Method Article

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

DOI:

10.3791/59104

⸱

March 24th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Brooklyn College, 2Ph.D. Program in Biochemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 4Ph.D. Programs in Chemistry, Biochemistry, and Biology, Graduate Center of the City University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يحدد الإجراءات التجريبية لوصف التغييرات على نطاق الجينوم في مستويات هيستون تعديلات بوستترانسلاشونال (PTM) التي تحدث بصدد overexpression البروتينات المرتبطة بالمرض ومرض باركنسون في نماذج saccharomyces cerevisiae . بعد الانفصال الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، وقد تم اكتشاف مستويات PTM هيستون الفردية مع الأجسام المضادة الخاصة بالتعديل عن طريق النشاف الغربية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي (المرض) ومرض باركنسون (PD)، يؤدي ذلك إلى فقدان مئات الآلاف من الأرواح كل عام. لا توجد خيارات العلاج فعالة قادرة على وقف تطور المرض. على الرغم من جهود تسلسل واسعة في إعداد كبيرة من السكان المريض، تظل معظم حالات المرض والمشتريات غير المبررة بالطفرات الوراثية وحدها. قد تكون ضالعة في مسببات أمراض الأعصاب وتطور آليات التخلق، مثل تعديل بوستترانسلاشونال من البروتينات هستون، وتؤدي إلى أهدافا جديدة للتدخل الصيدلانية. نماذج في المختبر والمجراه في الثدييات من المرض و PD مكلفة وغالباً ما تتطلب البروتوكولات التجريبية طويلة وشاقة. هنا، فإننا مخطط اتباع نهج عملي وسريع وفعال من حيث التكلفة لتحديد التعديلات على نطاق الجينوم هستون تعديل مستويات استخدام Saccharomyces cerevisiae كنظام نموذجي. يسمح هذا البروتوكول لإجراء تحقيقات شاملة في تغييرات جينية متصلاً بروتينوباثيس الأعصاب التي تؤكد النتائج السابقة في نظم نموذجية مختلفة أثناء توسيع معرفتنا بدرجة كبيرة ابيجينومي أمراض الأعصاب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض الأعصاب أمراض مدمرة مع قليل من لا خيارات العلاج المتاحة. ومن بين هذه، التصلب العضلي الجانبي (المرض) ومرض باركنسون (PD) مروعة خاصة. وتعتبر حوالي 90% حالات المرض و PD المتفرقة، التي تحدث دون تاريخ عائلي للمرض، في حين أن الحالات المتبقية تشغيل في الأسر وترتبط عموما بتحور جينات محددة1،2. من المثير للاهتمام، كل هذه الأمراض المرتبطة بالبروتين ميسلوكاليزيشن وتجميع3،4،،من56. على سبيل المثال، تنصهر في ساركومه (فوس) و "القطران الحمض النووي" ملزم بروتين 43 (ماساتشوستس-43) هي بروتينات ملزمة الجيش الملكي النيبالي أن ميسلوكاليزي إلى السيتوبلازم وتجميعها في المرض7،،من89،10، 11،12، بينما α-سينوكلين هو المبدأ المكون من المجاميع البروتينية ووصف الهيئات ليوى في PD5،13،،من1415.

على الرغم من جهود مكثفة على نطاق الجينوم الرابطة في إعداد كبيرة من السكان المريض، تظل الغالبية العظمى من حالات المرض والمشتريات غير المبررة وراثيا. يمكن التخلق تلعب دوراً في أمراض الأعصاب؟ التخلق يشمل تغييرات في الجينات التي تحدث دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسية16. إليه جينية رئيسية تنطوي على التعديلات متعدية وظيفة (بتمس) من البروتينات هستون16. في الخلايا حقيقية النواة، يتم تغليف المواد الجينية محكم في الكروماتين. وحدة قاعدة من الكروماتين نوكليوسومي، يتألف من 146 أزواج قاعدة الحمض النووي الملتفة حول أوكتامير هستون، يتألف من أربعة أزواج من histones (نسختين كل من histones H2A، H2B و H3 و H4)17. وقد كل هستون ذيل الطرفي ن أن يبرز من أصل نوكليوسومي ويمكن تعديله بإضافة مويتيس الكيميائية المختلفة، عادة على بقايا يسين وارجينين18. هذه بتمس بالدينامية، مما يعني أنها يمكن بسهولة إضافة وإزالة، وتشمل مجموعات مثل acetylation ومثلايشن الفسفرة. بتمس التحكم في إمكانية الحصول على الحمض النووي لآلية النسخي، ومن ثم تساعد مراقبة الجينات التعبير18. على سبيل المثال، acetylation هيستون يقلل من قوة التفاعل الكهربائي بين هيستون الأساسية عالية البروتين والحمض النووي مشحونة سلبا على العمود الفقري، السماح للجينات وجبات من هيستونيس أسيتيلاتيد لتكون في متناول أكثر وبالتالي درجة عالية وأعرب19. في الآونة الأخيرة، أدى خصوصية بيولوجية ملحوظة بتمس هيستون خاصة وتشكيلاتها إلى هستون رمز الفرضية20،21 في البروتينات التي أن كتابة ومسح وقراءة هيستون بتمس جميعا أن نعمل يدا واحدة تعدل التعبير الجيني.

