مقالة منهجية

تقييم البارامترات أعصاب Ultrastructural بعد في توصيل الرحم النامي الماوس المخ والحبل الشوكي

6.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59084

⸱

فبراير 26, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Molecular Brain Research, Ruhr University Bochum, 2Central Animal Facility of the Medical Faculty, Ruhr University Bochum

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

المزيج من مجهر إلكتروني وتوصيل في الرحم ونهج قوية لدراسة التغييرات الشكلية في أولتراستروكتوري جيد للجهاز العصبي أثناء التطوير. يسمح هذا الأسلوب الجمع بين الأفكار العميقة إلى تغييرات في التفاصيل الهيكلية الكامنة وراء أعصاب فيما يتعلق بتمثيلها الطوبوغرافية.

الملخص

هذه الدراسة يجمع بين توصيل في الرحم مجهر إلكتروني (TEM) تهدف إلى إجراء تحليل دقيق مورفوميتريكال المعلمات ultrastructural في هياكل الطوبوغرافية التي تم تحديدها على نحو لا لبس فيه، المتأثرين بروتين للفائدة أن يتم إدخال في الكائن الحي عن طريق نقل الفيروس. يسمح هذا النهج الموحد لانتقال سلس من ماكروستروكتورال لتحديد هوية ultrastructural بالتالي خرائط الملاحة الطوبوغرافية في أطلس أنسجة. يكشف المجهر الإلكتروني عالية الاستبانة للأنسجة في-الرحم-ترانسدوسيد أولتراستروكتوري غرامة نيوروبيل ومعلماتها اللدونة، مثل المناطق كروسسيكتيونيد بوتون متشابك، والعدد من الحويصلات متشابك والميتوكوندريا داخل بوتون الشخصية، طول اتصالات متشابك، ومناطق محواري كروسسيكتيونيد، سمك اﻷغماد المايلين، وعدد lamellae المايلين، ومناطق كروسسيكتيونيد الميتوكوندريا التشكيلات الجانبية. ويكشف تحليل هذه المعلمات الأساسية ثاقبة التغييرات من اللدونة ultrastructural في مجالات النظام العصبي التي تتأثر بنقل بنية الوراثية الفيروسية. هذا الأسلوب مجتمعة لا يمكن أن تستخدم فقط لدراسة التأثير المباشر للمهندسة وراثيا من الجزيئات الحيوية و/أو المخدرات على اللدونة العصبية ولكن أيضا يفتح إمكانية دراسة عملية الإنقاذ في الرحم من اللدونة العصبية (مثلاً، في سياق أمراض الأعصاب).

المقدمة

يمكن اختراق لا فوتون عينة أنسجة سامسونج في درجة عمق إلكترون. وهذا سمات مزايا لا تقدر بثمن إلى تيم في التقاط الصور القرار نانومتر من الهياكل الدقيقة عند مقارنة بتقنيات الفحص المجهري الخفيفة. على سبيل المثال، يسمح تيم لتصور العضيات داخل الخلية مثل الميتوكوندريا والأجسام الصباغية، وأنواع مختلفة من حبيبات افرازية، ميكروتوبوليس، ميكروفيلامينتس، أهداب، زغيبات، والوصلات بين الخلايا (سطح الخلية التخصصات)، وبخاصة سينابسيس في الجهاز العصبي1،2،،من34. والهدف العام لهذه الدراسة المنهجية هو ultrastructural الاعتراف بالتغيرات في اللدونة العصبية أثناء التطوير على التدخل قبل الولادة عن طريق الجمع بين الدولة من أحدث تقنيات توصيل في الرحم وال. تم ترانسدوسيد البروتينات المرمزة فيروسي للفائدة في الرحم إلى أن الجهاز العصبي المركزي5،،من67، بما في ذلك الحبل الشوكي6. على سبيل المثال، توصيل في الرحم في تركيبة مع تيم قد استخدمت لدراسة تأثير جزيء التصاق الخلايا L1 على موتور التعلم اللدونة في الفئران تفتقر إلى المستوى 1، لا سيما فيما يتعلق بالتفاعل بين L1 والبروتينات مستقبلات النووية في7من الخلايا العصبية في الدماغ.

