تحرير الجينوم في "خطوط خلايا الثدييات" استخدام Cas كريسبر

ملخص

كريسبر Cas تقنية قوية هندسة الجينوم معقدة من النباتات والحيوانات. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لكفاءة تحرير الجينوم البشري باستخدام مختلف Cas اندونوكليسيس. نسلط الضوء على الاعتبارات الهامة ومعايير التصميم لتحسين كفاءة التحرير.

الملخص

النظام يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) متفاوت المسافات يعمل بطبيعة الحال في مناعة التكيفية البكتيرية، ولكن قد تم بنجاح إعادة توجيه الغرض منه لهندسة الجينوم في العديد من الكائنات الحية المختلفة. الأكثر شيوعاً، المرتبطة wildtype كريسبر 9 (Cas9) أو اندونوكليسي Cas12a ويستخدم تهزم مواقع محددة في الجينوم، بعدها يتم إصلاح كسر مزدوج تقطعت الحمض النووي عن طريق النهاية غير المتجانسة الانضمام إلى مسار (نج) أو (إصلاح الموجه من التماثل مسار HDR) تبعاً لما إذا كان قالب المانحين غائبة أو الموجودة على التوالي. وحتى الآن، أظهرت نظم كريسبر من الأنواع البكتيرية المختلفة لتكون قادرة على أداء التحرير الجينوم في خلايا الثدييات. ومع ذلك، على الرغم من بساطة الظاهر للتكنولوجيا، عدة بارامترات التصميم يلزم النظر، التي غالباً ما تترك المستخدمين في حيرة حول كيفية أفضل الاضطلاع بالجينوم تحرير التجارب. وهنا يصف لنا سير عمل كاملة من التصميم التجريبي لتحديد الهوية لاستنساخ الخلايا التي تحمل المرجوة من تعديلات الحمض النووي، بهدف تيسير التنفيذ الناجح للجينوم تحرير تجارب في خطوط خلايا الثدييات. نؤكد على الاعتبارات الرئيسية للمستخدمين أن تحيط علما، بما في ذلك اختيار نظام كريسبر وطول فاصل وتصميم قالب المانحين الذين تقطعت بهم السبل-واحد أوليجوديوكسينوكليوتيدي (سودن). ونحن نتصور أن سير العمل هذا سيكون مفيداً لدراسات الجينات خروج المغلوب، المرض النمذجة الجهود، أو توليد مراسل خلية خطوط.

المقدمة

القدرة على هندسة الجينوم من أي كائن حي لديه العديد من التطبيقات الطبية الحيوية والتكنولوجيا الحيوية، مثل تصحيح الأمراض المسببة للطفرات، وبناء النماذج الخلوية الدقيقة لدراسات الأمراض، أو توليد الزراعية المحاصيل مع الصفات المرغوب فيه. منذ مطلع هذا القرن، تم استحداث تكنولوجيات مختلفة لهندسة الجينوم في خلايا الثدييات، بما في ذلك ميجانوكليسيس^1،2،3، زنك إصبع نوكليسيس^4،5، أو النسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس)^6،7،،من⁸⁹. هذه التكنولوجيات السابقة غير صعبة للبرنامج أو شاقة التجمع، مما يعوق اعتمادها على نطاق واسع في البحوث والصناعة.

في السنوات الأخيرة، بشكل منتظم مجمع إينتيرسباسيد في يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)-برز نظام المرتبطة كريسبر (Cas) جينوم جديدة قوية هندسة تكنولوجيا^10،11. أصلاً نظام المناعة تكيفية في البكتيريا، قد تم بنجاح نشر لتعديل الجينوم في النباتات والحيوانات، بما فيها البشر. سبب الرئيسي لماذا كريسبر Cas قد اكتسب شعبية الكثير في وقت قصير كهذا هو أن العنصر الذي يجلب endonuclease الأكاديمية الرئيسية، مثل Cas9 أو Cas12a (المعروفة أيضا باسم Cpf1)، إلى الموقع الصحيح في الجينوم هو مجرد قطعة قصيرة من دليل واحد تشيميريك RN (سجرنا)، وهي واضحة للتصميم ورخيصة توليف. بعد تجنيدهم إلى الموقع المستهدف، تعمل مقص الجزيئية الإنزيم Cas وكليافيس الحمض النووي المرتبطة مع به روفك، HNH، أو نشاط المجالات^12،،من¹³¹⁴. بعد ذلك يتم إصلاح كسر الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة الناتجة (جهاز تسوية المنازعات) بالخلايا عن طريق نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج) أو مسار الإصلاح الموجه من التماثل (HDR). في غياب إصلاح قالب، يتم إصلاح جهاز تسوية المنازعات بالمسار نهيج عرضه للخطأ، ويمكن أن يؤدي إلى شبه عشوائي الإدراج أو الحذف من النيوكليوتيدات (إينديلس) في موقع قص، يحتمل أن تسبب فراميشيفت الطفرات في الجينات ترميز البروتين. ومع ذلك، حضور الجهات مانحة قالب يحتوي على الحمض النووي التغييرات المطلوبة، يتم إصلاح جهاز تسوية المنازعات بالمسار HDR عالية الدقة. وتشمل الأنواع الشائعة من قوالب المانحة النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل (سودنس) ووالبلازميدات. عادة ما تستخدم في السابق إذا كانت التغييرات الحمض النووي المقصود صغيرة (على سبيل المثال، تغيير زوج قاعدة واحدة)، في حين أن هذا الأخير يستخدم عادة إذا كان أحد يرغب في إدراج تسلسل طويلة نسبيا (على سبيل المثال، تسلسل ترميز بروتين فلوري أخضر أو التجارة والنقل) إلى المكان المستهدف.

النشاط اندونوكليسي من البروتين Cas يتطلب وجود بروتوسباسير عزر المتاخمة (بام) في الموقع المستهدف¹⁵. بام Cas9 في نهاية 3 'بروتوسباسير، بينما بام Cas12a (وتسمى أيضا Cpf1) في النهاية 5' بدلاً من¹⁶. Cas-دليل الحمض النووي الريبي المعقدة غير قادر على عرض جهاز تسوية المنازعات إذا تغيب¹⁷بام. ومن ثم، بام يضع قيداً على مواقع الجينوم قادرة على تنشق فيه نوكلاس Cas خاصة. لحسن الحظ، يحمل nucleases الأكاديمية الصينية للعلوم من مختلف الأنواع البكتيرية عادة متطلبات مختلفة بام. ومن ثم، بإدماج مختلف Cas كريسبر نظم لدينا الأدوات الهندسية، نحن توسيع نطاق المواقع التي قد تكون مستهدفة في جينوم. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء هندسة عكسية إنزيم الأكاديمية الصينية للعلوم طبيعية أو تطورت إلى الاعتراف بتسلسل بام بديلة، مزيد من توسيع نطاق أهداف الجينوم موجوداً للتلاعب^18،،من¹⁹²⁰.