الخميرة نموذج مفيد جداً لدراسة نيوروديجينيريشن. الأهم من ذلك، يتم المحافظة عليها العديد من مسارات الخلايا العصبية من الخميرة للبشر22،،من2324. تلخيص الخميرة تعمل سيتوتوكسيسيتي وتضمينات البروتين عند overexpression فوس، ماساتشوستس-43، أو α-سينوكلين22،،من2324،،من2526. وفي الواقع، قد استخدمت نماذج Saccharomyces cerevisiae المرض لتحديد عوامل الخطر الجينية في البشر27. وعلاوة على ذلك، الخميرة overexpressing البشري α-سينوكلين يسمح لتوصيف الشبكة Rsp5 كهدف دروجابل للتخفيف من سمية α-سينوكلين في الخلايا العصبية،من2829.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول استغلال Saccharomyces cerevisiae للكشف عن التغييرات PTM هيستون الجينوم المنظومة المرتبطة بالاعصاب بروتينوباثيس (الشكل 1). استخدام S. cerevisiae جذابة للغاية بسبب سهولة الاستخدام، منخفضة التكلفة، والسرعة مقارنة بنماذج أخرى في المختبر والحيوان من نيوروديجينيريشن. تسخير سابقا وضع المرض و PD نماذج22،23،،من2526، وإننا قد overexpressed البشرية فوس، ماساتشوستس-43 و α-سينوكلين في الخميرة وكشفت هيستون متميزة PTM التغيرات التي تحدث في اتصال مع كل بروتينوباثي30. يمكن إكمال البروتوكول الذي يصف لنا هنا في أقل من أسبوعين من التحول إلى تحليل البيانات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تحويل S. cerevisiae مع ثوابت البروتينات المرتبطة بروتينوباثي الأعصاب