ويتطلب تحليل معلمات أعصاب معلومات دقيقة حول التعريب أصغر المناطق داخل الجهاز العصبي. ولذلك، فمن الملائم لوصف تفاصيل ultrastructural وميولهم الطوبوغرافية الدقيقة فيما يتعلق بالهياكل الأخرى. ويرد في هذه الدراسة، أسلوب تحضيرية محددة تهدف إلى تحقيق مفصل لمجالات المورفولوجية متميزة على أساس كل من الضوء والمجهر الإلكتروني. يجمع هذا النهج بين عدة تقنيات للتلاعب الأنسجة، بدءاً في الرحم وتوصيل الماوس المخ والحبل الشوكي، وتليها نضح التثبيت، تضمين العفن، وتجهيز الأنسجة لل. هو خطوة أساسية شملت بين التضمين وتجهيز الأنسجة لل الوثائق المتعلقة الأنسجة، واستخدام تقنية انعكاس الضوء التدخل الذي يسمح للوثائق ميكروفوتوجرافيك وتضخم منخفضة الدقة من الأنسجة العينات8،،من910. إدماج النهج الحالي، يتيح هذا الأسلوب الباحثين لدراسة التفاصيل الطوبوغرافية والهيكلية للسطوح النسيج العصبي والتشكيلات الجانبية لشريحة العينة قبل إعدادها لل.

إطار خاص لتقطيع العقول كله يناظر الإحداثيات ستيريوتاكسيك. فوائد تعمير المناطق في النسيج العصبي (3D) ثلاثي الأبعاد المورفولوجية هذا الإطار ويمكن أن تستخدم لتحليل شكلي. ماكروجرافس المقاطع تصور يتم تعيين الإحداثيات الطبوغرافية، وبناء الأقسام مرقمة تسلسلياً الخرائط في أطلس أنسجة.

بعد راتنج التجهيز، هو مقطوع الأنسجة المضمنة إلى أقسام سامسونج (< 70 نانومتر) التي تحتوي على مناطق مختارة، وفقا لخرائط الأطلس الأنسجة المذكورة أعلاه. المقاطع سامسونج يتعرضون لل للحصول على صور عالية الاستبانة للمعلمات اللدونة (مثلاً، عينة الشخصية المناطق boutons متشابك أو ألياف محواري) من محتوياتها واتصالاتها لهياكل المجاورة داخل المجمع نيوروبيل.

بالطريقة المبينة في هذا التقرير، يسمح الانتقال السلس من ماكروستروكتوريس تصور للمشاريع المتناهية الصغر والنانو دراسات متعمقة مقارنة اللدونة العصبية المورفولوجية بعد في الرحم توصيل النامية العصبي النظام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كافة الإجراءات على الموضوعات الحيوان أقرتها لجان أخلاقيات الحيوان المؤسسية للدول الاتحادية في هامبورغ ونوردراين-فيستفالن، ألمانيا.  استخدام أدوات معقمة وقفازات واقية ومعاطف العقيم طوال الإجراءات الجراحية بأكملها.