على الرغم من أن تتوفر أنظمة كريسبر Cas متعددة الأغراض الهندسية الجينوم، اعتمدت معظم المستخدمين لهذه التكنولوجيا أساسا على نوكلاس Cas9 من العقدية المقيّحة (SpCas9) لأسباب متعددة. أولاً، فإنه يتطلب أم نج نسبيا ببساطة، خلافا للعديد من البروتينات Cas الأخرى التي يمكن أن تهزم سوى حضور PAMs أكثر تعقيداً. وثانيا، أنها endonuclease الأكاديمية الأولى التي سيتم نشرها بنجاح في الخلايا البشرية^21،22،،من²³²⁴. وثالثاً، SpCas9 هو إلى حد بعيد أفضل الإنزيم تتسم حتى الآن. إذا لم يرغب باحث في استخدام آخر Cas نوكلاس، أنه أو أنها غالباً ما ستكون واضحة بشأن أفضل السبل لتصميم التجربة وجيدا كيف سوف تؤدي الإنزيمات الأخرى في مختلف السياقات البيولوجي مقارنة SpCas9.

توفير الوضوح لأداء مختلف Cas كريسبر النظم النسبية، قد أجرينا مؤخرا مقارنة منهجية لخمسة Cas اندونوكليسيس-SpCas9، الإنزيم Cas9 من المكوّرات العنقودية الذهبية (SaCas9)، الإنزيم Cas9 من وجود النيسرية السحائية (NmCas9)، الإنزيم Cas12a من أسيدامينوكوككوس sp. BV3L6 (AsCas12a)، والانزيم Cas12a من بكتيريا لاتشنوسبيراسيي ND2006 (LbCas12a)²⁵. لمقارنة منصفة، يمكننا تقييم nucleases Cas مختلفة باستخدام نفس مجموعة من المواقع المستهدفة وغيرها من الشروط التجريبية. الدراسة أيضا تحديد معايير التصميم لكل نظام كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم، الذي سيكون بمثابة مرجع مفيد للمستخدمين للتكنولوجيا. هنا، على نحو أفضل تمكن الباحثين من الاستفادة من كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم نظام، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لهندسة الجينوم الأمثل مع مختلف الإنزيمات Cas9 و Cas12a (انظر الشكل 1). ليس فقط يتضمن البروتوكول التجريبي من التفاصيل لكن الاعتبارات الخاصة بالتصميم أيضا أقصى حد احتمال نتيجة هندسة الجينوم ناجحة في خلايا الثدييات.

الشكل 1 : لمحة عامة عن سير العمل لتوليد الجينوم تحرير خطوط الخلايا البشرية- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

البروتوكول

1-تصميم سجرناس

1. حدد نظام كريسبر Cas مناسب.
   1. أولاً، تفقد المنطقة المستهدفة لمتواليات بام من جميع نوكليسيس Cas9 و Cas12a التي أظهرت أن يكون متوفراً في خلايا الثدييات^16,21-32. خمسة الإنزيمات المستخدمة بشكل متكرر ترد في الجدول 1 جنبا إلى جنب مع PAMs الخاصة بهم.
      ملاحظة: بالإضافة إلى اندونوكليسيس المدرجة في الجدول 1، وهناك أخرى أقل استخداماً الإنزيمات Cas التي انتشرت بنجاح في خلايا الثدييات أيضا، مثل نوكلاس Cas9 من ثرموفيلوس العقدية (St1Cas9) التي تسلم ناجو بام. إذا لم يحتو موقع الهدف المرغوب فيه بام معروفة، ثم واحدة لن قادراً على استخدام نظام كريسبر Cas لهندسة الجينوم.
   2. ثانيا، النظر في أية خصائص معروفة المكان المستهدف الجينوم أو الجينات. تتضمن بعض الخصائص تأخذ في الاعتبار مستويات التعبير الجيني أو الكروماتين إمكانية الوصول وعما إذا كان البعض هناك عن كثب المتعلقة بتسلسل كذلك.
      ملاحظة: بعض الإنزيمات أكثر ملاءمة لسياقات بيولوجية معينة. على سبيل المثال، لتحرير محور الجينوم متكررة أو جين مع عدة بارالوجس وثيقة أخرى، ينصح باستخدام أما AsCas12a (بسبب أقل درجة تحمله لعدم التطابق بين سجرنا والهدف الحمض النووي من SpCas9 و LbCas12a) أو SaCas9 (نظراً لما شرط للفواصل أطول، مما يوفر خصوصية استهداف أعلى)²⁵.

اندونوكليسي Cas	بام	الطول الأمثل مباعد
SpCas9	نج	17-22 nt شاملة
SaCas9	ننجررت	≥ 21 nt
NmCas9	ننننغات	≥ 19 nt
AsCas12a و LbCas12a	تتف	≥ 19 nt

الجدول 1: بعض استخداماً الإنزيمات Cas مع PAMs المشابهة وأطوال سجرنا الأمثل. N = أي النوكليوتيدات (A, T، ز، أو ج)؛ R = A أو G؛ V = A، C، أو زاي

2. حدد تسلسل مباعدة مناسبة. تحديد تسلسل فريدة من نوعها قدر الإمكان التقليل من مخاطر أحداث انشقاق خارج الهدف، أما عن طريق فحص الجينوم المستهدفة مع انفجار³³ أو باستخدام عدة أدوات متاحة مجاناً على الإنترنت، مثل: (أ) برنامج من مختبر فنغ تشانغ³⁴ (http://crispr.mit.edu/)؛ (ب) CHOPCHOP³⁵ (http://chopchop.cbu.uib.no/)؛ (ج)-هش ه³⁶ (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)؛ (د) كريسبور³⁷ (http://crispor.tefor.net/)؛ (ﻫ (Cas-أوفيندير³⁸ (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
   ملاحظة: يمكن أن تختلف الطول الأمثل لفاصل الفترة من 17 إلى 25 النيوكليوتيدات (nt) شاملة، اعتماداً على المراجع المصدقة التي يتم استخدام إنزيم (انظر الجدول 1). بالنسبة Cas9، فاصل المنبع في بام، بينما بالنسبة Cas12a، فاصل المتلقين للمعلومات PAM. "الإضافة إلى ذلك"، الكفاءة HDR يسقط سريعاً مع تزايد المسافة من موقع قص. ومن ثم لتحرير الحمض النووي دقيقة، ضع سجرنا أقرب ما يكون إلى موقع التعديل المقصود.
3. توليف الحمض النووي النوكليوتيد مع يتدلى المناسبة بلازميد كريسبر الذي يتم استخدامه.
   1. إضافة النوكليوتيدات ز أمام المباعدة إذا لم يكن المركز الأول من الدليل أ زاي تحديد تسلسل عكس مكملة فاصل. إضافة يتدلى اللازمة لأغراض الاستنساخ.
      ملاحظة: على سبيل التوضيح، والبلازميدات المستخدمة في لدينا دراسة التقييم²⁵، ترد النوكليوتيد توليفها في الجدول 2. استخدام المثال الوارد في الشكل 2 كدليل، إذا لزم الأمر. تتوفر العديد من كريسبر البلازميدات من المصادر التجارية (مثلاً، أدجيني). وترد بعض والبلازميدات أكثر شعبية في الجدول للمواد.

بلازميد كريسبر	التسلسل
pSpCas9 و pSaCas9	معنى: 5 '-نننننننننننننننننننن كاكك (ز)-3' أنتيسينسي: 3 '--(ج) نننننننننننننننننننننكاا-5'
pNmCas9	معنى: 5 '-نننننننننننننننننننن كاكك (ز)-3' أنتيسينسي: 3 '--(ج) ننننننننننننننننننننكاك-5'
pAsCas12a و pLbCas12a	معنى: 5 '-أجاتننننننننننننننننننننن-3' أنتيسينسي: 3 '-ننننننننننننننننننننااا-5'

الجدول 2: النوكليوتيد اللازمة لاستنساخ التسلسلات سجرنا في البلازميدات كريسبر المستخدمة في تقييم أجرى مؤخرا دراسة²⁵- يتدلى بالخط المائل.

