أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة

ملخص

الموصوفة هنا أسلوب لتحليل تعبير الجينات البكتيرية في الأنسجة الحيوانية على مستوى خلوي. هذا الأسلوب يوفر موردا لدراسة التنوع المظهرية التي تحدث داخل سكان بكتيرية في الاستجابة للبيئة الأنسجة أثناء عدوى.

الملخص

وكثيراً ما ينظم الجينات الفوعة الجرثومية على المستوى النسخي العوامل المتعددة التي تستجيب لإشارات بيئية مختلفة. وتعمل بعض العوامل مباشرة على الجينات الفوعة؛ الآخرين السيطرة المرضية عن طريق ضبط التعبير عن المنظمين المصب أو تراكم الإشارات التي تؤثر على نشاط منظم. في حين درست التنظيم على نطاق واسع من خلال النمو في المختبر ، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيف يتم تعديل التعبير الجيني أثناء الإصابة. هذه المعلومات المهم عند منتج معين جينات مرشح للتدخل العلاجي. مثل النهج النسخي RT-PCR الكمي، في الوقت الحقيقي وتسلسل الحمض النووي الريبي وسائل قوية لدراسة التعبير الجيني على مستوى عالمي، لكنها تعاني من العديد من التحديات التقنية بما في ذلك وفرة منخفضة من الحمض النووي الريبي البكتيرية بالمقارنة مع المضيف الجيش الملكي النيبالي، وعينه تدهور قبل رنسيس. تقييم تنظيم استخدام الصحفيين الفلورسنت سهلة نسبيا، ويمكن أن يكون متعدد مع البروتينات الفلورية مع الخواص الطيفية فريدة من نوعها. الأسلوب يسمح لتحليل التعبير الجيني في الأنسجة التي تظهر التدرجات العمارة والفيزيائية ثلاثية الأبعاد المعقدة التي تؤثر على الشبكات التنظيمية البكتيرية وحيدة الخلية، والزمانية المكانية. هذه المعلومات يتم فقدان عندما يتم حساب متوسط البيانات على معظم السكان. وهنا، يصف لنا طريقة للتحديد الكمي للتعبير الجيني في مسببات الأمراض البكتيرية في الموقع. الأسلوب الذي يستند إلى تجهيز الأنسجة البسيطة والملاحظة المباشرة من الأسفار من البروتينات مراسل. نبدي بفائدة هذا النظام بدراسة التعبير عن المكوّرات العنقودية الذهبية ثيرمونوكليسي (نشاط)، منتج الجين الذي مطلوب للتهرب من الحصانة وضراوة كامل السابقين فيفو والمجراه. ونحن تبين أن نشاط التجارة والنقل هو المعرب عنها بقوة في الخراجات الكلوية وتكشف عن التعبير الجيني غير متجانسة الواجبة في الجزء الظاهر التنظيم المكاني نشاط المروج النشاط في الخراجات منخرطة تماما مع الاستجابة المناعية. يمكن تطبيق الأسلوب لأي جرثومة مع نظام وراثية مانيبولاتابل وأي نموذج العدوى، وتوفير معلومات قيمة للدراسات الإكلينيكية وتطوير العقاقير.

المقدمة

البكتيريا تستجيب لتغيير الظروف الفسيولوجية والتغيرات في الحالة التغذوية لبيئتهم بخلطات التعبير عن الجينات اللازمة للتكيف والبقاء على قيد الحياة. على سبيل المثال، استعمار مسببات الأمراض الانتهازية الجسم السطوح في نسبيا منخفضة الكثافة، وغالباً ما تكون غير مؤذية. ومع ذلك، مجرد البكتيريا قد اخترقت الحواجز المادية والكيميائية، يجب أن يتعامل مع المضيف المناعي خلية مكافحة الدفاعات وتقييد توافر المغذيات¹. على سبيل مثال، المكوّرات العنقودية الذهبية كولونيزيس حوالي ثلث السكان أعراض ولكن أيضا قضية المدمرة الجلد والتهابات الأنسجة الرخوة والتهاب العظم والنقي والتهاب الشغاف وتجرثم². ويعزى النجاح في المذهبة س. كمسببات....

البروتوكول

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جورج تاون.