  1. تنمو الخميرة البرية نوع (WT) 303 في الخميرة استخراج ببتون مرق سكر العنب (YPD) بين عشية وضحاها بالهز (200 لفة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية.
  2. بعد 12−16 ح من النمو، يؤدي إلى تمييع الخميرة إلى بكثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) من 0.25 مع YPD. كما ستكون هناك حاجة 10 مل من الخميرة السائلة الثقافة لكل تحويل، إعداد 50 مل من الخميرة السائلة الثقافة للتحولات الخمس المقابلة فوس، ماساتشوستس-43، سينوكلين، وناقلات بنيات فقط (ككدب)، فضلا عن تحويل السيطرة السلبية دون الحمض النووي.
  3. تنمو الخميرة مع الانفعالات عند 30 درجة مئوية حتى يتم التوصل إلى OD600 بين 0.60 و 0.80. ويأخذ هذا عموما ح 4−6.
  4. لينيريزي ثلاثين دقيقة قبل اكتمال نمو الخميرة، ثوابت بلازميد.
    ملاحظة: يجب أن تدمج بنيات بلازميد المستخدمة هنا مباشرة في الجينوم، ومن ثم استخطاط مطلوب قبل التحول.
    1. حساب حجم المخزون بلازميد تلك المبالغ إلى 1 ميكروغرام. استقطاع هذا الحجم من 44 ميليلتر حساب مقدار nuclease مجاناً ح2س اللازمة.
    2. إضافة نوكلاس مجاناً ح2س 5 ميليلتر من المخزن المؤقت إنزيم التقييد x 10 (جدول المواد)، 1 ميليلتر من إنزيم التقييد ني (جدول المواد) والمقدار المناسب من بلازميد (المحسوبة في الخطوة 1.4.1) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بلازميد الآن خطية وجاهزة للتحول.
  5. بعد الخميرة تصل الثقافة OD600 من 0.6-0.8، خلايا الحصاد في أنبوب 50 مل المخروطية وتدور إلى أسفل في 850 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية.
  6. أغسل بيليه الخلية في 10 مل ح2س العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 850 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية. كرر 3 x لإجمالي يغسل الأربعة.
  7. في بداية الغسيل الثالث، ذوبان الجليد ويغلي 10 ميليلتر الحيوانات المنوية السلمون الحمض النووي كل رد فعل التحول لمدة 5 دقائق على كتلة تدفئة.
  8. ريسوسبيند بيليه الخلية في 100 ميليلتر dH2س في التحول وتقسيمها إلى عدد مناسب من أنابيب ميكروسينتريفوجي. التحولات الخمسة، ريسوسبيند بيليه إلى 500 ميليلتر من dH2س وتقسيم بالتساوي إلى خمسة أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة.
  9. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 850 x ز في درجة حرارة الغرفة (RT) وإزالة جميع المياه المتبقية.
  10. إضافة، بالترتيب التالي، 50 ميكروليتر معقمة ح2س، ميليلتر 240 من 50% البولي إثيلين غليكول (شماعة)، ميليلتر 36 م 1 ليك، 10 ميليلتر من سمك السلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي، 20 ميليلتر من خطية بلازميد الحمض النووي (أو نوكلاس المياه مجاناً لأي تحويل مراقبة الحمض النووي). المزيج جيدا بعد كل إضافة ودوامه بإيجاز بعد أن تم إضافة كافة مكونات التحول.
  11. احتضان ردود فعل التحول في 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: إجراء هذه الحضانة في حمام مائي للتحكم في درجة الحرارة أكثر اتساقا.
  12. الطرد المركزي في 470 x ز على RT للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند كل خلية بيليه في 200 ميكروليتر معقمة H2o.
  13. لوحة تعليق الخميرة في لوحات الإعلام الانتقائي وتنتشر مع الخرز المتداول أو الناشرة. احتضان لوحات لأيام 2−3 في 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: تعريف الاصطناعية (SD)-وتستخدم لوحات له والبلازميدات الموصوفة هنا.

2-مسح قمع نمو مستعمرة والتخزين في مخزونات والغليسيرول

  1. تطعيم المستعمرات واحدة من لوحات التحويل في 5 مل من وسائل الإعلام الانتقائي وتستكمل مع رافينوسي 2%. تنمو على شاكر عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. حدد المستعمرات على الأقل 12 كل التحول.
    ملاحظة: من المتوقع لا مستعمرات في لوحة التحكم التحول "لا الحمض النووي".
  2. تعقيم دبوس-frogger مع الإيثانول، تليها المشتعلة.
  3. لكل ثقافة، اليكووت ميليلتر 100 تعليق خلية المشبعة في الصف الأول من لوحة 96-جيدا. إضافة 200 ميكروليتر معقمة ح2س في جميع الآبار المجاورة الأعمدة جيدا. لتخفيف المسلسل 1:5، إضافة 50 ميليلتر من العمود الأول إلى العمود المجاور خلف مع بيبيت الأقنية. مزيج دقيق من بيبيتينج. ثم إضافة 50 ميليلتر من العمود الثاني إلى العمود الثالث ومزيج من بيبيتينج. كرر هذه العملية لبقية اللوحة.
  4. لوحة الخميرة بوضع frogger في صفيحة 96-جيدا وثم ختم بالضغط بلطف وبشكل متساو أسفل لوحات الإعلام الانتقائي مع أو بدون اللبن. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة أيام 2−3.
    ملاحظة: تستخدم ألواح SD-صاحب وصاحب سجال والبلازميدات الموصوفة هنا.
  5. فوس، ماساتشوستس-43، والتحولات في سينوكلين، تحديد مستعمرة عرض قمع نمو معظم حضور اللبن. حدد هذه المستعمرة من لوحة SD-صاحب وتطعيم في 10 مل من وسائل الإعلام الانتقائي وتستكمل مع رافينوسي 2% للنمو بين عشية وضحاها. لمكافحة ناقلات الأمراض، واختيار مستعمرة عرض لا قمع النمو حضور اللبن.
  6. إعداد الأرصدة والغليسيرول، الجمع بين 0.5 مل ثقافة مشبعة السائل مع 0.5 مل والغليسيرول 50%. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتجميد في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين مخزونات والغليسيرول لتصل إلى سنة في-80 درجة مئوية.