الشكل 2 : مثال يوضح كيفية تحديد المواقع المستهدفة وتصميم النوكليوتيد للاستنساخ في كريسبر والبلازميدات. محور الجينوم الهدف هنا إكسون 45 CACNA1D الجينات البشرية. PAMs SpCas9 و SaCas9 هي نج ونجرت على التوالي، ويسلط الضوء على اللون الأحمر، في حين بام ل AsCas12a و LbCas12a تتن ويتم تمييز باللون الأخضر. الشريط الأفقي الأحمر يشير إلى بروتوسباسير SpCas9 و SaCas9، بينما الأخضر شريط أفقي يشير إلى بروتوسباسير للإنزيمات Cas12a اثنين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2-الاستنساخ من النوكليوتيد إلى متجه العمود الفقري

1. فوسفوريلاتي ويصلب النوكليوتيد الإحساس وأنتيسينسي.
   1. إذا النوكليوتيد هي المجففة بالتبريد، ريسوسبيند منهم إلى تركيز 100 ميكرومتر في حمض تريس-الإيثيلين (يدتا) (TE المخزن المؤقت، انظر الجدول للمواد) أو ddH₂o.
   2. إعداد 10 ميليلتر رد فعل مزيج يحتوي على 1 ميليلتر اليغنوكليوتيد الشعور، 1 ميليلتر من العقاقير اليغنوكليوتيد، 1 ميليلتر من الحمض النووي T4 ليجاسى المخزن المؤقت (10 x)، 1 ميليلتر من T4 بولينوكليوتيدي كيناز (بنك)، و 6 ميليلتر ddH₂ميكس O. جيدا من قبل بيبيتينج ووضع المزيج الرد في قبرصي الحرارية كلير باستخدام المعلمات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ومنحدر وصولاً إلى 25 درجة مئوية في 6 درجة مئوية/دقيقة.
   3. تضعف فعل مزيج 1: 100 في ddH₂س (مثلاً، 2 ميليلتر رد فعل مزيج + 198 ميليلتر ddH₂س).

الشكل 3 : مثال على بلازميد كريسبر. () ألف خريطة تبين مختلف الميزات الهامة بلازميد. هنا، محركات المروج EF-1a التعبير عن Cas9، بينما المروج U6 التعبير عن سجرنا محركات الأقراص. Amp(R) يشير إلى جينات مقاومة الأمبيسلّين في بلازميد. (ب) التسلسل "موقع الاستنساخ بسي-ببلي" بلازميد. تسلسل الاعتراف ببسي هو جاجاك وهو مبين باللون الأحمر، بينما تتابع الاعتراف ببلي هو هفوة-ن₅-لجنة مكافحة الإرهاب ومبين باللون الأخضر. (ج) الإشعال التي يمكن استخدامها لمستعمرة PCR للتحقق ما إذا كان التسلسل سجرنا قد تم استنساخ بنجاح إلى بلازميد. تتم الإشارة إلى التمهيدي hU6_forward بسهم أرجواني على خريطة بلازميد، بينما يشار إلى التمهيدي M13R(-20) العالمي بشكل سهم وردي على الخريطة بلازميد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2. هضم بلازميد كريسبر مع إنزيم التقييد ملائمة.
   ملاحظة: استنساخ سجرناس عادة تعتمد على الجمعية البوابة الذهبية مع نوع إنزيمات التقييد IIs. ويمكن استخدام الإنزيمات المختلفة لمختلف كريسبر والبلازميدات. بالنسبة pSpCas9، استخدم بسي أو ببلي (انظر الشكل 3). بالنسبة pSaCas9، pNmCas9، pAsCas12a، و pLbCas12a، استخدم بسمبي.
   1. إعداد 20 ميليلتر رد فعل مزيج يحتوي على 1 ميكروغرام من ناقلات بلازميد دائري، 2 ميليلتر من المخزن المؤقت (10 x)، 1 ميليلتر من إنزيم التقييد بسي (مثلاً، أو ببلي، أو بسمبي)، و ddH₂س إلى وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر. احتضان رد فعل في 37 درجة مئوية ح 2.5.
   2. أضف 1 ميليلتر من الجمبري الفوسفاتيز القلوية (SAP) لرد فعل، واحتضان في 37 درجة مئوية لآخر 30 دقيقة.
   3. آرو الرد بإضافة 5 ميليلتر من 6 × تحميل الحمض النووي صبغ (انظر الجدول للمواد)، مزيج جيد، وحل رد فعل على نسبة 0.8% [اغروس] هلام مع 1 × العازلة تريس-خلات-يدتا (تاي). ثم المكوس الفرقة الصحيحة والمضي قدما لجل تنقية الموجه خطية.
3. سد النوكليوتيد ملدنة إلى بلازميد كريسبر هضمها.
   1. إعداد مزيج رد فعل ميليلتر 10: 50 نانوغرام من ناقلات خطية، 1 ميليلتر من النوكليوتيد ملدنة المخفف، 1 ميليلتر من الحمض النووي T4 ليجاسى المخزن المؤقت (10 x)، 1 ميليلتر ليجاسى T4 الحمض النووي، و ddH₂س إلى وحدة تخزين نهائي من 10 ميليلتر (انظر الجدول للمواد). تبني رد فعل على 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو في درجة حرارة الغرفة ح 2.
      ملاحظة: لتسريع عملية ربط، استخدام تركيز T4 الحمض النووي ليجاسى واحتضان هذا المزيج رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (انظر الجدول للمواد).
4. تحويل المنتجات الواصلة إلى كيميائيا المختصة كولاي الخلايا (انظر 1 ملف تكميلي). انتشار تحول الخلايا البكتيرية على صفيحة أجار رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
5. أداء مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد البكتيريا مع إدراج.
   1. إعداد مجموعتين من أنابيب قطاع بكر العقيمة. في تعيين 1، إضافة ميليلتر 4.7 ddH₂س، بينما في مجموعة 2، وإضافة 50 ميليلتر من مرق LB مع المضادات الحيوية المناسبة (مثل 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين).
   2. مع تلميح ماصة معقمة، اختيار مستعمرة قبالة اللوحة وانتقاد ذلك بإيجاز في أنبوب 1 تعيين، وترك التلميح في أنبوب 2 تعيين. كرر مستعمرات قليلة، مع التأكد من استخدام أنابيب PCR مختلف في كل مرة.
      ملاحظة: بشكل عام، فحص أربع مستعمرات غير كافية. ولكن هذا قد تختلف تبعاً لكفاءة الاستنساخ.
   3. إضافة الكواشف التالية لكل أنبوبة مجموعة 1 (10 ميليلتر PCR): 5 ميليلتر من مزيج الرئيسي x PCR 2 (مع تحميل صبغ، انظر الجدول للمواد)، 0.15 ميليلتر من إحساس أو antisense اليغنوكليوتيد (100 ميكرومتر)، 0.15 ميليلتر من التمهيدي (100 ميكرومتر) استهداف بلازميد كريسبر المصب أو حتى تيار كاسيت سجرنا على التوالي (انظر الشكل 3).
      ملاحظة: المنتج بكر من الناحية المثالية التي ينبغي أن يؤدي حجم منتج لما يقرب من 150 bp أو نطاقات أكبر، حتى أن أي إيجابية لم يخطئ مبلمر.
   4. تشغيل في تقارير إتمام المشروعات في cycler حرارية استخدام المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 95 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 2)، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (الخطوة 3)، 72 درجة مئوية لمدة 30 s (الخطوة 4)، كرر الخطوات 2\u20124 لآخر دورات 34، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وعقد في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قد تحتاج انلينغ درجة حرارة 60 درجة مئوية تكون الأمثل لكبسولة تفجير تصميم. وقت استطالة 30 ثانية يمكن أن تختلف أيضا اعتماداً على حجم amplicon بكر المتوقعة وبوليميراز الدنا المستخدمة.
   5. حل ردود الفعل على 1% [اغروس] هلام استخدام المخزن المؤقت x TAE 1.
   6. تطعيم مستعمرة غلة عصابة إيجابية في PCR واسطة نقل 50 ميليلتر من ثقافته من الأنبوب 2 تعيين المطابق في أنبوب مخروطية كبيرة التي تحتوي على 5 مل رطل مع المضادات الحيوية مناسبة. واسمحوا ثقافة تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة-شاكر.
   7. عزل البلازميدات من استخدام الثقافة بين عشية وضحاها مينيبريب كيت (انظر الجدول للمواد)، وتسلسل العينة باستخدام التمهيدي PCR مستعمرة لا اليغنوكليوتيد الشعور أو أنتيسينسي (hU6_forward أو M13R(-20) في الشكل 3).
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، تنفيذ ماكسيبريب من بلازميد كريسبر التحقق من التسلسل للحصول على أكبر كمية لتجارب المتلقين للمعلومات.

