يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مقايسة الفائق "التنبؤ بالسمية الكيميائية" "الآلي التنميط المظهرية" من ايليجانس كاينورهابديتيس

6.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59082

⸱

مارس 14, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning, Beijing Center for Disease Prevention and Control/Beijing Center of Preventive Medicine Research, China, 2College of Computer Science and Technology, Qilu University of Technology(Shandong Academy of Sciences), China, 3Key Laboratory of Computational Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Collaborative Innovation Center for Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences-Max Planck Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, China, 4Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology, School of Public Health, Capital Medical University, China, 5School of Life Sciences, La Trobe University, Australia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

وقد وضعت أسلوب كمي لتحديد وتوقع السمية الحادة للمواد الكيميائية من خلال تحليل تلقائياً تحديد سمات المظهرية ايليجانس كاينورهابديتيس. ويصف هذا البروتوكول كيفية علاج الديدان مع المواد الكيميائية في صفيحة 384-جيدا، والتقاط الفيديو، والتحديد الكمي للسمية ذات الصلة تعمل.

الملخص

تطبيق اختبار السمية للمواد الكيميائية في أعلى ترتيب الكائنات، مثل الفئران أو الجرذان، مضيعة للوقت وباهظة التكاليف، نظراً لعمر طويل ومسائل الصيانة. على العكس من ذلك، وديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) مزايا لجعله خياراً مثاليا لاختبار السمية: عمر قصيرة وزراعة السهل، وكفاءة الإنجاب. هنا، نحن وصف بروتوكول التلقائي التنميط المظهرية من C. ايليجانس في صفيحة 384-جيدا. تربى الديدان السلكية في صفيحة 384-جيدا مع معالجة متوسطة والكيميائية السائلة، وأخذت أشرطة الفيديو لكل بئر التحديد الكمي لتأثير المواد الكيميائية على ميزات دودة 33. وتبين النتائج التجريبية أن ميزات النمط الظاهري كمياً يمكن تصنيف والتنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة ووضع قائمة أولويات لتقييم السمية الكيميائية التقليدية إجراء مزيد من الاختبارات في نموذج القوارض.

المقدمة

جنبا إلى جنب مع التطور السريع للمركبات الكيميائية التي تطبق على الإنتاج الصناعي والحياة اليومية للناس، من المهم دراسة سمية اختبار نماذج للمواد الكيميائية. في كثير من الحالات، يستخدم نموذج الحيوان القوارض لتقييم السمية المحتملة لمختلف المواد الكيميائية على الصحة. بشكل عام، يستخدم تحديد التركيزات المميتة (أي أساييد 50% جرعة مميتة [LD50] للمواد الكيميائية المختلفة) كمعلمة التقليدية في نموذج القوارض (فأر/الماوس) الحية، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب تخفيض، صقل، أو استبدال مبدأ (3R) المركزي للرفق بالحيوان، والأخلاقيات، والأساليب الجديدة التي تسمح لاستبدال الحيوانات أعلى قيمة للبحث العلمي1،،من23 . C. ايليجانس هو ديدان أسطوانية الشرانق التي ظلت معزولة من التربة. قد استخدمت على نطاق واسع ككائن بحث في المختبر بسبب خصائصه المفيدة، مثل عمر قصيرة، وزراعة سهلة وكفاءة الإنجاب. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الممرات البيولوجية الأساسية، بما في ذلك العمليات الفسيولوجية الأساسية واستجابات الإجهاد في C. ايليجانس، هي المحافظة في أعلى الثدييات4،،،من56،7 , 8-يوجد في بضع مقارنات جعلت نحن وآخرون، توافق جيد بين C. ايليجانس السمية والسمية التي لوحظت في القوارض9. كل هذا يجعل C. ايليجانس نموذج جيد لاختبار آثار المجراة في المواد الكيميائية السمية.