1-في توصيل الرحم

  1. تعد الفيروسات المرتبطة بالغدة من النوع 1 (AAV1) الترميز للهدف المنشود (4 × 1011 الفيروسية الجسيمات/ميليلتر من AAV1) في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) على درجة الحموضة 7.4. إضافة 0.1 ملغم/ميليلتر "الأخضر سريع" والحفاظ على خليط AAV1--السريع--الأخضر عند 37 درجة مئوية.
  2. إعداد تلميح شعرية رقيقة بالشكل المطلوب (8 ملم في الطول، مع خارج قطر 80 ميكرومتر وداخل قطرها 50 ميكرومتر)، استخدام ساحبة ميكروبيبيتي (إعدادات: الضغط = 500، الحرارة = 700، سحب = 0، السرعة = 80، وقت = 200، انظر "الجدول للمواد" ). كسر غيض شعري حيث يكون من 4-5 ملم.
  3. تجميع أنبوب المضخة (44 × 0.7 سم) مع طرف الشعرية ونضح 15 ميليلتر من خليط AAV1--السريع--الخضراء إلى الشعرية.
  4. الحفاظ على الموضوعات الحيوان في درجة حرارة جسم فسيولوجية مستمر من 37 درجة مئوية في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.
  5. ضع ماوس C57Bl/6 حوامل (14.5 يوم الجنينية) في قاعة بريينكوبيشن وتخدير الماوس مع الغازي 4% إيسوفلوراني (بمعدل تدفق الهواء حجمي 0.6-0.8 لتر/دقيقة).
  6. تحت الجلد، حقن البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ وزن الجسم).
  7. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على لوحة العمليات الجراحية بريوارميد (37 درجة مئوية).
  8. تغطية العينين مع مواد تشحيم.
  9. تناسب الماوس مع قناع التخدير (الغازية 1.5% إيسوفلوراني بمعدل تدفق الهواء حجمي 0.6-0.8 L/دقيقة) على لوحة العمليات الجراحية والحلاقة منطقة جلد البطن. مسح منطقة حلق مع الإيثانول 3 × 75%، ومن ثم مع الحل تدين.
    ملاحظة: مراقبة سلوك الماوس أنيسثيتيزيد التنفس بشكل مستمر. ضبط تركيز الغاز isoflurane وفقا للنمط استنشاق زفير من الماوس.
  10. التحقق من وجود غياب منعكس أخمصي بالضغط على السلاميات مخلب هند من الماوس.
  11. فتح تجويف البطن التي تجتاح الجلد مع ملقط القزحية مسنن منحنية (10 سم) وقطع الجلد على طول mediana لينيا مع مقص مستقيم كربيد التنغستن (10 سم)، ومن ثم، التي تجتاح الجدار البريتوني مع مستقيم دومون ملاقط (12 سم، 0.2 مم × 0.12 ملم) وقطع الجدار على طول ألبا لينيا مع مستقيم تكونوا المقص (8 سم).
  12. ضع قطعة من الفيلم البارافين fenestrated المتعلق بفتح البطن وإصلاح الفيلم على طرفي مع ملقط مرقئ الصغرى-البعوض (12.5 سم، منحنى).
  13. فضح ابواق الرحم مع جهاز مثل ملعقة تلافي وقوع ضرر على الأجنة داخل الرحم قرون. التنقيط بضع قطرات من برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية) على قرون الرحم وفحص الأجنة للأضرار أو التشوهات داخل كيس الرحم.
  14. توثيق النظام، وموقف من الأجنة في قرون الرحم. دورة الأجنة بعناية داخل كيس الرحم حتى يتم التوصل إلى الموضع الذي تريده للحقن.
  15. حقن 1-2 ميليلتر من خليط AAV1--السريع--الأخضر بصريا تفتيش موقع الحقن (مثلاً البطينين الدماغ) وتغلغل الصبغة تحت ستيريوميكروسكوبي.
  16. وثيقة حقن الأجنة وقرون الرحم مع حقن الأجنة مرة أخرى في تجويف البطن.
  17. التنقيط بضع قطرات من برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية) في تجويف البطن. إغلاق التجويف بخياطة الجدار البريتوني (استخدام بولي أميد 6-0-الحجم خيوط) والجلد (استخدام بولي أميد 3-0-الحجم خيوط)، باستخدام البعوض ملقط ل Halsted مرقئ (12.5 سم، منحنى). بدلاً من ذلك، استخدام نمط توقف بسيطة أو الفولاذ المقاوم للصدأ خياطة/المواد الغذائية الأساسية إلى إغلاق تجويف البطن والجلد.