3-تصميم وتركيب قوالب إصلاح

ملاحظة: للهندسة الجينوم الدقيقة، يحتاج قالب تحديد التعديلات الحمض النووي المطلوب تقديمها جنبا إلى جنب مع الكواشف كريسبر. تحريرات الحمض النووي الصغيرة مثل تغيير النوكليوتيدات واحدة، قوالب المانحة سودن أنسب (انظر القسم 3.1). تحريرات الحمض النووي أكبر مثل الإدراج للتجارة والنقل العلامة 5 'أو 3' الجينات ترميز البروتين خاصة، قوالب المانحة بلازميد أنسب (انظر القسم 3.2).

1. تصميم وتركيب قالب مانحة سودن (انظر الشكل 4).
   1. تحديد الصحيح حبلا التسلسل الذي ينبغي أن يتبع القالب.
      ملاحظة: Cas12a المعارض تفضيلها سودنس تسلسل حبلا غير المستهدفة، بينما Cas9 المعارض تفضيل لتسلسل سودنس حبلا المستهدفة بدلاً من²⁵ (انظر الشكل 4).
   2. التأكد من أن التسلسل الذي تم إصلاحه ليس استهدافها نوكلاس سجل المستخلصات الكيميائية المحددة مرة أخرى. على سبيل المثال، يتحور في بام بطريقة أنه لم يحدث أي تغيير من الأحماض الأمينية أو القضاء عليها أم من القالب المانحة إذا كان لديه لا نتيجة وظيفية. استخدام المثال المعطى في الشكل 4ب كدليل، إذا لزم الأمر.
   3. أن تقرر إذا كان المطلوب هو قالب مانحة متماثلة أو غير متماثلة. للمانحين متماثل، تأكد أن كل ذراع التماثل المرافقة الموقع تعديل الحمض النووي على الأقل 17 nt طويلة²⁵. قوالب المانحين غير المتناظر، استخدام أطول 5 الأسلحة لإجراء التغييرات المطلوبة الحمض النووي (انظر الشكل 4). ومن المهم ضمان أن الذراع أقصر حوالي 37 nt في الطول، بينما الذراع التماثل الأخرى هو حوالي 77 nt في الطول^25،39.
   4. تركيب قالب مصمم كقطعة من الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل.
      ملاحظة: سودنس غير المتماثلة يمكن، ولكن لا دائماً، يحمل درجة أعلى من الكفاءة HDR من سودنس متماثل. وبصفة عامة، مانحا غير المتناظر عادة ينفذ على الأقل فضلا عن المانحين متماثل، عند مصممة بشكل صحيح. ومع ذلك، القالب غير المتناظر التكاليف أكثر بكثير لأنها أطول ومن ثم يتطلب تنقية التفريد (صفحة) polyacrylamide هلام أو إجراء توليف خاصة. الضربة القاضية جين روتينية عادة تعتمد على مسار إصلاح نج ولا تحتاج إلى قالب إصلاح. ومع ذلك، في حالة انخفاض كفاءة خروج المغلوب، تصميم قالب مانحة سودن الذي يحتوي على طفرة فراميشيفت وهو مالا يقل عن 120 nt في الطول^25،40.

الشكل 4 : تصميم قوالب المانحة سودن. () التخطيطي توضح النماذج الممكنة المختلفة. مستطيلات أفقية حمراء تشير إلى حبلا غير المستهدفة (NT)، في حين تشير إلى المستطيلات الزرقاء حبلا المستهدفة (T). وبالإضافة إلى ذلك، تشير المستطيلات الخضراء الصغيرة بالتعديلات المرجوة الحمض النووي (مثل التغييرات النوكليوتيدات واحدة). عندما يستخدم سودن متماثل، الحد الأدنى لطول كل ذراع التماثل ينبغي أن يكون على الأقل 17 nt (ولكن يمكن أن تكون أطول). سودنس غير المتناظر، يبدو سودن تي 37/77 أن الأمثل لتقرير التنمية البشرية التي يسببها SpCas9، بينما يبدو أن سودن NT 77/37 الأمثل لتقرير التنمية البشرية التي يسببها Cas12a. L = الذراع الأيسر التماثل. R = الذراع اليمنى التماثل. (ب) مثال محدد لشرح كيفية تصميم قوالب سودن. هنا، موضع الهدف الجينوم إكسون 45 CACNA1D الجينات البشرية. بام Cas9 الوردي وتحتها خط، في حين بام Cas12a اللون البنى وأكد. والهدف لخلق طفرة مغلطه (المميزة باللون الأخضر) بتحويل آغو (ترميز سيرين) AGG (ترميز ارجينين). لمنع إعادة الاستهداف ب Cas12a، هي تحور بام تتك إلى كالتكس. لاحظ أنه لا يوجد تغيير في الحمض الأميني (أو واوك كل رمز تيروزين). إلى منع إعادة استهداف Cas9، يتم استبداله كودون آغو كودون كاربايد (غامق)، كلا من التعليمات البرمجية التي لسيرين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2. تصميم واستنساخ قالب مانحة بلازميد مناسبة. على سبيل المثال، قد يحتوي على تسلسل بروتينات فلورية خضراء يحيط بها الأسلحة الطويلة التي مثلى لموضع الهدف الجينوم (انظر الشكل 5).
   1. التأكد من أن تسلسل المعدل ليس استهدافها نوكلاس سجل المستخلصات الكيميائية المحددة مرة أخرى. على سبيل المثال، قد يمكن تقسيم في بروتوسباسير بالعلامة (بروتينات فلورية خضراء) المدرج. بدلاً من ذلك، قد تحور بام أو إزالتها من قالب المانحين بطريقة لا تؤثر على وظيفة الجينات.
   2. تضخيم الأسلحة التماثل من الحمض النووي باستخدام PCR. عادة ما يكون طول كل ذراع التماثل 1000 إلى 1500 شركة بريتيش بتروليوم.
      ملاحظة: لتسهيل استنساخ، ضمان أن التمهيدي إلى الأمام للذراع الأيسر التماثل وعكس التمهيدي للتماثل حق تسليح كل مالا يقل عن 20 nt تداخل التسلسل مع العمود الفقري الموجه محدد. بالإضافة إلى ذلك، تكفل التمهيدي العكسية للذراع الأيسر التماثل والتمهيدي إلى الأمام للذراع اليمنى التماثل بعض متواليات متداخلة مع العلامة حانمه كذلك.
   3. استنساخ اثنين من الأسلحة التماثل والعلامة (التجارة والنقل) إلى ناقلات العمود الفقري باستخدام جيبسون الجمعية⁴¹ (انظر الجدول للمواد). التحقق من بلازميد قبل سانغر التسلسل باستخدام إلى الأمام وعكس الإشعال التي المنبع والمصب من القالب المانحين على التوالي.
      ملاحظة: سانغر التسلسل متاح على نطاق واسع وبأسعار زهيدة كخدمة تجارية. إرسال قاسمة بلازميد جنبا إلى جنب مع الإشعال التسلسل لموفر خدمة.
   4. لينيريزي القالب المانحين مع إنزيم التقييد أن التخفيضات بلازميد مرة واحدة فقط أما المنبع للذراع الأيسر التماثل أو المتلقين للذراع اليمنى التماثل.
      ملاحظة: في الآونة الأخيرة، المانحين قطع مزدوجة، الذي يحيط به تسلسل سجرنا-بام وهو صادر من بلازميد بعد انشقاق نوكلاس Cas المقابلة، قد ثبت لزيادة كفاءة HDR⁴². عندما يتم إدراجها في تسلسل بام سجرنا المنبع والمصب من التماثل اليسار واليمين من الأسلحة على التوالي (على سبيل المثال عن طريق الجمعية جيبسون)، قد خفضت مدة ذراع التماثل إلى 300 شركة بريتيش بتروليوم، وليس هناك حاجة لينيريزي بلازميد.