في الآونة الأخيرة، بعض الدراسات الكمية السمات المظهرية من C. ايليجانس. يمكن استخدام الميزات لتحليل السمية للمواد الكيميائية2،،من310 وشيخوخة الديدان11. كما وضعنا أيضا أسلوب الذي يجمع بين دودة سائل استزراع النظام ونظام تحليل صورة، التي تربى الديدان في لوحة 384-البئر تحت علاجات كيميائية مختلفة12. وقد وضعت هذا الأسلوب الكمي لتحليل معلمات 33 C. ايليجانس تلقائياً بعد 12-24 ساعة علاج الكيميائي في صفيحة 384-جيدا مع السائلة المتوسطة. يتم استخدام مرحلة مجهر الآلي لاقتناء الفيديو التجريبية. أشرطة الفيديو يتم معالجتها بواسطة برنامج مصمم خصيصا، وكمياً 33 الميزات المتصلة بالسلوك الديدان المتحركة. الأسلوب يستخدم لقياس تعمل الدودة تحت العلاج 10 مركبات. وتبين النتائج أن السمية مختلفة يمكن أن يغير تعمل من C. ايليجانس. يمكن استخدام هذه الكمية تعمل التعرف والتنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة. والهدف العام لهذا الأسلوب لتسهيل المراقبة والقياس الكمي المظهرية للتجارب مع C. ايليجانس في ثقافة سائل. يعد هذا الأسلوب مفيداً لتطبيق C. ايليجانس في تقييمات السمية الكيميائية والنمط الظاهري كوانتيفيكيشنز، التي تساعد على التنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة ووضع قائمة بأولويات لمزيد التقليدية اختبارات تقييم السمية الكيميائية في نموذج القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لسمية الفحص والاختبار لمواد كيميائية جديدة أو المجمع التلوث عامل المضافات الغذائية ومركبات فارماكوتيكال، مجمع خارجية بيئية، وهلم جرا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

البروتوكول المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية من "لجنة الأخلاقيات الحيوان" من مركز بكين للوقاية من المرض ومكافحته في الصين.

1-إعداد الأسلحة الكيميائية

  1. الحصول على المواد الكيميائية (الجدول 1 و الجدول للمواد).
  2. تحديد الجرعة أعلى وأدنى من المواد الكيميائية الإفرادية لتركيز الحد أدنى من الفتك 100% (LC100، 24 ساعة) وتركيز الحد أقصى من 100% نونليثاليتي (LC0، 24 ساعة) للديدان. استخدام تخفيف ستة على الأقل من أعلى تركيز (الجدول 1).
    ملاحظة: إجراء اختبار قوة فتك دودة أولية9 استكشاف LC100 و LC0 لمادة كيميائية جديدة، لتحديد الجرعة.
  3. تمييع كل مادة كيميائية مع كالمتوسطه (جدول المواد) إلى 2 × التركيز المطلوب. استخدام K-المتوسطة كعنصر تحكم لمقارنة النمط الظاهري التعديلات الناجمة عن المواد الكيميائية.
    1. على سبيل المثال، تعد 7 تركيزات متدرجة من كلوريد الكادميوم (كدكل2) (الجدول 1). إعداد 2 x حل 92.8 مغ كدكل مسحوق2 الصلبة في 8 مل كمتوسطه أعلى المحلول مركزة (4.64 مغ/مل)، وملء يصل إلى 10 مل بعد المسحوق قد حلت تماما. إعداد مستويات تركيز أخرى بإضعاف مع كالمتوسطه.
  4. إعداد ثمانية آبار موازية لكل تركيز في التدرج الكيميائية. كذلك يتضمن كل 50 ميليلتر من 2 × الحل الكيميائية. إعداد على الأقل ثلاث مجموعات من ثمانية آبار موازية من K والمتوسطة كعناصر تحكم (الجدول 2).
    ملاحظة: بإيجاز، حجم 500 ميليلتر من 2 × الحل العمل أمر ضروري لجرعة واحدة من كل مادة كيميائية.

2-دودة إعداد

  1. الحصول على البرية من نوع N2 الديدان وسلالات الإشريكيّة القولونية OP50 من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك).
  2. الحصول على متزامنة L4 الديدان.
    1. اختيار مستعمرة واحدة من OP50 كولاي من لوحة متواصلة. أسيبتيكالي تطعيم المستعمرة في 100 مل مرق رطل وأنها تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الحل OP50 كولاي جاهز الآن للبذر لنمو السلكية لوحات متوسطة (NGM، الجدول للمواد).
    2. صب NGM بلاستيك 90 مم طبق بيتري. البذور كل لوحة مع 300 ميليلتر لحل OP50 كولاي اليوم بعد سكب. احتضان الديدان N2 على لوحات NGM مع OP50 في 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى أكثر من الديدان قد وصل إلى مرحلة الكبار.
    3. الديدان جرابيد الحصاد في أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 15 مل مع العقيمة H2o. واسمحوا الديدان تستقر لمدة 2 دقيقة على الأقل، ونضح ح2س، وإضافة 5 مل من المخزن المؤقت للتبييض (جدول المواد).
    4. دوامة الأنبوب لمدة 5 دقائق، تدور أنبوب لمدة 30 ثانية (في س 1,300 ز) بيليه البيض، وتجاهل المادة طافية.
    5. أغسل البيض مع 5 مل ح2س العقيمة ودوامه الأنبوب للطرد المركزي س. 5 الأنبوبة 30 s (في س 1,300 ز) وإزالة المادة طافية، والمياه والصرف الصحي مرة أخرى.
    6. "الماصة؛" البيض على صفيحة NGM جديدة مع OP50. احتضان لهم عند 20 درجة مئوية. رصد الديدان L1 مظلل في صباح اليوم التالي؛ الديدان وسوف تصل إلى مرحلة L4 في حوالي 40 ح.
  3. أغسل الديدان L4 قبالة لوحات بيتري 90 ملم مع كالمتوسطه في أنبوب 50 مل مخروطية عقيمة. ضبط تركيز الديدان للحيوانات ~ 40 الواحد 100 ميليلتر من K والمتوسطة تحت ستيريوميكروسكوبي. إضافة 50 ميليلتر (الديدان ~ 20) في كل من لوحة 384-جيدا جيدا. هذه الديدان متزامنة (مرحلة L4) على استعداد لمعالجة المواد الكيميائية التالية.