2-تيليماكروفوتوجرافي أنسجة المعزولة

  1. إعداد المخازن المؤقتة
    1. إعداد Sörensen المخزن المؤقت (1 لتر) بحل ز 14.95 غ2هبو4 و 2.18 ز خ2ص4 في 1 لتر ماء المقطر تحت التحريك 200 لفة في الدقيقة. التروية في وقت متأخر الجراء الحمل و/أو الجراء في مرحلة ما بعد الولادة الفترات الزمنية، استخدم حجم مناسب للابر لحقن البطن أو إجراء وتأكد من أن تركيز التخدير بينتوباربيتال الصوديوم المحطة الطرفية لا تتجاوز 180 مغ/ كغم من وزن الجسم.
    2. إعداد سنقبل تثبيت الحل (5 لتر) بتدفئة 500 مل ماء المقطر إلى 75 درجة مئوية وإضافة 50 جرام مسحوق بارافورمالدهيد تحت التحريك 200 لفة في الدقيقة، مشيراً إلى 200 ميليلتر من 5 هيدروكسيد الصوديوم N، إضافة مل 1,500 من المخزن المؤقت في Sörensen، 1,750 مل من الماء المقطر ، و 500 مل جلوتارالديهيدي 25%. ملء يصل إلى 5,000 مل بالماء المقطر. استخدم هذا المخزن النهائي التروية.
      ملاحظة: إعداد تثبيت الحل سنقبل تحت غطاء محرك السيارة، وارتداء النظارات الواقية، وتجنب الأبخرة. إضافة الميثيلين الأزرق (0.05 غرام/لتر) لوضع تصور أفضل التروية.
  2. عزل التروية والأنسجة الماوس
    1. ترانسكارديالي نتخلل الفئران الحوامل التي تحمل الأجنة ترانسدوسيد (في حالة دراسات الأجنة) أو الحانات ترانسدوسيد المولود في السن المطلوب (مثلاً بعد الولادة يوم 24) وفقا للإجراءات الموحدة6،7، 11،12،13،14،15،،من1617، استخدام بينتوباربيتال الصوديوم داخل المحطة الطرفية التخدير (200 مغ/كغ وزن الجسم).
    2. حقن ترانسكارديالي الفئران مع الهيبارين الحل (500 يو) استخدام غ 26، 1 في الإبرة، وقبل التثبيت، لبث الفئران ترانسكارديالي مع 10 مل من برنامج تلفزيوني إخراج الدم من الجسم، ونتخلل لهم ترانسكارديالي مع 30 مل من 40 درجة مئوية بريوارميد سنقبل تثبيت الحل.
      ملاحظة: للفئران الكبار، القيام نضح بديلة إلى الوراء عبر الشريان الاورطي البطني14.
    3. عزل الأنسجة بيرفوسيد للفائدة (مثلاً، الجامعة الدماغ أو النخاع الشوكي) و postfix الأنسجة في مالا يقل عن 10 مل سنقبل بتثبيت الحل لآخر 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
    4. غسل الأنسجة في 10 مل من برنامج تلفزيوني عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  3. التضمين في [اغروس]، بالإضافة إلى الوثائق وتمزيقها
    1. ضبط الأنسجة المعزولة (مثلاً، الجامعة الدماغ) في إطار خاص باستنساخه بتقطيع زاوية8،،من910. بدلاً من ذلك، استخدم فيبرتوم مع سمك قطع قابل لتعديل.
    2. ضع النسيج العصبي في الإطار وضبط الأنسجة تيليماكروجرافي، وتوثيق الإحداثيات.
    3. إعداد 3% المتوسطة التضمين [اغروس] انصهار منخفضة: إضافة 3 ز من [اغروس] في 100 مل من المخزن المؤقت في Sörensen وتسخين الخليط في حمام مائي إلى 90 درجة مئوية.
    4. في الإطار الذي يحتوي على الأنسجة، صب [اغروس] 3% (30 درجة مئوية). تغطية الإطار مع كتلة معدنية دافئة وانتظر حتى يتم تقوية. أثناء تصلب، استخدام أجهزة تيليماكروجرافيك لصورة الأنسجة المضمنة وإحداثياته ضمن الإطار.
    5. نقل الأنسجة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] في إطار خفض الثغرات المقابلة لإحداثيات الإطار الأول.
    6. قطع الأنسجة المضمنة إلى أقسام من السمك المطلوب (مثلاً 1.5 مم) مع جهاز بشفرة حلاقة رقيقة وتهتز (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: تحسين التزلق لشفرة حلاقة، التنقيط بضع قطرات من الجلسرين على الأنسجة المضمنة.
    7. صورة كل قسم الأنسجة في برنامج تلفزيوني وجمع الصور في مجلد.

3-إعداد الأنسجة المعزولة مجهر إلكتروني

ملاحظة: تنفيذ خطوات إضافية للحضانة في الأطباق الزجاجية مع أغطية كلوسابل مشددة على منصة تهتز تحت غطاء محرك السيارة.