الشكل 5 : تصميم واستنساخ نموذج المانحة بلازميد. () أن الهدف من هذا المثال محددة فتيل P2A-التجارة والنقل إلى ج-محطة البروتين كلتا. المستطيل الأفقي الأزرق يشير إلى الذراع الأيسر التماثل، بينما المستطيل الأفقي الأحمر يشير إلى الذراع اليمنى التماثل. حروف تشير إلى تسلسل ترميز البروتين، في حين تشير الأحرف إلى تسلسلات غير الترميز. العبارات PAMs SpCas9 و Cas12a والخط المائل. (ب) الجهات مانحة بلازميد قالب التي يمكن استخدامها للعلامة اندوجينوسلي P2A-التجارة والنقل في ج-محطة كلتا. تسلسل التمهيدي المتوفرة التي يمكن أن يستخدمها لاستنساخ بلازميد جيبسون الجمعية. شروط PCR كما يلي: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 98 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 2)، 63 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 3)، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (الخطوة 4)، كرر الخطوات 2\u20124 لآخر دورات 34، 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، وعقد في 4 درجات مئوية. تتوافق مع الحروف السوداء لمتواليات مكافحة ناقلات، تتوافق مع الأحرف الزرقاء في الذراع اليسرى التماثل، تقابل الحروف الخضراء P2A-التجارة والنقل، وتتوافق مع أحرف حمراء في الذراع اليمنى التماثل. ملاحظة أن مجرد تسلسل ترميز P2A-التجارة والنقل بنجاح إدماج محور الهدف، إعادة استهداف SpCas9 لن يكون ممكناً، منذ 9 فقط ستترك nt، بروتوسباسير (جتجكاككاج) دون تغيير. وعلاوة على ذلك، للحيلولة دون إعادة استهداف Cas12a، باسيبيرس ثلاثة المصب فورا لوقف كودون (بالخط العريض) يتم حذف من تسلسل بلازميد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4-خلية تعداء

ملاحظة: يتم كتابة الأجزاء المتبقية من البروتوكول مع خلايا HEK293T في الاعتبار. ثقافة الوسيلة المستخدمة تتكون من دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع الجلوكوز 4.5 غرام/لتر، 10% مصل بقرى الجنين (FBS) ومم 2 لتر-الجلوتامين والبنسلين/ستربتوميسين 0.1%. الخطوات المختلفة للبروتوكول قد يتم تعديلها وفقا لخط الخلية الفعلية المستخدمة. كل خلية ثقافة العمل في الفئة الثانية مجلس الوزراء السلامة الأحيائية لضمان بيئة عمل عقيم.

1. بذور 1.8 × 10⁵ خلايا في صفيحة زراعة الأنسجة 24-جيدا قبل تعداء بيوم واحد.
   1. فصل الخلايا من يسفط وسائل الإعلام ومن ثم إضافة 150 ميليلتر 0.25% يدتا التربسين كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
   2. تحييد التربسين بإضافة 150 ميليلتر (أو وحدة التخزين x 1) خلية ثقافة وسائل الإعلام. نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا الموجودة في الطرد أعلى في 1000 x ز مقاعد البدلاء لمدة 5 دقائق.
   3. نضح المادة طافية، وريسوسبيند مع 5 مل من خلية ثقافة وسائل الإعلام. في أنبوب الطرد مركزي منفصلة، الكوة ميليلتر 10 حل تريبان الأزرق 0.4 في المائة. ثم أضف في 10 ميليلتر حراكه الخلايا من الخطوة 4.1.2 ومزيج دقيق.
   4. "الماصة؛" 10 ميليلتر من الخليط (خلايا + تريبان الأزرق) في هيموسيتوميتير. المضي قدما لعد الخلايا يدوياً أو باستخدام عداد الآلي خلية.
   5. بذور 1.8 × 10⁵ خلايا في بئر واحدة من صفيحة زراعة الأنسجة 24-جيدا.
2. إعداد مزيج تعداء التي تتضمن أما 500 نانوغرام بلازميد كريسبر (لوساطة نج التحرير) أو 300 نانوغرام من بلازميد كريسبر و 300 نانوغرام قالب المانحة (لتقرير التنمية البشرية بوساطة التحرير)، وفقا للإرشادات المقدمة مع الكاشف تعداء (انظر جدول المواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة الوقت الموصى به (عادة حوالي دقيقة 10\u201220).
3. إضافة مزيج تعداء الخلايا بطريقة دروبويسي، ولطف دوامة اللوحة بعد.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO₂ الهواء حاضنة ح 24 (للتجارب المستندة إلى نج) أو ح 72 (للتجارب المستندة إلى تقرير التنمية البشرية).

