتوكولات عزلة الليفية الجلدية البشرية، إعداد فيريونس MCPyV المؤتلف، والكشف عن الإصابة بالفيروس تلطيخ (إذا كان) إيممونوفلوريسسينت وفي الموقع التهجين الحمض النووي سلسلة من ردود الفعل (HCR)، التي هي درجة عالية من الحساسية الأسفار في نهج الموقع التهجين (الأسماك). يمكن تكييفها مع البروتوكولات الملحقة هذه الوثيقة من الباحثين المهتمين التعرف على أنواع الخلايا أو خطوط الخلايا التي تدعم MCPyV العدوى الأخرى. وصف نهج الأسماك يمكن تكييفها أيضا للكشف عن مستويات منخفضة من السلطات الوطنية المعينة موجودة في جلد الإنسان المصابة الفيروسية.
المقدمة
ميركل خلية polyomavirus (MCPyV) هو فيروس الحمض النووي الصغيرة، مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي تم إقرانها مع سرطان جلد نادرة ولكن العدوانية، ميركل الخلية الكبدية (MCC)1،2. يتجاوز معدل الوفيات من لجنة التنسيق الإداري، حوالي 33%، سرطان الجلد3،4. وقد MCPyV جينوم دائرية ~ 5 كيلو بايت1،5 جزئين حسب منطقة تنظيمية غير الترميز (نكر) في أوائل وأواخر ترميز المناطق1. نكر يحتوي على أصل الفيروسية النسخ المتماثل (أوري) والمروجين ثنائي الاتجاه للنسخ الفيروسي6
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتم الحصول على فوريسكينس حديثي الولادة البشرية من مركز أبحاث الأمراض الجلدية بنسلفانيا. تم الحصول على الكبار الليفية البشرية من التخلص من الجلد الطبيعي بعد الجراحة. ووافق جميع البروتوكولات الملحقة بجامعة "بنسلفانيا مجلس المراجعة المؤسسية".
1-عزل الخلايا الليفية الجلد البشري
- استخدام مقص لتقليم قبالة النسيج تحت الجلد والدهون من القلفة الولدان البشرية وقطع العينة الجلد في إنصاف أو أرباع.
- احتضان الأنسجة في 5 مل من 10 ملغ/مل ديسباسي الثاني في برنامج تلفزيوني وتستكمل مع مضاد حيوي فطري في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- في صحن معقم 10 سم، منفصلة بعناية البشرة من طبقات الجلد باستخدام الملقط ميكروديسيكتيون.
- نقل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يسمح البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة عزلة السكان متجانسة تقريبا من هي (الشكل 1). كما يتبين من تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، تقريبا 100% من الخلايا الجلدية البشرية المعزولة باستخدام الشروط الموصوفة في هذا البروتوكول كان إيجابيا الملون لعلامات جلدية تنتجها الخلايا الليفية وفيمنتين والكولاجين أنا24، ولكن السلبية للإنسان علامة keratinocyte القلفة K14 (الشكل 1). ويبين الشكل 2 عملية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الأساليب المذكورة أعلاه، بما في ذلك عزل الخلايا الليفية الجلد من أنسجة جلد الإنسان، إعداد المؤتلف MCPyV فيريونس، وعدوى الخلايا المستزرعة وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت، وأسلوب أسماك حساسة مقتبس من HCR التكنولوجيا، التي وينبغي أن تمكن الباحثين من تحليل MCPyV العدوى27. إحدى الخطوات الأكثر أهمية لتحقيق MCPyV العدوى في المختبر هو إنتاج الاستعدادات virion عيار عالية. باستخدام البروتوكول لإعداد المؤتلف فيريونس MCPyV الموصوفة هنا، يمكننا أن نحقق التتر الفيروسية 1012 الجينوم النسخ لكل مل من المذيب
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
المؤلف يود أن يشكر الدكتور مينارد هيرلين (معهد ويستار) والدكتور م. سيليست سيمون (جامعة بنسلفانيا) لتوفير الكواشف والدعم التقني. كما نشكر أعضاء مختبراتنا لمناقشة مفيدة. وكان يدعمها هذا العمل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01CA187718 و R01CA148768 و R01CA142723)، ومنح دعم مركز السرطان NCI (NCI P30 CA016520)، وجائزة "كفار بنسلفانيا" (P30 منظمة العفو الدولية 045008).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مصل ربلة الساق الجنينية | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I ، 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05٪ Trypsin-EDTA | Thermo فيشر ساينتفيك | 25300-054 | |
| DMEM / F12 متوسط | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| بروتين EGF البشري المؤتلف ، CF | R & D systems | 236-EG-200 | يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية |
| CHIR99021 | كايمان كيميكال | 13122 | يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية |
| CHIR99021 | سيجما | SML1046 | يحفظ في -80 درجة مئوية |
| كولاجيناز النوع الرابع | ثيرمو فيشر العلمي | 17104019 | |
| ديسباز II | روش | 4942078001 | |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات | ثيرمو فيشر Scientific | 15240-062 | حماية من الضوء |
| DMEM متوسط | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للفأر IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | الحماية من الضوء |
| Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | الحماية من الضوء |
| OptiPrep كثافة التدرج المتوسطة | Sigma | D1556 | حماية من الضوء |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| مضاد ل MCPyV LT (CM2B4) | سانتا كروز | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 أرنب | مصل متعدد النسيلة الأرنب # 10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| عوامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، Corning المؤتلف البشري | 354060 | يخزن عند درجة حرارة -80 درجة مئوية | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| DNase EPICENTRE الآمن على ATP | EPICENTRE | E3101K | |
| المخزن المؤقت لتهجين المسبار | التقنيات | ||
| التضخيم المخزن المؤقت | الجزيئية | ||
| دبابيس الشعر المسمى Alexa 594 | التقنيات الجزيئية | B4 | الحماية من الضوء |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA كاشف | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| العمود الأزرق miniprep تدور | Qiagen | 27104 | |
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
المراجع
- Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