3-الأسلحة الكيميائية العلاج والتقاط الفيديو

ملاحظة: في لوحة 384، حسنا، تعامل الديدان (50 ميليلتر في كل بئر) إلى ستة إلى سبعة لجرعات من مادة كيميائية فردية (الجدول 1). إعداد ثمانية آبار موازية، كل منها يحتوي على 50 ميليلتر من 2 × الحل الكيميائية لكل جرعة (ثمانية آبار مليئة بنفس المادة الكيميائية وتركيز نفسه، الجدول 2). يتم جمع كل أشرطة الفيديو باستخدام كاميرا رقمية إرفاقه مجهر مقلوب (جدول المواد). تجربة العلاج الكيميائي يستمر لمدة 24 ساعة. لا تقم بإضافة الغذاء البكتيرية لكل بئر خلال التجربة العلاج الكيميائي ح 24.

  1. قبل إضافة المواد الكيميائية، تعيين لوحة 384-جيدا مع الديدان متزامنة في مرحلة التلقائية واتخاذ أشرطة الفيديو لكل بئر مع إجراءات اقتناء المبرمجة (7 إطارات في الثانية 2 s؛ فإنه يأخذ ~ 25 دقيقة لمسح كل لوحة).
  2. إضافة 50 ميليلتر من 2 × الكيميائية الأوراق المالية المعدة وفقا للمادة 1 لكل بئر (الجدول 2). تعيين الوقت كنقطة ح 0.
  3. احتضان لوحة 384-جيدا عند 20 درجة مئوية واهتز 80 لفة في الدقيقة في شاكر حاضنة.
  4. إزالة اللوحة من الحاضنة ونقلها إلى مرحلة تلقائية. أن أشرطة الفيديو لكل بئر من لوحة كاملة، في ح 12 وفي ح 24، للتحقق من تعمل الديدان لكل معاملة كيميائية محددة في كالمتوسطه. حوالي 25 دقيقة مطلوبة من أجل شاشة لوحة واحدة.

4-تجربة معالجة الفيديو

ملاحظة: كتابة برنامج لمعالجة الصور والفيديو التجريبية وتعبئتها. يمكن تحميلها بحرية (انظر الجدول للمواد). يتم تخزين الفيديو التجريبية في شكل تسلسل الإطار صورة، وتسلسل الإطار كل الفيديو المخزنة في دليل محدد. البرنامج يمكن الاعتراف بالديدان والتحديد الكمي لتعمل تلقائياً.