5-الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) transfected الخلايا

1. فصل الخلايا من يسفط وسائل الإعلام ومن ثم إضافة 150 ميليلتر من 0.25% التربسين-يدتا كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
2. تحييد التربسين بإضافة 150 ميليلتر (أو وحدة التخزين x 1) خلية ثقافة وسائل الإعلام. نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في ميكروسينتريفوجي في 235 س ز لمدة 5 دقائق.
3. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). تصفية الخلايا عن طريق 30 ميكرون أو خلية مصفاة في أنبوب 5 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
4. إعداد آخر أنبوب الطرد المركزي مع حوالي 100 ميليلتر ثقافة وسائل الإعلام أو 2% FBS في برنامج تلفزيوني لمجموعة من الخلايا.
5. في cytometer التدفق، بوابة الخلايا مع الخلايا غير transfected كعنصر سلبي. فرز وتجميع الخلايا transfected، وفقا للأسفار التي علامة موجودة على بلازميد كريسبر المستخدمة. على سبيل المثال، إذا كان يحمل بلازميد جينات مشري، فرز للخلايا الحاملات لطلب تقديم العروض.
   ملاحظة: سيكون والبلازميدات كريسبر مختلف علامات التحديد مختلفة. تحمل مجموعة البلازميدات (pSpCas9، pSaCas9، pNmCas9، pAsCpf1، و pLbCpf1) المستخدمة في هذه الدراسة تقييم البروتين الفلورسنت البرتقالي (برنامج النفط مقابل الغذاء) أو الجين مشري.

6-التوسع في استنساخ الفردية

1. الطرد المركزي خلايا تم فرزها في الطرد أعلى بأقصى سرعة ممكنة (18,000 س ز) مقاعد البدلاء لأدنى 5 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 300 ميليلتر ثقافة الإعلام. لوحة البذور 200 ميليلتر الخلايا في ثقافة الأنسجة 24-جيدا والسماح لهم باستعادة لبضعة أيام في حاضنة 37 درجة مئوية. تبقى الخلايا المتبقية 100 ميليلتر للباب 7.
2. بمجرد بدء الخلايا تصبح المتلاقية، ممر لهم وفقا للخطوات 4.1.1\u20124.1.3. بذور الخلايا قليلة في طبق استنبات الأنسجة 100 مم للسماح بمساحة كافية للمستعمرات الفردية تنمو. احتضان عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO₂ الهواء حاضنة.
   ملاحظة: حاول تخفيف مختلف. الخلايا المفردة بحاجة إلى مساحة كافية تنمو كمستعمرات فردية. ومع ذلك، أنها أيضا لا يمكن متفرق مفرط، كما بعض خطوط الخلايا لا تنمو جيدا عند عدد الخلايا قليلة جداً.
3. حالما يبدأ النموذج، اختر منها تحت المجهر (مع تكبير 4 x) المستعمرات ووضع كل استنساخ في بئر فردية من لوحة 24-البئر الذي يحتوي على خلية ثقافة وسائل الإعلام. احتضان عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO₂ الهواء حاضنة حتى تصبح الخلايا المتلاقية.
   ملاحظة: بديل لتخفيف المسلسل والانتقاء مستعمرة لاستخدام التدفق الخلوي لفرز للخلايا المفردة في لوحة 96-جيدا. ومع ذلك، قد لا يعمل هذا لبعض خطوط الخلايا التي لا تنمو جيدا عند وجود خلية واحدة فقط.

7-تقييم كفاءة التحرير

1. استخراج الحمض النووي من سينتريفوجينج 100 ميليلتر فرز الخلايا المتبقية (من الخطوة 6، 1) في أجهزة الطرد مركزي مقاعد البدلاء أعلى بأقصى سرعة ممكنة (18,000 س ز) لأدنى 5 Aspirate المادة طافية والمضي قدما لعزل الحمض النووي باستخدام أدوات استخراج (انظر الجدول من المواد).
2. أداء T7 endonuclease أنا (T7EI) الانقسام والتحليل (انظر الشكل 6).
   1. قم بإعداد من 50 ميليلتر PCR التي تحتوي على 10 ميليلتر بكر رد فعل المخزن المؤقت (5 س)، 1 ميليلتر من دنتب ميكس (10 ملم)، 2.5 ميليلتر من المعرفة من قبل المستخدم التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، 2.5 ميليلتر من المعرفة من قبل المستخدم التمهيدي عكس (10 ميكرومتر)، 0.5 ميليلتر من دنا بوليميريز، 2\u20125 ميليلتر من قالب الدنا الجينومي (اعتماداً على كيفية العديد من الخلايا تم فرز)، ثم أعلى ما يصل إلى 50 ميليلتر مع ddH₂س (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: كبسولة تفجير مصممة للجناح في المكان المستهدف الجينوم والعائد نتاج بكر حول 400\u2012700 هناك عادة واحد التمهيدي هو في وضع أقرب إلى موقع قص إنزيم Cas من التمهيدي الأخرى، حيث يكون نتيجة للفحص T7EI شريطين متميزة في حج نشأ جيل (انظر الشكل 6).
   2. تشغيل بكر في cycler حرارية مع المعلمات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 98 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 2)، 63 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 3)، 72 درجة مئوية لمدة 30 s (الخطوة 4)، كرر الخطوات 2\u20124 لآخر دورات 34، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، وعقد في 4 درجات مئوية.
   3. حل رد فعل على 2% [اغروس] هلام استخدام المخزن المؤقت x TAE 1.
   4. المكوس المنتج بكر من الجل مع مشرط نظيفة وحادة وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. قياس تركيز المنتج PCR باستخدام جهاز المطياف الضوئي في طول موجه من 260 nm امتصاص (انظر الجدول للمواد).
   5. إعداد مزيج مقايسة التي تحتوي على 200 نانوغرام من الحمض النووي، 2 ميليلتر من رد فعل T7EI المخزن المؤقت (10 x)، وتصدرت ميليلتر يصل إلى 19 مع ddH₂س (انظر الجدول للمواد).
   6. إعادة يصلب المنتج بكر في cycler حرارية استخدام المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، المنحدر وصولاً إلى 25 درجة مئوية في 6 درجة مئوية/دقيقة، ثم عقد في 4 درجات مئوية.
   7. إضافة 5 يو T7EI للمنتج بكر ملدنة إعادة ومزيج جيد من قبل بيبيتينج، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.
   8. تحليل الحمض النووي T7EI يهضم على 2.5% [اغروس] هلام استخدام المخزن المؤقت x TAE 1.
   9. صورة للهلام وقياس كثافة الفرقة باستخدام إيماجيج، وحساب معدل تكوين إينديل باستخدام الصيغة التالية:
      
      حيث يمثل تتوافق مع كثافة سليمة PCR المنتج وب وج الكثافة من منتجات الانقسام⁴³.
      1. لقياس كثافة عصابة في إيماجيج، أولاً رسم مربع مستطيل حول الفرقة كقريبة من الحدود قدر الإمكان. وثانيا، انقر فوق تحليل ومن ثم تعيين قياسات. تأكد من أن يتم التحقق من الخيارات المتعلقة المنطقة، يعني قيمة الرمادي، و كثافة المتكاملة . الخروج من نافذة الإعدادات عن طريق النقر فوق موافق. ثالثا، انقر فوق تحليل ومن ثم قياس. يعني أو القيمة راوينتدين ككثافة الفرقة.