3-أوفيريكسبريشن بروتينوباثي الأعصاب المرتبطة البروتينات في سيريفيسيا س.

  1. من الأرصدة المجمدة والغليسيرول، الخميرة إعادة متتالية على الحامض الأميني، 2% جلوكوز أجار وسائط انتقائية لوحات واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة أيام 2−3.
  2. تطعيم المستعمرات واحدة لكل من نماذج أوفيريكسبريشن والتحكم في 5 مل من الحامض الأميني وسائل الإعلام السائلة انتقائية وتستكمل مع رافينوسي 2%. تنمو مع الهز (200 لفة في الدقيقة) عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. تنمو 100 مل من سائل الثقافة لكل من أوفيريكسبريشن النماذج وعناصر التحكم (فوس، ماساتشوستس-43 وناقل التحكم؛ التحكم سينوكلين ومتجه).
    1. تحضير 100 مل ثقافة في وسائل الإعلام الانتقائي وتستكمل مع اللبن 2%.
    2. قياس القطر الخارجي600 الثقافات بين عشية وضحاها وحساب كمية بين عشية وضحاها الثقافة المطلوبة لتقديم ثقافات overexpression OD انطلاق600 0.3. عادة، سوف تصل إلى الثقافات بين عشية وضحاها OD600 من 0.9−10، التي تتطلب حوالي 5 مل ثقافة بين عشية وضحاها بدء 100 مل ثقافة جديدة.
    3. حمل overexpression البروتين بنمو الخميرة في اللبن وسائط الإعلام (راجع الخطوة 3.3.1) ح 5 (فوس و، ماساتشوستس-43) أو ح 8 (-سينوكلين) مع تهتز عند 30 درجة مئوية.
  4. قياس القطر الخارجي600 كل ثقافة في نهاية فترة التعريفي. توحيد جميع التهم الخلية إلى أدنى قيمة600 OD. حصاد الثقافة في أنابيب 50 مل من سينتريفوجينج في 850 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: إذا كانت OD600 القيم المقاسة في نهاية التعريف 0.654 و 0.984، على التوالي، 100 مل سينوكلين الثقافة و 100 مل من ثقافة الرقابة، حصاد مل 95 للثقافة في سينوكلين ومل 67.1 ثقافة السيطرة.
  5. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من العقيمة dH2س لكل 10 مل من الثقافة نمت. تقسيم بيليه بالتساوي بواسطة اليقوتينج 1 مل تعليق خلية في أنابيب ميكروسينتريفوجي. على سبيل المثال، إذا بدأت مع 100 مل ثقافة، ريسوسبيند بيليه في 10 مل من العقيمة dH2س وتقسم إلى 10 ميكروسينتريفوجي الأنابيب.
  6. الطرد المركزي في 850 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم إزالة المادة طافية. الأداة الإضافية تجميد الخلايا الكريات في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين خلايا الكريات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.

4-خلية تفسخ والنشاف الغربية للكشف عن التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال

  1. تحلل الخلية
    1. ذوبان الجليد الكريات خلايا الخميرة على الجليد وريسوسبيند الكريات الخلية في 100 ميليلتر من dH2o.
    2. لاستثارة الخلية، إضافة 300 ميليلتر من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم و 20 ميليلتر من 2-mercaptoethanol. ريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    3. احتضان خلايا على الجليد لمدة 10 دقائق وثم الطرد المركزي في 3,200 س ز على أجهزة الطرد مركزي منضدية لمدة 30 ثانية في تجاهل الرايت المادة طافية.
    4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 100 ميليلتر من 1 × تحميل صبغ ويغلي لمدة 10 دقائق على كتلة تدفئة.
      ملاحظة: يمكن الاطلاع على وصفه ل 6 × تحميل صبغ في الجدول للمواد.
  2. نقل الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد والغشاء
    1. تحضير هلام الدائرة بوضع اثنين من المواد الهلامية في جل حامل والتعبئة داخلية دائرة إلى الأعلى مع تشغيل المخزن المؤقت وملء إلى خارج الدائرة علامة الخط الثاني-جل.
    2. تحميل 15 ميكروليتر من عينة من الخطوة 4.1.4 كل بئر في جل polyacrylamide 12% 10-جيدا. للين سلم البروتين، تحميل 5 ميليلتر.
    3. تشغيل جل لحوالي 45 دقيقة في 150 الخامس، أو حتى تحميل الجبهة صبغ تصل إلى الجزء السفلي من الجل.
    4. بينما يتم تشغيل الهلام، التحضير لنقل الغشاء مغطس وسادات الألياف (اثنان لكل جيل) في نقل المخزن المؤقت (جدول المواد) وامتصاص الغشاء الفلوريد (PVDF) الفينيليدن في الميثانول. شطف الغشاء في نقل المخزن المؤقت قبل النقل.
      ملاحظة: ينبغي خفض حجم الهلام الغشاء PVDF واستخدم الغشاء PVDF واحدة لكل جل نقله.
    5. تجميع، في خلية جهاز نقل شبه الجاف، نقل 'ساندويتش': من القطب السفلي، ضع لوحة الألياف (1) بريسواكيد (2) بريسواكيد ومشطوف الغشاء PVDF، (3) جل من خطوة 4.2.3 و (4) لوحة ألياف بريسواكيد ثانية.
      ملاحظة: تأكد من لتجنب فقاعات الهواء في نقل 'ساندويتش.' لفة بلطف 'ساندويتش' مع بيبيت المصلية لإجبار بها فقاعات. متى تم وضع الجل على رأس الغشاء بدفف، تأكد من لا لنقله.
    6. القيام بنقل البروتين بإعداد حزمة الطاقة إلى 150 mA ح 1 (لأحد 'ساندويتش').
  3. كشف هيستون بتمس مع الأجسام المضادة المحددة للتعديل
    1. إزالة الغشاء من نقل الجهاز. شطف بإيجاز مع dH2o.
      1. بشكل اختياري، تحقق نقل البروتينات مع وصمة عار بونسو-S بصب وصمة بونسو-S ما يكفي لتغطية غشاء في علبة بلاستيكية صغيرة وتفرخ في الرايت مع الهز لطيف ل 30−60 s. S بونسو إزالة وصمة عار وشطف مع dH2س حتى الخلفية وصمة عار يختفي ونطاقات البروتين مرئية بالعين المجردة. تواصل شطف مع dH2س حتى تتم إزالة وصمة عار كل من الغشاء.
    2. كتلة الأغشية التي تفرخ وصمة عار ح 1 في الرايت مع هزاز لطيف مع تريس مخزنة المالحة (تبس) حظر المخزن المؤقت (جدول المواد) في مربع المصبوغة صغير. استخدام المخزن المؤقت حظر ما يكفي لتغطية وصمة عار.
      ملاحظة: كن حذراً مكان غشاء تستقيم في مربع المصبوغة حتى لا تواجه الجانب الغشاء الذي تكمن البروتينات إلى أسفل.
    3. احتضان وصمة عار في المربع المصبوغة بين عشية وضحاها مع جسم خاصة بتعديل هيستون رد الفعل تجاه الخميرة في 4 درجات مئوية. تضعف الجسم في المخزن المؤقت حظر تبس وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. وتشمل أيضا عنصر تحكم تحميل النووي سليم، مثل H3 مجموع المضادة المثارة في مضيف مختلف أنواع من الأجسام المضادة الخاصة بالتعديل. على سبيل المثال، إذا كان التدقيق في H3S10ph مع جسم H3S10ph المضادة المثارة في أرنب، استخدام جسم H3 مجموع المضادة المثارة في الماوس كعنصر تحكم تحميل. كرر هذه العملية لكل اسطوانة حسب الضرورة.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام تخفيف جسم لما مجموعة ثلاث مرات في غضون شهر. تخزينها في 4 درجات مئوية.
    4. يغسل الغشاء 4 x في البيت-أدلى تبس + 0.1% بوليسوربيت 20 (تبسة) لمدة 5 دقائق مع هزاز في الرايت
    5. احتضان وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت في تخفيف المحددة من قبل الشركة المصنعة (حمار المضادة أرنب 680 ودونكي المضادة الماوس) ح 1 في الرايت
      ملاحظة: يجب حماية الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت من الضوء أثناء التخزين والاستخدام. القيام بالحضانة في صناديق بلاستيكية داكن أو تغطي برقائق الألومنيوم.
    6. يغسل الغشاء 4 x مع تبسة لمدة 5 دقائق ويغسل مع TBS لمدة 5 دقائق في حين تعصف في الرايت
    7. تصور وصمة عار على وصمة عار غربية فلورسنت نظام للحد الأدنى 2 تصوير تصور الأرنب المضادة 680 والأجسام المضادة الماوس 800 الثانوي 800 نانومتر و 700 نانومتر القنوات، على التوالي.
      ملاحظة: تجري Replicates بشكل مستقل ابتداء من الباب 1. من الضروري للتحقق من أن الاستجابة إشارة جسم ضمن النطاق أكثر مما استجابة إشارة خطية لتفسير البيانات المناسبة في هذه التجارب.