  1. أغسل أقسام الأنسجة ل 2 × 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان الفروع في 2% مائي أوزميوم أكسيد solution (أوسو4) لح 2 في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: أكسيد الاوزميوم السامة وقد تكون ضارة عندما يتعلق الأمر على اتصال بالجلد.
  2. أغسل المقاطع أوسميكاتيد 2 × 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني.
  3. احتضان المقاطع في الإيثانول 30%، 50% و 70% في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة (اختياري: احتضان بين عشية وضحاها في الإيثانول 70% في 4 درجات مئوية).
  4. صورة العينات أوسميكاتيد في الإيثانول 70% تحت RGB الصمام الخفيفة8،9،10 (2 × 15 ث) المطبقة على العينة من الجانب الأيسر والأيمن بزاوية مقدارها 45 درجة. استخدم أطباق أسود وخلفية سوداء مملة للتقليل من تشتت وانعكاس الضوء أثناء الإضاءة.
    تنبيه: لا تسمح للقسم لتجف أثناء التصوير.
  5. إنشاء أطلس الصور القسم مع الإحداثيات عن طريق جمع الصور في سلسلة في مجلد.
  6. احتضان العينات في الإيثانول 100% (2 x ل 30 دقيقة)، وأكسيد البروبيلين 100% (2x) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: عدم السماح بالفروع لتجف أثناء تغيير الحلول.
  7. مل 260 مزيج من راتنج مع 240 مل دوديسينيلسوكسينيك الخل في وعاء زجاج أثناء التحريك بلطف مع شريط زجاج. فحص دوري إينهوموجينيتي، وفقاعات، ومسحات. جداً بلطف، يحرك باليد لمدة 45 دقيقة على الأقل.
  8. تحضير أكسيد الراتنج/البروبيلين بنسبة 1:2 و 1:1، وإضافة المسرع 3% (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
  9. احتضان الأنسجة في 1:2 تضمين الحل من الخطوة 3.8 ح 2، ومن ثم في الحل تضمين 1:1 من الخطوة 3.8 ح 2 في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة.
  10. وضع الأنسجة في أطباق مسطحة البوليبروبيلين وتغطي الأنسجة مع الراتنج الطازجة التي تحتوي على مسرع 3%، وعلاج الأنسجة المضمنة في 65-85 درجة مئوية ح 12-24.
  11. تهدئة الأنسجة المضمنة إلى درجة حرارة الغرفة وإزالة العينات جزءا لا يتجزأ من الراتنج من الأطباق البوليبروبيلين.

4-اختيار المعلمات أعصاب Ultrastructural للتحليل الكمي

  1. تعيين مجال الاهتمام
    1. اختر أحد المجالات ذات الأهمية (على سبيل المثال، الحصين أو المخيخ) وتعريب المنطقة في الأطلس القسم باختيار الصورة من الأطلس (الخطوة 3، 5) الذي يحتوي على هذا المجال.
    2. رسم حدود مجال الاهتمام على صورة المقطع والبحث/ركب هذه حدود المنطقة على العينة الراتنج.
    3. علامة الصفر حدود مجال الاهتمام (على سبيل المثال، الحصين أو المخيخ) في العينة الراتنج، باستخدام مقياس إبرة غرامة (26 ز، 1 بوصة).
    4. حرارة العينة الراتنج إلى 85 درجة مئوية في فرن تليين الراتنج للتشذيب، أو بدلاً من ذلك، استخدم جهاز تشذيب أو شفرة رقيقة أو الصنفرة.
    5. المكوس مجال الاهتمام من العينة الراتنج مع شفرة حلاقة (انظر الجدول للمواد). تحميل العينة على عقد قضبان من زجاج اﻷكريليك من العيار المطلوب على سبيل المثال، مع (قطرها 8 ملم) وطولها 1 سم مع الغراء. تقليم العينة المركبة لشبه وتمزيقها سامسونج.
    6. إعداد سيميثين (0.75 ميكرون) وسامسونج (70 نانومتر) أقسام المنطقة المشذبة باستخدام أولتراميكروتومي: مجموعة 1.5 ملم/s ل 0.75 ميكرون سمك وإلى 0.7 mm/s لسمك nm 70.
    7. تجميع المقاطع سيميثين على شركات الزجاج ووصمة عار المقاطع مع تولويدين 1% باللون الأزرق في برنامج تلفزيوني (4 دقيقة).
    8. تغسل الأجزاء عدة مرات في المياه. دراسة المقاطع الملون تحت المجهر الخفيفة استخدام 4 x (نا 0.1 ∞/-)، 10 x (نا 0.22 ∞/0.17)، 40 × (نا من 0.65 ∞/0.17)، و 100 × أهداف (نا من 1.25 ∞/0.17).
    9. تجميع المقاطع سامسونج على شبكات النيكل. إخضاع الشبكات لل 180 كيلو فولت والساعة 3، 200 س، 6، 000 x، و/أو 8,000 x التكبير.
  2. تحليل TEM
    1. اختيار المعلمات ultrastructural من أهمية بالنسبة للتحليل الكمي لل (مثلاً، بتونس مع حويصلات والميتوكوندريا أو محاور عصبية ميليناتيد ونونميليناتيد) والتقاط صور تيم هذه المعلمات تحت 3، 500 x و 6,000 x 8,000 x التكبير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتخدير سريعة وموثوقة للفئران، واعتبرت العديد من معلمات الأمان، ومساحة أمثل لوحدة التخدير أثبتت أن تكون كافية (الشكل 1أ). تم تصميم الوحدة للتحكم في الخليط من إيسوفلوراني السائل والهواء المحيط بدقة المطلوبة لعملية جراحية ناجحة في الحيوانات الصغيرة، مثل الفئران والجرذان. الهواء و isoflurane مختلطة في المبخر وفقا للإعدادات المطلوبة وتسليمها إلى مربع أو من خلال قناع للحيوان (الشكل 1أ). يجمع الكاسح وي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