الرقم 6 : فحص خلايا للجينوم نجاح تحرير النتائج. () A تخطيطي يوضح اثنين عادة تستخدم فحوصات، هي الانقسام عدم تطابق الاعتداء مع T7 endonuclease أنا إنزيم (T7EI) وتسلسل الجيل القادم (خ ع) أو التسلسل amplicon المستهدفة. مستطيلات أفقية الأزرق تشير إلى الحمض النووي والدوائر الصفراء تشير إلى التعديلات الناجمة عن نظام كريسبر Cas. تتم الإشارة إلى أجهزة الإشعال للانزيم T7E1 باللون الأخضر، بينما تتم الإشارة إلى كبسولة تفجير لتوليد أمبليكونس خ ع باللون الأحمر. (ب) تسلسل التصميم التمهيدي للمقايسة الانقسام T7EI وفئة الخدمات العامة الوطنية. هنا، موضع الهدف الجينوم إكسون 45 CACNA1D الجينات البشرية. تتم الإشارة إلى موقع التعديل المقصود بالعلامة نجمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

3. إجراء تسلسل amplicon المستهدفة (انظر الشكل 6).
   1. تصميم بكر كبسولة تفجير لتضخيم موضع الهدف الجينوم. موقف واحد من كبسولة تفجير لتكون أقل من 100 بي بي لكن أكثر من 20 بي بي من بروتوسباسير.
      ملاحظة: عادة، صمم بكر المنتج الحجم الإجمالي ليكون حول 150\u2012300 bp (انظر الشكل 6).
   2. إلحاق تسلسل إضافية الإشعال على النحو التالي: (أ) 5 '\u2012GCGTTATCGAGGTC-NNNN-[التمهيدي إلى الأمام] – 3'؛ 'ب'--جتجكتكتككجاتكت--[عكس التمهيدي] 5 '–3'.
   3. إعداد 50 ميليلتر بكر رد فعل مزيج يحتوي على 10 ميليلتر بكر رد فعل المخزن المؤقت (5 س)، 1 ميليلتر من دنتب (10 ملم)، 5 ميليلتر من التمهيدي (10 ميكرومتر)، 5 ميليلتر التمهيدي ب (10 ميكرومتر)، 0.5 ميليلتر دنا بوليميريز، ميليلتر 2\u20125 المجين الحمض النووي قالب (اعتماداً على تم فرز الخلايا كم) ، ثم أعلى يصل إلى 50 ميليلتر مع ddH₂0.
   4. تشغيل بكر في cycler حرارية مع المعلمات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 98 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 2)، 63 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 3)، 72 درجة مئوية لمدة 15 s (الخطوة 4)، كرر الخطوات 2\u20124 لآخر دورات 34، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، وعقد في 4 درجات مئوية.
   5. حل رد فعل على 2% [اغروس] هلام وتنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. التحديد الكمي للحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي في طول موجه من 260 nm امتصاص (انظر الجدول للمواد).
   6. توليف ما يلي جولة 2 [بكر] كبسولة تفجير: (ج) 5 '\u2012 آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكككتاكاكجاجكجتاتكجاجتك – 3'؛ (د) 5 '\u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[الباركود]-جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت – 3'
   7. قم بإعداد رد فعل بكر ميليلتر 20 مزيج ميليلتر 4 تحتوي على بكر رد فعل المخزن المؤقت (5 س)، 0.4 ميليلتر من دنتب (10 ملم)، 2 ميليلتر من التمهيدي ج (10 ميكرومتر)، 2 ميليلتر من 0.2 ميليلتر من دنا بوليميريز، 2 ميليلتر من قالب الحمض النووي (من الخطوة 7.3.5 التمهيدي د (10 ميكرون)، ، المخفف 1: 100)، و 9.4 ميليلتر ddH₂o.
      ملاحظة: قد تختلف عن عامل تخفيف لقالب الحمض تركيزه الأصلي. إذا كان التركيز حول 20\u201240 نانوغرام/ميليلتر، استخدم عامل تخفيف 1: 100. اختيار باركود مختلفة لكل عينة تجريبية، بالإضافة إلى ذلك، إذا كان التمهيدي نفسه وب التمهيدي يتم استخدامها في الخطوة 7.3.3.
   8. تشغيل بكر في cycler حرارية مع المعلمات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 98 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 2)، 65 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 3)، 72 درجة مئوية لمدة 30 s (الخطوة 4)، كرر الخطوات 2\u20124 لآخر دورات 14، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، و 4 درجات مئوية عقد.
   9. حل 5 ميليلتر من كل رد فعل على 2% [اغروس] هلام لتحديد جميع العينات نجاح الجمع بين تقارير إتمام المشروعات. معا (على افتراض أنه قد استخدمت رمز شريطي مختلفة لكل عينة) وتنظيف الحمض النووي المجمعة باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR حسب الشركة المصنعة تعليمات. إذا كان بعض من تقارير إتمام المشروعات المعرض أكثر من الفرقة (التي تشير إلى وجود منتجات غير محددة)، القيام بخطوة استخراج هلام إضافية.
   10. تسلسل المكتبة على أداة تسلسل إنتاجية عالية (انظر الجدول للمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإنتاج زوجي يقرأ bp 151. التمهيدي تسلسل قراءة 1 مخصصة مصممة وتقديمها بشكل منفصل. التسلسل كما يلي: Read1_seq: 5 '– ككاككجاجاتكتاكاكككتاكاكجاجكجتاتكجاجتك – 3'. قراءة 2 تسلسل التمهيدي والفهرس التمهيدي تسلسل القياسية وتقديمها في خرطوشة كاشف.
       ملاحظة: T7EI المقايسة وتسلسل amplicon المستهدفة تستخدم عادة للتحقق من كفاءة تحرير الجينوم. ومع ذلك، يمكن تنفيذ تجارب أخرى لتقييم كفاءة التحرير، اعتماداً على النوع من الحمض النووي التعديلات التي أدخلتها. على سبيل المثال، إذا تم إنشاء موقع تقييد في الموقع المستهدف، تقييد يفتت طول تعدد الأشكال (RFLP) الإنزيم يمكن أن يؤديها. أنها مماثلة للانزيم T7EI إلا أن endonuclease التقييد يستخدم لهضم المنتج بكر بدلاً من ذلك.

8-فرز لاستنساخ الفردية

1. من خطوة 6.3، تقسيم الخلايا مجرد بدء الحصول على المتلاقية. لكل استنساخ فردية، جمع الخلايا المتبقية واستخراج الحمض النووي طبقاً للخطوة 7، 1.
2. إجراء الفحص T7EI لجميع النسخ الفردية وفقا للبند 7-2، باستثناء تعديل واحد. تضخيم موضع الهدف الجينوم من الخلايا wildtype وفي الخطوة 7.2.5، بدلاً من استخدام 200 نانوغرام اختبار الحمض النووي فقط، مزيج 100 نانوغرام من اختبار الحمض النووي مع 100 نانوغرام wildtype الحمض النووي.
   ملاحظة: هو السبب في أن الخطوة تعديل أن بعض الحيوانات المستنسخة قد خضعت لتحويل بياليليك ناجحة وهي طفرات متماثل. في مثل هذه الحالات، لن يكون هناك لا نطاقات الانقسام في الإنزيم T7EI إذا كان الحمض النووي wildtype غير مختلطة.
3. تسلسل الموقع المستهدف في الحيوانات المستنسخة التي يحمل نطاقات الانقسام في الإنزيم T7EI.
   1. تضخيم موضع الجينوم معدلة وفقا للخطوات 7.2.1–7.2.4.
   2. قم بإعداد رد فعل الاستنساخ التالية: ميليلتر 4 منتج PCR، 1 ميليلتر من الحل الملح، 1 ميليلتر من ناقلات توبو (انظر الجدول للمواد).
   3. المزيج بلطف بيبيتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل.
   4. تحويل 3 ميليلتر من مزيج رد فعل كيميائيا المختصة كولاي الخلايا (مثل TOP10 أو Stbl3) (انظر 1 ملف تكميلي). انتشار تحول الخلايا البكتيرية على صفيحة أجار رطل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين.
   5. وفي اليوم التالي تطعيم المستعمرات على الأقل 10 رطل السائلة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين وسائل الإعلام.
   6. عند الثقافات البكتيرية عكر، وعزل والبلازميدات استخدام مينيبريب كيت (انظر الجدول للمواد) وتسلسل منهم استخدام M13 القياسية إلى الأمام أو عكس التمهيدي M13.
4. أداء وصمة عار غربية (يعرف أيضا باسم إيمونوبلوت) لتحديد غياب أو وجود البروتين المستهدفة (إذا كان ينطوي الجينوم تحرير تجربة انقطاع جينات ترميز البروتين عن طريق الطفرات فراميشيفت). راجع الملف التكميلي 1.
   ملاحظة: يمكن إجراء تجارب أخرى لتحديد نسخة تحمل التعديلات المطلوبة الجينوم. على سبيل المثال، يمكن أن يؤديها مقايسة المظهرية إذا ضرب مورثة معينة معروفة تسبب تغييرات معينة في السلوك الخلوية.