1-جيل سلالة مراسل نيون

1. هضم ناقل pRB4 التكاملية الجينوم تسلسلياً مع إنزيمات التقييد اكوري وسماي. بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، إعداد هضم بين عشية وضحاها مع سماي باستخدام 1 ميكروغرام من pRB4 عند 25 درجة مئوية، وثم المضي قدما في الهضم الثاني ح 1 في 37 درجة مئوية بإضافة اكوري إلى خليط رد فعل. إلغاء تنشيط الإنزيمات التي تفرخ في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
2. [بكر] تضخيم المنطقة التنظيمية لمصلحة من الحمض النووي (في هذه حالة، زوج قاعدي ~ 350 الحمض النووي جزء يحتوي على منطقة المروج ثيرمونوكليسي [نشاط])، يتضمن موق....

النتائج

وضعنا بلازميد المستمدة من بماد³² التي يمكن أن يحقق أي مراسل بناء الانصهار في الكروموسوم من جزئ مثلى كروس مزدوجة (الشكل 1). هذا البناء يسمح للتحليل الكمي لأي منطقة التنظيمية التي تدعم إنتاج البروتين بروتينات فلورية خضراء وإشارة مضيئة فوق الخلفية. بلازميد يمنح المقاومة الأمبيسلّين (Ap^r) لصيانة ونشر في كولاي ويمنح الاريثروميسين المقاومة (م^ص) في المذهبة س. كما يمنح البناء المقاومة كلورامفينيكول (

المناقشة

الأمراض المعدية البكتيرية مشكلة صحية متزايدة في جميع أنحاء العالم بسبب الحصول على مقاومة المضادات الحيوية محددات⁴⁶. لأن التكيف مع البيئات المضيف أمر ضروري للنمو والبقاء على قيد الحياة خلال العدوى، استراتيجيات تستهدف البرامج تعبير الجينات التي تزيد من اللياقة البدنية الممرض قد تكون مفيدة علاجية. واحد مثل هذا البرنامج هو مجموعة الجينات التي تسيطر عليها نظام مركبين ساير/S (TCS)، المعروض سابقا تلعب دوراً أساسيا في مأمن التهرب من⁴⁷. ساير/S هو الناجم عن مجموعة متنوعة من العوامل، .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
5٪ تشخيص هاردي لدم الأغنام	(سانتا ماريا ، كاليفورنيا)	A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta -D-galactopyranoside (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl / 6 Mice	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر	Zeiss	NA
cryostat microtome	Thermo Scientific	NA
Culture ، Cap	VWR International	2005-02512
D + 2: 25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (كورالفيل ، أيوا) NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
محلل التدفق	Becton Dickinson	NA
الخرز الزجاجي	Sigma	Z273627
Miniprep ، البلازميد	Promega	A1220
مائي يهتز المداري	نيو برونزويك Innova	NA
PCR تنقية	QIagen	28106
محلول ملحي للفوسفات (PBS) قارئ	Cellgrow	46-013-CM
	Tecan	NA
Precellys 24 homogenizer	مختبرات بيرتين	NA
pUC57-Kan	GenScript (بيسكاتواي ، نيوجيرسي) NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (إبسويتش ، ماساتشوستس) إنزيمات	M0491S
	جديدة إنجلترا بيولابيس (إبسويتش ، ماساتشوستس)	R0150S (PvuI) ، R3136S (BamHI) ، R0144S (BglII) ، R3131S (NheI) ، R0101S (EcoRI) ، R0141S (SmaI).
النسخ العكسي	نيو إنجلاند BioLabs	E6300L
سانجر تسلسل	جينيويز (جيرمانتاون ، دكتوراه في الطب)	NA
Sub Xero تجميد الأنسجة الشفافة المتوسطة	مرسيدس الطبية	MER5000
Superfrost Plus شرائح المجهر	فيشر Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
حقنة ، فلتر	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	غشاء بقعة الحمض النووي
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
مرق الصويا Tryptic	VWR	90000-376
مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية	Beckman Coulter-DU350	NA
وسيط تركيب Vectashield المضاد للبهتان مع	مختبرات	H-1500

حمام لوحة التقييد الدائم DAPI Vector