خطوة حاسمة لتوصيل في الرحم هو إجراء الحقن. يتطلب حقن دقيقة في البطينين الدماغ أو في مجال آخر ذي أهمية الخبرة والتدريب العملي على المهارات. أرق تلميح ميكروكابيلاري، قد يحدث الضرر الأنسجة أقل؛ ومع ذلك، وهذا على حساب زيادة ضغط الحقن. على النقيض من انهانسر في الرحم19،20،،من2122، معدل البقاء على قيد الحياة من حقن الأجنة بعد توصيل في الرحم مرتفع جداً. يمكن حقن أجنة جميع القرن الأفريقي الرحم، حتى إذا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الزملاء مرفق الحيوان في "كلية الطب"، جامعة روهر بوخوم، تقديم الرعاية لهم الدعم والحيوان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2،4،6-تريس (ثنائي ميثيل أمينوميثيل) الفينولServa36975
26 جم × 1 بوصة إبرةHenke-Sass، Wolf GmbH
410 وحدة التخدير لمضخة الهواءالأدوات الطبية الحيوية (Univentor)8323102
النمط المصلي للفيروس المرتبط بالغدة 1 (AAV1)UKE (منشأة فيروسية أساسية)-للحصول على المراجع والمجالات المستهدفة ل AAV1 ، انظر: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ وأيضا: نواقل توصيل الجينات المصممة: الهندسة الجزيئية وتطور النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة لتحسين نقل الجينات. كوون أنا ، شافر دي في. فارم Res. 2008 مارس; 25(3):489-99. تظهر النواقل الفيروسية المؤتلفة AAV ذات التنميط الكاذب مع قفيصة فيروسية من الأنماط المصلية 1 و 2 و 5 كفاءة تفاضلية وانتحاء خلوي بعد التسليم إلى مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. برجر C, Gorbatyuk OS, فيلاردو MJ, بيدن CS, ويليامز P, S Zolotukhin, PJ راير, ماندل RJ, Muzyczka N. مول. ثير. 2004 أغسطس; 10(2):302-17. تعمل ناقلات الفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة (scAAV) التكميلية ذاتيا على تعزيز النقل الفعال بشكل مستقل عن تخليق الحمض النووي. مكارتي دي إم ، موناهان بي ، سامولسكي آر جيه. جين ثير. 2001 أغسطس; 8 (16): 1248-54.
AgaroseSigma-AldrichA9414
طبية حيوية لمضخة هواءمنخفضة التبلور (Univentor)Eheim 100
AralditeCIBA-GEIGY23857.9لتضمين
مجموعات لحن شفاطSigma-AldrichA5177-5EA
قناع التنفس الماوس المؤكسد الألومنيومالأدوات الطبية الحيوية (Univentor)-
أمبولاتالبوبرينورفينTemgesic
الشعيرات الدمويةالمسكنة للألم منتجاتعلمية GB100TF-10مع حشوة
أنهيدريد DodecenylsuccinicFluka44160
ملاقط دومون (# 3 ، 12 سم ، مستقيم ، 0.2 × 0.12 مم)كهربائية FST11203-23
فيليبس-
خيوط الإيثيكون (Ethilon ، 6-0 و 3-0)من الإيثيكونوالبوليأميد
Bepanthene-Fast
GreenSigma-AldrichF7252لتصور السوائل المحقونة مفتاح
توجيه الغاز 4/2 موصلات الأدواتالطبية الحيوية (Univentor)8433020