النتائج

أداء جينوم تحرير التجربة بلازميد كريسبر الإعراب عن استهداف سجرنا محور المصالح تحتاج إلى استنساخ. أولاً، بلازميد يهضم مع إنزيم التقييد (عادة نوع الإنزيم IIs) لينيريزي عليه. من المستحسن لحل المنتج هضمها على 1% [اغروس] هلام جنبا إلى جنب مع بلازميد عسر الهضم للتمييز بين هضم الكامل والجزئي. وكما سوبيركويليد والبلازميدات عسر الهضم، فإنها تميل إلى تشغيل أسرع من نظرائهم خطية (انظر الشكل 7). الثاني، النوكليوتيد اثنين سجرنا يجب أن تكون تعتيق ومتصلة إلى بلازميد قص. لتحديد إذا كان قد تم...

المناقشة

نظام كريسبر Cas تقنية قوية وثورية هندسة الجينوم وترانسكريبتوميس من النباتات والحيوانات. قد تم العثور على العديد من الأنواع البكتيرية تحتوي على نظم كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم، التي يحتمل أن تكون قد تكون مناسبة للجينوم والترنسكربيتوم الهندسية أغراض⁴⁴. على الرغم من أن اندونوكليسي Cas9 من العقدية المقيّحة (SpCas9) وكان الإنزيم الأولى التي سيتم نشرها في الخلايا البشرية^21،22،،من²³

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
T4 بولي نوكليوتيدات كيناز (PNK) NEB		M0201
فوسفاتيز القلوي للروبيان (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) عازلة ، 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	تمييع إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي محلول 1X على 40 ملي مولار تريس و 20 ملي مولار من حمض الخليك و 1 ملي مولار EDTA.
المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) ، 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	يخفف إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي محلول 1X على 10 ملي تريس (درجة الحموضة 8.0) و 1 ملي مولار EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400،000 وحدة / مل
طقم ربط سريع	NEB	M2200	بديل ل T4 DNA Ligase.
طقم ربط الحمض النووي السريع	Thermo Scientific	K1423	بديل ل T4 DNA Ligase.
طقم استنساخ Zero Blunt TOPO PCR	Thermo Scientific	451245	يأتي محلول الملح مع ناقل TOPO في المجموعة.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit لتجميع Gibson.
طلقة واحدة Stbl3 المختصة كيميائيا بكتريا القولونية	الحرارية العلمية	C737303
مرق LB (لينوكس) ، مسحوق	Sigma Aldrich	L3022	إعادة التكوين في ddH 2< / sub>0 ، والأوتوكلاف قبل الاستخدام
مرق LB مع أجار (لينوكس) ، مسحوق	Sigma Aldrich	L2897	إعادة التكوين في ddH 2< / sub>0 ، والأوتوكلاف قبل استخدام
وسائط	SOC-	-	2.5 ملي مولار KCl ، 10 ملي مللي MgCl 2< / sub> ، 20 ملي جلوكوز في 1 لتر من LB مرق
أمبيسلين (صوديوم) ، USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ،	هيكلون	SH30081.01	4.5 جم / لتر جلوكوز ، خال من L-glutamine ، HEPES وبيروفات الصوديوم
L-Glutamine ، 200 ملي مولار	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin ، 10 ، 000U / مل	Gibco	15140
0.25٪ Trypsin-EDTA ، 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine	Hyclone	SV30160	FBS بالحرارة قبل الاستخدام عند 56 o< / sup>C لمدة 30 دقيقة
من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 1X	Gibco	20012
كاشف التعداء	jetPRIME Polyplus Transfection	114-75
محلول استخراج الحمض النووي QuickExtract ، 1.0	Epicenter	LUCG-QE09050
ISOLATE II مجموعة الحمض النووي الجينومي	Bioline	BIO-52067	بديل ل QuickExtract
Q5 عالي الدقة DNA Polymerase NEB		M0491
Deoxynucleotide (dNTP) مزيج محلول	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.6) 0.03٪ بروموفينول أزرق ، 0.03٪ زيلين سيانول FF ، 60٪ جلسرين ، 60 ملي
كوكتيل مثبط للبروتياز EDTA ، Set3	Merck	539134
غشاء النيتروسليلوز ، 0.2 & micro ؛ م	Bio-Rad	1620112
المخزن المؤقت Tris-glycine-SDS ، 10X	Bio-Rad	1610772	مخفف إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي محلول 1x على 25 ملي مولار تريس و 192 ملي جلايسين و 0.1٪ SDS.
عازلة تريس جلايسين ، 10X	1st قاعدة	BUF-2020	تمييع إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي المحلول 1x على 25 ملي مولار تريس و 192 ملي مولار جلايسين.
محلول Ponceau S	Sigma Aldrich	P7170
TBS ، 20X	1st قاعدة	BUF-3030	تمييع إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي المحلول 1x على 25 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) و 150 ملي كلوريد الصوديوم.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
حليب خالي الدسم للمقايسة المناعية	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
الجسم المضاد ل & بيتا ؛ الأكتين (C4)	سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية	sc-47778	رقم القطعة: C0916
نظام MiSeq	Illumina	SY-410-1003
مقياس الطيف الضوئي NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
كيوبت مقياس الفلور	الحراري العلمي	Q33226
EVOS FL نظام تصوير الخلية	الحراري العلمي	AMF4300
كريسبر بلازميد: pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	نظام ناقل واحد: يتم التعبير عن gRNA من نفس البلازميد.
بلازميد كريسبر: pX601-AAV-CMV :: NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	نظام ناقل واحد: يتم التعبير عن gRNA من نفس البلازميد.
بلازميد كريسبر: xCas9 3.7	Addgene	108379	نظام ناقل مزدوج: يتم التعبير عن gRNA من بلازميد مختلف.
بلازميد كريسبر: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	نظام ناقل واحد: يتم التعبير عن gRNA من نفس البلازميد.
بلازميد كريسبر: hCas9	Addgene	41815	نظام ناقل مزدوج: يتم التعبير عن الحمض النووي الريبي من بلازميد مختلف.
بلازميد كريسبر: eSpCas9 (1.1)	Addgene	71814	نظام ناقل واحد: يتم التعبير عن الحمض النووي الريبي المرسال من نفس البلازميد.
بلازميد كريسبر: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	نظام المتجه المزدوج: يتم التعبير عن gRNA من بلازميد مختلف.