  1. في واجهة المستخدم الرسومية (واجهة المستخدم الرسومية، الشكل 1)، إضافة المعلمات، مثل الدليل تسلسل الإطار، دليل الإخراج، معلمة الحجم دودة، وحركة عتبة المعلمة. انقر فوق الزر تحليل لمعالجة الصور التجريبية.
    1. انقر فوق الزر تحديد اختيار الدليل الصور المصدر.
    2. إضافة الدليل نتيجة متوسطة في الواجهة.
      ملاحظة: النتائج المتوسطة التي تشمل الصور مجزأة. هذه النتائج المتوسطة مفيدة للمراقبة البصرية لمعالجة الصور.
    3. إضافة الدليل النتيجة النهائية في الواجهة.
    4. إضافة معلمة دودة متوسط الحجم في مربع نص حجم الدودة في الواجهة.
      ملاحظة: هو معلمة الحجم المستخدمة في التجارب 2,000.
    5. إضافة عتبة نسبة تم نقله في الواجهة.
      ملاحظة: هي النسبة المستخدمة في التجارب 0.93.
    6. انقر فوق الزر تحليل للبدء في معالجة الصور. انقر فوق الزر إعادة تعيين إلى مسح معلمات إضافية.
      ملاحظة: هناك ميزات 33 تعريفها وقياسها كمياً للديدان. يتم فرز جميع تعمل المعرفة حسب فئات (المدرجة في الجدول 3). هذه الميزات يمكن قياسها كمياً من الصور التجريبية. مقارنة كمية بين المواد الكيميائية المختلفة، التي لديها السمية مختلفة، يمكن أن يتم عن طريق مقارنة هذه الميزات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قد اختبرنا تعمل الديدان يتعرضون لتركيزات مختلفة من المواد الكيميائية أكثر من 1012. في الاختبار، وتم قياس كمية 33 سمات مميزة لكل مادة كيميائية مركبة في ثلاث نقاط زمنية (ح 0 وح 12 و 24 ساعة). سابقا، تم إجراء مقارنة بين دليل وتحليل تلقائي مقايسة عمر11،12. في هذا التحليل، وجدنا أن المواد الكيميائية وتركيزات يمكن أن تؤثر تعمل دودة. ويبين الشكل 2لمحة عامة عن هذا الأسلوب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مزايا C. ايليجانس أدت إلى أن الاستخدام المتزايد في علم السموم9، سواء بالنسبة للدراسات الميكانيكية والنهج الفرز الفائق. زيادة دور C. ايليجانس في استكمال النظم النموذجية الأخرى في الأبحاث السمية كان ملحوظا في السنوات الأخيرة، خاصة بالنسبة للتقييم السريع سمية المواد الكيميائية الجديدة. توفر هذه المقالة مقايسة جديدة للفرز الفائق، وكمية من دودة تعمل في صفيحة 384-جيدا للتعرف التلقائي وتقييم المواد الكيميائية السمية. هذا التحليل مثالي لاختبار السمية الحادة للمواد الكيميائية خلال 24 ساعة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون يرجى إرسال ايليجانس C. كجك. وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وبرنامج التنمية للصين (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية لمنح الصين (#31401025، #81273108 #81641184) والصحة الرأسمالية للبحث والتنمية للمشاريع الخاصة في بكين (#2011-1013-03)، الصندوق افتتاح مختبر بكين الرئيسية لعلم السموم البيئية (# 2015HJDL03)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة شاندونغ، الصين (ZR2017BF041).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-بروبانولسيجما ألدريتش59300
384 ألواح بئرThrome142761
AgarBacto214010
كبريتات الأتروبينSigma-AldrichPHL80892
عازلة0.5 مل من 10 M NaOH ، 0.5 مل من 5٪ NaClO ، 9 مل من الماء فائق النقاء
كلوريد الكادميومSigma-Aldrich202908
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش21074
CCD كاميراZeissAxioCam HRmZeiss المجهري GmbH
الكوليسترولسيجما ألدريتشC8667
كبريتات النحاس (II)سيجما ألدريتش451657
الإيثانولسيجما ألدريتش24105
جلايكول الإيثيلينسيجما ألدريتش324558
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516
K-Medium3.04 جم من كلوريد الصوديوم و 2.39 جم من KCl في 1 لتر ماء عالي النقاء
مرق LB   ؛10  g / L   التربتون,  5  g / L   الخميرة  استخراج,  5  g / L   كلوريد الصوديوم  
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدراتسيجما ألدريتش63140
NGM صفيحة3 جم منكلوريد الصوديوم ، 17 جم من فاجار ، 2.5 جم منالبيبتون في 1 لتر من الماء فائق النقاء ، بعد الأوتوكلاف أضف 1 مل من الكوليسترول (5 مجم / مل في الإيثانول) ، 1 مل من MgSO4 (1 م) ، 1 مل من CaCl2 (1 م) ، 25 مل من عازلة PPB
الببتونباكتو211677
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتش60130
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتش795496
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتش795488
عازلة35.6 جم من K2HPO4 ، 108.3 جم من KH2PO4 في 1 لتر شاكر ماء فائق النقاء
ZHICHENGZWY-200D
كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتش71382
فلوريدالصوديومSigma-Aldrichs7920
هيدروكسيد الصوديومSigma-Aldrich71690
محلول هيبوكلوريت الصوديومSigma-Aldrich239305
رابط البرنامجhttps://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
TryptoneSigma-AldrichT7293
Sigma-AldrichY1625
Zeiss المجهر الأوتوماتيكي ZeissAXIO Observer.Z1Zeiss ميكروسكو التلقائي مع برنامج peproprietary Zen2012 وشحن الجهاز المقترن (CCD) الكاميرا
التبييض PPB مستخلص الخميرة

المراجع

  1. Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
  2. Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
  3. Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
  4. Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
  5. Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
  6. Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
  7. Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
  8. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
  9. Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
  10. Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259(2007).
  11. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  12. Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18(2018).
  13. Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
  14. Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
  15. Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

C elegans 384
مقايسة الفائق "التنبؤ بالسمية الكيميائية" "الآلي التنميط المظهرية" من ايليجانس كاينورهابديتيس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.