ملقط مرقئ للبعوض (12.5 سم ، مستقيم)FST13011-12
نسبة الهيبارين-ناتريومفارم25 000 IE / 5 مل
صندوق الحث للفئران
بغطاء متحرك أفقيا.
الأبعاد الداخلية: LxBxH: 155 مم × 115 مم × 130 مم.
سمك الجدار: 6 مم		الأدوات الطبية الحيوية (Univentor)-
ملقط القزحية (10 سم ، منحني ، مسننة) FST14007-14
مقص قزحية (11 سم ، مستقيم ، كربيد التنجستن)FST14501-14
Isofluran OP Tisch ، مسخن كهربائيا ، sm
الأبعاد الخارجية: 257 مم × 110 مم × 18 مم
منطقة التسخين: 190 مم × 90 مم
إزالة الأيزوفلوران الهروب
قناع التنفس لأسفل وفقا للوائح
الأدوات الطبية الحيوية (Univentor)-
isoflurane (Attane) JDالطبيةاستنشاق التخدير
أضواء LED RGBCameoCLQS15RGBWLEDs 2 × 15 W
مجهر ضوئي أساسي DM ELeica-4x(NA 0.1 &infin ؛ / -) ، 10x (NA 0.22 &in;/0.17) ، 40x (NA 0.65 &in;/ 0.17) ، 100x (NA 1.25 &in;/ 0.17) الأهداف
مجتذب الماصات الدقيقةالعلوم المنتجاتP-97
ملقط مرقئ للبعوض (12.5 سم ، منحني)FST13010-12
شبكات النيكل ، 200 شبكةتيد بيلا1GC200
أوزميوم (الثامن) - الأكسيدDegussa73219
أكسيد البروبيلينفلوكا82320
شفرات حلاقةشيك87-10489
بنتوباربيتال الصوديوم (ناركورين)Merial GmbH-
TC01mR 1-Channal التحكم في درجة الحرارة مع التغذية الراجعةالأدوات الطبية الحيوية (Univentor)-
Technovit 4004 مكونان من الغراءKulzer
TelemacrodeviceCanon-CanonSpiegelreflex Kamera EOS2000D ، EF-S 18-55 مم f / 3.5-5.6 IS STM الهدف ، التمديد أقل من 150 مم ، أنبوب التمديد اليدوي حلقة 7 مم ، حلقة 14 مم ، حلقة 28 مم ، حلقة عكسية ماكرو (58 مم) ، حامل نسخ Canon.
Thermopuller P-97Sutter Instruments-
جهاز شفرة حلاقة اهتزازية رقيقةKrup-مع شفرات رفيعة Szabo
تولويدين الأزرقSigma-Aldrich89640
مجهر إلكتروني ناقل الحركة C20فيليبس-مايصل إلى 200 كيلو فولت
Tygon 6/4 مادة الأنابيب لتوصيل جميع الأجزاء
القطر الخارجي: 6 مم
القطر الداخلي: 4 مم
Wa
ll السماكة: 1 مم		الأدوات الطبية الحيوية (Univentor)-
Ultracut EReichert-Jung-ultramicrotome
Univentor ScavengerBiomedical Instruments (Univentor)8338001
مقص Vannas (8 سم ، مستقيم)FST15009-08
أدوات الاغاروز راتنج الأنسجة ماكينة حلاقة زيوت تشحيم العين

المراجع

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139(1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169(1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84(2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48(2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960(2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة