مقالة منهجية

تحرير الجينوم في "خطوط خلايا الثدييات" استخدام Cas كريسبر

21.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59086

⸱

أبريل 11, 2019

 ,  ,  , 
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

في هذه المقالة

ملخص

كريسبر Cas تقنية قوية هندسة الجينوم معقدة من النباتات والحيوانات. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لكفاءة تحرير الجينوم البشري باستخدام مختلف Cas اندونوكليسيس. نسلط الضوء على الاعتبارات الهامة ومعايير التصميم لتحسين كفاءة التحرير.

الملخص

النظام يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) متفاوت المسافات يعمل بطبيعة الحال في مناعة التكيفية البكتيرية، ولكن قد تم بنجاح إعادة توجيه الغرض منه لهندسة الجينوم في العديد من الكائنات الحية المختلفة. الأكثر شيوعاً، المرتبطة wildtype كريسبر 9 (Cas9) أو اندونوكليسي Cas12a ويستخدم تهزم مواقع محددة في الجينوم، بعدها يتم إصلاح كسر مزدوج تقطعت الحمض النووي عن طريق النهاية غير المتجانسة الانضمام إلى مسار (نج) أو (إصلاح الموجه من التماثل مسار HDR) تبعاً لما إذا كان قالب المانحين غائبة أو الموجودة على التوالي. وحتى الآن، أظهرت نظم كريسبر من الأنواع البكتيرية المختلفة لتكون قادرة على أداء التحرير الجينوم في خلايا الثدييات. ومع ذلك، على الرغم من بساطة الظاهر للتكنولوجيا، عدة بارامترات التصميم يلزم النظر، التي غالباً ما تترك المستخدمين في حيرة حول كيفية أفضل الاضطلاع بالجينوم تحرير التجارب. وهنا يصف لنا سير عمل كاملة من التصميم التجريبي لتحديد الهوية لاستنساخ الخلايا التي تحمل المرجوة من تعديلات الحمض النووي، بهدف تيسير التنفيذ الناجح للجينوم تحرير تجارب في خطوط خلايا الثدييات. نؤكد على الاعتبارات الرئيسية للمستخدمين أن تحيط علما، بما في ذلك اختيار نظام كريسبر وطول فاصل وتصميم قالب المانحين الذين تقطعت بهم السبل-واحد أوليجوديوكسينوكليوتيدي (سودن). ونحن نتصور أن سير العمل هذا سيكون مفيداً لدراسات الجينات خروج المغلوب، المرض النمذجة الجهود، أو توليد مراسل خلية خطوط.

المقدمة

القدرة على هندسة الجينوم من أي كائن حي لديه العديد من التطبيقات الطبية الحيوية والتكنولوجيا الحيوية، مثل تصحيح الأمراض المسببة للطفرات، وبناء النماذج الخلوية الدقيقة لدراسات الأمراض، أو توليد الزراعية المحاصيل مع الصفات المرغوب فيه. منذ مطلع هذا القرن، تم استحداث تكنولوجيات مختلفة لهندسة الجينوم في خلايا الثدييات، بما في ذلك ميجانوكليسيس1،2،3، زنك إصبع نوكليسيس4،5، أو النسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس)6،7،،من8<....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-تصميم سجرناس