5-بيانات التحليل والإحصاءات

  1. فتح الصورة من وصمة عار في برامج تصوير (جدول المواد). اكتساب كثافة الخام من العينات الخاصة بالتعديل العصابات في ناقلات التحكم، ماساتشوستس-43، وفوس (أو مكافحة ناقلات الأمراض وسينوكلين)، عن طريق رسم مستطيل بإطارات الفرقة في تحليل الوضع.
  2. كرر الخطوة 5، 1 لتحميل مكافحة العصابات.
    ملاحظة: سوف يكون هناك تحميل التحكم الفرقة وفرقة الخاصة بالتعديل في كل عينة.
  3. حساب الكثافة النسبية للنطاقات الخاصة بالتعديل بتقسيم كل فرقة بكثافة الفرقة المقابلة في نموذج عنصر تحكم ناقل. وهذا طبيعتها البيانات لمكافحة ناقلات الأمراض.
  4. حساب الكثافة النسبية للتحميل شريط التحكم بتقسيم كل فرقة بالكثافة لتحميل المقابلة الفرقة عنصر تحكم في نموذج عنصر تحكم ناقل.
  5. حساب الكثافة النسبية المعدلة لكل الفرقة بتقسيم الكثافة النسبية للفرقة الخاصة بالتعديل على مدى الكثافة النسبية للتحميل شريط التحكم لكل عينة. الآن، يمكن تصور البيانات في نموذج الرسم البياني.
    ملاحظة: لسهولة التجهيز، يمكن أن يتم الخطوات 5.3 – 5.5 في جدول بيانات (ملف إضافي).
  6. بعد replicates مستقلة متعددة، تي-الاختبارات تشغيل ولش بين عينات مراقبة اثنين وبروتينوباثي المناسبة نموذج (التحكم مقابل فوس، السيطرة مقابل 43، ماساتشوستس، والسيطرة مقابل سينوكلين) مع p = 0.05 كقطع للأهمية .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوضيح هذا الأسلوب، سوف نستفيد من النتائج المنشورة مؤخرا30. كانت overexpressed WT البشرية فوس و، ماساتشوستس-43 ح 5، بينما كان overexpressed WT α-سينوكلين ح 8. بنية ككدب كعنصر تحكم ناقل سلبية. ويبين الشكل 2 قمع النمو في الثقافات الصلبة والسائلة. وكان حصاد الخميرة كما هو موضح والنشاف الغربية مع الأجسام المضادة الخاصة بتعديل أجرى. H3 مجموع المضادة استخدمت كعنصر تحكم تحميل. انخفاضا كبيرا في مستويات H3S10ph و H3K14ac واضح في نموذج overexpre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينص البروتوكول على وصف هنا بطريقة مباشرة ومناسبة وفعالة من حيث التكلفة لتصنيف التغيرات PTM هيستون على نطاق الجينوم يرتبط مع بروتينوباثيس الأعصاب. بينما هناك نماذج أخرى من المرض، وشعبة المشتريات، مثل في المختبر خطوط الخلايا البشرية والفاري نماذج32, S. cerevisiae تظل جذابة بسبب سهولة استخدامه. على سبيل المثال، نماذج الخميرة لا تتطلب استخدام غطاء عقيمة، كما أنها تتطلب كثافة التدريب الذي يسير جنبا إلى جنب خلية ثقافة العمل. وعلاوة على ذلك، الكواشف لاستزراع الخميرة أيضا أكثر بكثير بأسع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر رينا طناز وهدى يوسف تاسين صديقى للحصول على مساعدة تقنية. ونحن ممتنون جداً للبروفيسور جيمس أقصر لتوفير الكواشف والفكرية المساعدة في تصميم تجارب ضبط السكروز سخية. والبلازميدات الخميرة كانت هدية سخية من البروفيسور آرون جيتلير (بما في ذلك غال 303-فوس؛ بلازميد # 29614 من أدجيني). كلية بروكلين ومتقدمة علوم بحوث مركز (CUNY)، فضلا عن المعاهد الوطنية للصحة NINDS المتقدمة بعد الدكتوراه مرحلة انتقالية جائزة (K22NS09131401) تدعم M.P.T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
- مكمل DOالخاص به Clontech630415
10xRunning Buffer Mix: 141.65 جم جلايسين (ThermoFisher BP381-1) ، 30.3 جم قاعدة Tizma (Sigma-Aldrich T6066) ، 10 جم كبريتات دوديسيل الصوديوم (Sigma-Aldrich L3771) ، و 1 لتر ماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 8.8.
12٪ المواد الهلامية بولي أكريلاميدBIO-RAD456-1041
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) الجسم المضاد الأساسيMilliporeSigma07-353 (رقم الدفعة 2762291) التخفيف: 1/1000
المضاد للأسيتيل هيستون H4 (Lys 16) الجسم المضاد الأساسيAbcamab109463 (رقم الدفعة. GR187780)التخفيف: 1/2000
الجسم المضاد الأساسي المضاد للأيستيل هيستون H4 (Lys12)Abcamab46983 (رقم الدفعة. GR71882)التخفيف: 1/5000
الأجسام المضادة الأولية المضادة لثنائي ميثيل هيستون H3 (Lys36)Abcamab9049 (رقم الدفعة. GR266894 ، GR3236147)التخفيف: 1/1000
الجسم المضاد الأساسي المضاد للهيستون H3Abcamab24834 (رقم الدفعة. GR236539 ، GR174196 ، GR3194335)التحكم في التحميل النووي ؛ التخفيف: 1/2000
المضاد للفوسفو هيستون H2B (Thr129) الجسم المضاد الأساسيAbcamab188292 (رقم الدفعة. GR211874)التخفيف: 1/1000
الجسم المضاد الأساسي المضاد للفوسفو هيستون H3 (Ser10)Abcamab5176 (رقم الدفعة. GR264582 ، GR192662 ، GR3217296)التخفيف: 1/1000
مقياس ضوئي حيوي D30خلية 6133000010Eppendorf
(100 × 20 مم)Eppendorf
، 96 بئرEppendorf30730011
جهاز طرد مركزي 5804/5804 R / 5810/5810 REppendorf22625501
الحمار المضاد للفأر IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (رقم الدفعة C60301-05 ، C61116-02 ، C80108-05)التخفيف: 1/5000
حمار مضاد للأرانب IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (رقم الدفعة C60217-06 ، C70323-06 ، C70601-05 ، C80116-07)التخفيف: 1/2500
الإيثانولSigma-AldrichE7023
ورق لطخة سميك للغاية (ورق ترشيح)BIO-RAD1703968
GalactoseSigma-AldrichG0750تحضير 20٪ وزن / حجم محلول مخزون.
الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270تحضير محلول مخزون 20٪ وزن / حجم.
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516تحضير محلول 50٪ وزن / حجم.
أغشية نقل Immobilon-FLMilliporeSigmaIPFL00010
ثنائي هيدرات أسيتات الليثيوم (LiAc)Sigma-AldrichL4158قم بإعداد محلول 1 متر.
تحميل مزيج الصبغة: 1.2 جم كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 6 ملغ بروموفينول أزرق (سيجما ألدريتش B8026) ، 4.7 مل جلسرين ، 1.2 مل 0.5 مل درجة حموضة قاعدة تريزما 6.8 ، 0.93 جم DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632) ، و 2.1 مل ماء منزوع الأيونات.
ميثانولثيرموفيشرA412-4
Mini-PROTEAN Tetra خلية الرحلان الكهربائي العموديBIO-RAD1658004
ماصة متعددة القنواتEppendorf2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1 ، 10xNew England Bio Labs102855-152
Nhe I Restriction EnzymeEngland Bio Labs101228-710
الخالي من الماء من NucleaseQiagen129114
Odyssey FCLI-COR Biosciences2800-03
OmniTray Cell Culture المعالج مع غطاء معقم ، PS (86 × 128 مم)ThermoFisher165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFPهدية من A. Gitler
pAG303GAL-ccdBAddgene14133
pAG303Gal-FUSAddgene29614
pAG303GAL-TDP-43هدية من A. Gitler
Poly (إيثيلين جلايكول) (PEG)Sigma-AldrichP4338قم بإعداد محلول 50٪ وزن / حجم.
Ponceau S StainSigma-AldrichP3504Mix: 0.5 جم 0.1٪ وزن / وزن صبغة Ponceau S ، 5 مل 1٪ v / v حمض الأسيتيك (Sigma-Aldrich 320099) ، و 500 مل ماء منزوع الأيونات.
PowerPac Basic Power SupplyBIO-RAD164-5050
Raffinose pentahydrateSigma-AldrichR7630إعداد 10٪ وزن / حجم محلول المخزون.
سمك السلمونAgilent Tech201190
SD-His PlatesMix: 20 جم أجار (Sigma-Aldrich A1296) ، 0.77 جم - مكمل His DO ، 6.7 جم من قاعدة النيتروجين الخميرة بدون الأحماض الأمينية (ThermoFisher 291920) ، و 900 مل من الماء منزوع الأيونات.
مزيج أطباقSGal-His Mix: 20 جرام أجار ، 0.77 جرام - مكمل DO الخاص به ، 6.7 جرام قاعدة نيتروجين خميرة بدون أحماض أمينية ، 100 مل محلول جالاكتوز ، و 900 مل ماء منزوع الأيونات.
مخزن عازلالصوديوم عند -20 درجة مئوية. 6X ، مزيج: 1.2 جم كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 6 ملليجرام بروموفينول أزرق ، 0.93 جم DL-Dithiothreitol ، 2.1 مل ماء منزوع الأيونات ، 4.7 مل جلسرين ، و 1.2 مل 0.5 م قاعدة Trizma ، درجة الحموضة 6.8.