  1. حدد نظام كريسبر Cas مناسب.
    1. أولاً، تفقد المنطقة المستهدفة لمتواليات بام من جميع نوكليسيس Cas9 و Cas12a التي أظهرت أن يكون متوفراً في خلايا الثدييات16,21-32. خمسة الإنزيمات المستخدمة بشكل متكرر ترد في الجدول 1 جنبا إلى جنب مع PAMs الخاصة بهم.
      ملاحظة: بالإضافة إلى اندونوكليسيس المدرجة في الجدول 1، وهناك أخرى أقل استخداماً الإنزيمات Cas التي انتشرت بنجاح في خلايا الثدييات أيضا، مثل نوكلاس Cas9 من ثرموفيلوس العقدية (St1Cas9) التي تسلم ناجو بام. إذا لم يحتو موقع الهدف المرغوب فيه بام معروفة، ثم واحدة لن قادراً على استخدام نظام كريسبر Cas لهندسة الجينوم.
    2. ثانيا، النظر في أية خ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أداء جينوم تحرير التجربة بلازميد كريسبر الإعراب عن استهداف سجرنا محور المصالح تحتاج إلى استنساخ. أولاً، بلازميد يهضم مع إنزيم التقييد (عادة نوع الإنزيم IIs) لينيريزي عليه. من المستحسن لحل المنتج هضمها على 1% [اغروس] هلام جنبا إلى جنب مع بلازميد عسر الهضم للتمييز بين هضم الكامل والجزئي. وكما سوبيركويليد والبلازميدات عسر الهضم، فإنها تميل إلى تشغيل أسرع من نظرائهم خطية (انظر الشكل 7). الثاني، النوكليوتيد اثنين سجرنا يجب أن تكون تعتيق ومتصلة إلى بلازميد قص. لتحديد إذا كان قد تم.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نظام كريسبر Cas تقنية قوية وثورية هندسة الجينوم وترانسكريبتوميس من النباتات والحيوانات. قد تم العثور على العديد من الأنواع البكتيرية تحتوي على نظم كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم، التي يحتمل أن تكون قد تكون مناسبة للجينوم والترنسكربيتوم الهندسية أغراض44. على الرغم من أن اندونوكليسي Cas9 من العقدية المقيّحة (SpCas9) وكان الإنزيم الأولى التي سيتم نشرها في الخلايا البشرية21،22،،من23

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفين لم تتنافس المصالح المالية.

شكر وتقدير

M.H.T. معتمد من قبل وكالة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث في "مكتب مشترك لمجلس" المنح (1431AFG103)، منح "مجلس وطني للبحوث الطبية" (أوفيرج/0017/2016)، تمنح "المؤسسة الوطنية للأبحاث" (NRF2013-THE001-046) و (NRF2013-THE001-093 منح وزارة "التعليم المستوى" 1 (RG50/17 (ق))، بدء تشغيل منحة من جامعة نانيانغ التكنولوجية، والأموال للمنافسة "الدولية وراثيا الهندسة آلة" (الحكومي) من جامعة نانيانغ التكنولوجية.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
T4 بولي نوكليوتيدات كيناز (PNK) NEBM0201
فوسفاتيز القلوي للروبيان (rSAP)NEBM0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) عازلة ، 50X1st BaseBUF-3000-50X4Lتمييع إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي محلول 1X على 40 ملي مولار تريس و 20 ملي مولار من حمض الخليك و 1 ملي مولار EDTA.
المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) ، 10X1st BaseBUF-3020-10X4Lيخفف إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي محلول 1X على 10 ملي تريس (درجة الحموضة 8.0) و 1 ملي مولار EDTA.
BbsINEBR0539
BsmBINEBR0580
T4 DNA LigaseNEBM0202400،000 وحدة / مل
طقم ربط سريعNEBM2200بديل ل T4 DNA Ligase.
طقم ربط الحمض النووي السريعThermo ScientificK1423بديل ل T4 DNA Ligase.
طقم استنساخ Zero Blunt TOPO PCRThermo Scientific451245يأتي محلول الملح مع ناقل TOPO في المجموعة.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LKit لتجميع Gibson.
طلقة واحدة Stbl3 المختصة كيميائيا بكتريا القولونيةالحرارية العلميةC737303
مرق LB (لينوكس) ، مسحوقSigma AldrichL3022إعادة التكوين في ddH 2< / sub>0 ، والأوتوكلاف قبل الاستخدام
مرق LB مع أجار (لينوكس) ، مسحوقSigma AldrichL2897إعادة التكوين في ddH 2< / sub>0 ، والأوتوكلاف قبل استخدام
وسائطSOC--2.5 ملي مولار KCl ، 10 ملي مللي MgCl 2< / sub> ، 20 ملي جلوكوز في 1 لتر من LB مرق
أمبيسلين (صوديوم) ، USP GradeGold BiotechnologyA-301
REDiant 2X PCR Mastermix1st BaseBIO-5185
Agarose1st BaseBIO-1000
T7 Endonuclease INEBM0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep KitFavorgenFAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ،هيكلونSH30081.014.5 جم / لتر جلوكوز ، خال من L-glutamine ، HEPES وبيروفات الصوديوم
L-Glutamine ، 200 ملي مولارGibco25030
Penicillin-Streptomycin ، 10 ، 000U / ملGibco15140
0.25٪ Trypsin-EDTA ، 1XGibco25200
Fetal Bovine HycloneSV30160FBS بالحرارة قبل الاستخدام عند 56 o< / sup>C لمدة 30 دقيقة
من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 1XGibco20012
كاشف التعداءjetPRIME Polyplus Transfection114-75
محلول استخراج الحمض النووي QuickExtract ، 1.0EpicenterLUCG-QE09050
ISOLATE II مجموعة الحمض النووي الجينوميBiolineBIO-52067بديل ل QuickExtract
Q5 عالي الدقة DNA Polymerase NEBM0491
Deoxynucleotide (dNTP) مزيج محلولNEBN0447
6X DNA Loading DyeThermo ScientificR061110 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.6) 0.03٪ بروموفينول أزرق ، 0.03٪ زيلين سيانول FF ، 60٪ جلسرين ، 60 ملي
كوكتيل مثبط للبروتياز EDTA ، Set3Merck539134
غشاء النيتروسليلوز ، 0.2 & micro ؛ مBio-Rad1620112
المخزن المؤقت Tris-glycine-SDS ، 10XBio-Rad1610772مخفف إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي محلول 1x على 25 ملي مولار تريس و 192 ملي جلايسين و 0.1٪ SDS.
عازلة تريس جلايسين ، 10X1st قاعدةBUF-2020تمييع إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي المحلول 1x على 25 ملي مولار تريس و 192 ملي مولار جلايسين.
محلول Ponceau SSigma AldrichP7170
TBS ، 20X1st قاعدةBUF-3030تمييع إلى 1X قبل الاستخدام. يحتوي المحلول 1x على 25 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) و 150 ملي كلوريد الصوديوم.
Tween 20Sigma AldrichP9416
حليب خالي الدسم للمقايسة المناعيةNacalai Tesque31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRPAdvanstaK12043
الجسم المضاد ل & بيتا ؛ الأكتين (C4)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-47778رقم القطعة: C0916
نظام MiSeqIlluminaSY-410-1003
مقياس الطيف الضوئي NanoDropThermo ScientificND-2000
كيوبت مقياس الفلورالحراري العلميQ33226
EVOS FL نظام تصوير الخليةالحراري العلميAMF4300
كريسبر بلازميد: pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458)Addgene48138نظام ناقل واحد: يتم التعبير عن gRNA من نفس البلازميد.
بلازميد كريسبر: pX601-AAV-CMV :: NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpAAddgene61591نظام ناقل واحد: يتم التعبير عن gRNA من نفس البلازميد.
بلازميد كريسبر: xCas9 3.7Addgene108379نظام ناقل مزدوج: يتم التعبير عن gRNA من بلازميد مختلف.
بلازميد كريسبر: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9Addgene42230نظام ناقل واحد: يتم التعبير عن gRNA من نفس البلازميد.
بلازميد كريسبر: hCas9Addgene41815نظام ناقل مزدوج: يتم التعبير عن الحمض النووي الريبي من بلازميد مختلف.
بلازميد كريسبر: eSpCas9 (1.1)Addgene71814نظام ناقل واحد: يتم التعبير عن الحمض النووي الريبي المرسال من نفس البلازميد.
بلازميد كريسبر: VP12 (SpCas9-HF1)Addgene72247نظام المتجه المزدوج: يتم التعبير عن gRNA من بلازميد مختلف.
عالي الجلوكوز يتم تعطيل مصل

المراجع

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9 T7

مقالات ذات صلة