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش221465تحضير محلول 0.2 م.
السكروزسيجما ألدريتش84097تحضير محلول مخزون 20٪ وزن / حجم.
TBS + 0.1٪ توين 20 (TBST)مزيج: 100 مل 10X TBS ، 1 مل Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) ، و 900 مل ماء منزوع الأيونات.
TBS Blocking BufferLI-COR927-5000
Trans-Blot SD خلية نقل كهربائية شبه جافةBIO-RAD170-3940
عازل النقل: 22.5 جم جلايسين ، 4.84 جم قاعدة Tizma ، 400 مل من الميثانول ، 1 جم كبريتات دوديسيل الصوديوم ، و 1.6 لتر ماء منزوع الأيونات.
محلول ملحي مخفض من Tris-Buffered (TBS)10X ، 7.6 درجة حموضة ، محلول: امزج 24 جم من قاعدة Trizma و 88 جم من كلوريد الصوديوم (Sigma-Aldrich S7653). املأ حتى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات.
WT 303 S. cerevisiae< / em> هدية خميرةمن J. مستخلص
سكر العنب الببتون (YPD)Sigma-AldrichY1375
طبق ثقافة لوحة ثقافة الخلية 30702118 New نظام التصوير المنوية DNA مخزن تحميل كبريتات دوديسيل مزيج الخميرة الأقصر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).
  2. Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
  3. Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
  4. Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
  5. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013(2017).
  6. Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
  7. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  8. Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
  9. Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
  10. King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
  11. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  12. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  13. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  14. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
  15. Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  16. Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
  17. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  18. Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
  19. Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  20. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
  21. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  22. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  23. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112(1990).
  24. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772(2003).
  25. Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329(2009).
  26. Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614(2011).
  27. Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
  28. Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
  29. Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979(2013).
  30. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
  31. Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757(1990).
  32. Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591(2016).
  33. Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
  34. Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
  35. Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
  36. Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
  37. Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationYeast ModelNeurodegenerative DiseaseWestern BlotProtein OverexpressionHistone AcetylationEpigenetic AnalysisSaccharomyces CerevisiaeALS PD ModelsPost translational Modification

Related Articles