مقالة منهجية

إعداد الفطريات والمواد النباتية لتوضيح الهيكلية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي الصلبة دينامية الاستقطاب النووي

DOI:

10.3791/59152

⸱

فبراير 12, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد بروتوكول لإعداد 13ج،15عينات الفطريات والنبات المسمى ن مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الصلبة المتعددة الأبعاد والتحقيق الاستقطاب النووي الحيوي (DNP).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يوضح كيفية انتظام 13ج، 15المسمى ن الفطرية يمكن أن تكون المواد المنتجة وكيف ينبغي أن سارت هذه المواد اللينة للرنين المغناطيسي النووي الصلبة وحساسية--تعزيز التثقيف والتجارب. ويرد أيضا إجراءات تجهيز عينة من الكتلة الحيوية النباتية. هذا الأسلوب يسمح بقياس مجموعة من 1 د و 2D 13ج-13ج/15ن الترابطات الأطياف، الذي يتيح توضيح الهيكلية ذات الدقة العالية الحيوية المعقدة في دولته الأصلية، مع الحد الأدنى من اضطراب. يمكن فحص العلامات النظائر بقياس الكثافة في أطياف د 1 وكفاءة نقل الاستقطاب في 2D ترابط الأطياف. ويمكن تقييم نجاح إعداد نموذج الاستقطاب النووي الحيوي (DNP) على عامل تعزيز الحساسية. تجارب أخرى بدراسة الجوانب الهيكلية للسكريات والبروتينات سيؤدي إلى وضع نموذج للهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد. هذه الطرق يمكن تعديلها وتكييفها للتحقيق في مجموعة واسعة من المواد الغنية بالكربوهيدرات، بما في ذلك الجدران الخلية الطبيعية من النباتات والفطريات والطحالب والبكتيريا، فضلا عن توليف أو مصممة على مجمع مع الآخر والبوليمرات الكربوهيدرات الجزيئات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكربوهيدرات تلعب دوراً مركزياً في مختلف العمليات البيولوجية مثل تخزين الطاقة وبناء الهيكلية، والاعتراف بالهاتف الخلوي والالتصاق. أنها أثرت في جدار الخلية، الذي عنصر أساسي في النباتات والفطريات، والطحالب والبكتيريا1،،من23. جدار الخلية بمثابة مصدر مركزي لإنتاج الوقود الأحيائي، والمواد الحيوية، فضلا عن هدف واعدة للعلاجات المضادة للميكروبات4،،من56،،من78 , 9.

الفهم المعاصر لهذه المواد المعقدة تقدما جوهريا خلال عقود جهود التي كرست لتوصيف الهيكلية باستخدام أربع طرق رئيسية البيوكيميائية أو الوراثية. الأسلوب الرئيسي الأول يعتمد على علاجات متتابعة باستخدام المواد الكيميائية القاسية أو الإنزيمات لكسر جدران الخلايا إلى أجزاء مختلفة، التي تبعتها التركيبية وربط تحليل السكريات في كل جزء10. هذا الأسلوب يلقي الضوء على توزيع مجال البوليمرات، ولكن التفسير قد تكون مضللة بسبب الخواص الكيميائية والفيزيائية للجزيئات الحيوية. على سبيل المثال، من الصعب تحديد ما إذا كان الكسر القلوي استخراجها تنبع من مجال واحد من الجزيئات أقل تنظيماً أو من جزيئات المنفصلين مكانياً مع الذوبان قابلة للمقارنة. ثانيا، الأجزاء المستخرجة أو جدران الخلايا كلها يمكن أيضا أن تقاس باستخدام الحل الرنين المغناطيسي لتحديد الروابط التساهمية، كما وصفته crosslinking، بين جزيئات مختلفة11،،من1213، 14،15. وبهذه الطريقة، يمكن سبر بنية مفصلة التساهمية من المراسي، ولكن قد توجد قيود بسبب انخفاض معدلي الذوبان السكريات والعدد الصغير نسبيا من المواقع كروسلينكينج، والجهل بالآثار غير التساهمية التي تستقر السكاريد التعبئة، بما في ذلك الهيدروجين-الترابط، فإن دير فالس القوة، التفاعل الالكتروستاتيكي وتشابك البوليمر. ثالثا، كانت تقارب ملزم العزم في المختبر باستخدام السكريات معزولة16،17،،من1819، ولكن تنقية الإجراءات قد يترتب عليها تغيير جوهري هيكل وخصائص هذه الجزيئات الحيوية. فشل هذا الأسلوب أيضا لتكرار ترسب متطورة والجمعية للجزيئات الكبيرة بعد التركيب الحيوي. وأخيراً، النمط الظاهري ومورفولوجيا الخلايا والخصائص الميكانيكية لطفرات وراثية مع إنتاج الموهنة لبعض مكونات جدار الخلية تسليط الأضواء على المهام الهيكلية للسكريات، ولكن الأدلة الجزيئية أكثر ضروري لسد هذه الملاحظات العيانية مع الدالة هندسيا للبروتين الأجهزة20.

وأدخلت التقدم الذي أحرز مؤخرا في تطوير وتطبيق مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الصلبة المتعددة الأبعاد فرصة فريدة لحل هذه الألغاز الهيكلية. تجارب الرنين المغناطيسي النووي الصلبة في 2D/3D تمكين التحقيق ذات الدقة العالية في تكوين وبنية المواد الغنية بالكربوهيدرات في الدولة الأصلية دون اضطراب كبير. أجريت دراسات الهيكلية بنجاح على الابتدائي وجدران الخلية الثانوية للنباتات، والكتلة الحيوية المعالجة حفازة، بيوفيلم البكتيرية، أشباح الصباغ في الفطريات، ومؤخرا من المؤلفين، جدران الخلية سليمة في نوع من الفطريات المسببة للأمراض رشاشيه دخناء 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31-تطوير دينامية الاستقطاب النووي (DNP)32،33،34،35،36،،من3738 , 39 , 40 , 41 , 42 يسهل إلى حد كبير توضيح الهيكلية الرنين المغناطيسي النووي كتعزيز التثقيف حساسية ملحوظة تقصير الوقت التجريبية على هذه الحيوية المعقدة. البروتوكول هو موضح هنا تفاصيل الإجراءات المتعلقة بالنظائر-تصنيف الفطريات دخناء (أ) وإعداد الفطرية وعينات النبات لتوصيف الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي والتثقيف. ينبغي أن تكون إجراءات وضع العلامات مماثلة تنطبق على الفطريات الأخرى مع تغيير المتوسطة، وينبغي أن تكون إجراءات إعداد عينة ينطبق عموما على الحيوية الأخرى الغنية بالكربوهيدرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-نمو 13ج، 15المسمى ن رشاشيه دخناء "السائلة المتوسطة"

  1. إعداد غير مسمى و 13ج، متوسط النمو المسمى N 15
    ملاحظة: سواء استخدمت "الخميرة استخراج سكر العنب ببتون" المتوسطة (YPD) و متوسط الحد الأدنى تحسين43 للحفاظ على الثقافة الفطرية. يتم تنفيذ كافة الخطوات بعد التعقيم في غطاء الاندفاق الصفحي للتقليل من التلوث.
    1. إعداد متوسطة السائلة غير مسمى: حل 6.5 غرام مسحوق YPD في 100 مل من الماء المقطر ثم اﻷوتوكﻻف لمدة 25 دقيقة في 134 درجة مئوية.
    2. إعداد متوسطة الصلبة غير مسمى
      1. إضافة 1.5 ز لاجار و 6.5 غرام من مسحوق YPD في 100 مل ماء المقطر.
      2. اﻷوتوكﻻف متوسطة لمدة 25 دقيقة في 121 درجة مئوية ثم تبرد وصولاً إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية.
      3. نقل 13-15 مل المتوسط في كل البلاستيك المعقمة مسبقاً طبق بيتري وتغطية الطبق فورا باستخدام غطاء.
    3. إعداد 13ج، 15المسمى ن السائلة المتوسطة
      ملاحظة: إعداد الحل النمو للنظائر وسم، متوسط الحد أدنى الذي يحتوي على 13ج-الجلوكوز ونترات الصوديوم N من 15وحل عناصر النزرة تعد كل على حدة وثم المختلطة قبل الاستخدام.
      1. إعداد 100 مل المتوسطة الدنيا التي تحتوي على نظائر كما هو موضح في الجدول 1. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6.6 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (1 م) أو حل HCl (1 م).
      2. اﻷوتوكﻻف متوسطة الحد الأدنى لمدة 25 دقيقة في 121 درجة مئوية.
      3. إعداد 100 مل (1، 000 x) لتتبع عناصر الحل، حل الأملاح المدرجة في الجدول 2 في الماء المقطر. اﻷوتوكﻻف الحل لمدة 25 دقيقة في 134 درجة مئوية. تهدئة وتخزين الحل عند 4 درجة مئوية للاستخدام القصير الأجل. سيكون حوالي 6.5 درجة الحموضة ويمكن التحقق من استخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
      4. إضافة 0.1 مل من محلول العناصر النزرة إلى 100 مل من 13ج، 15المسمى ن متوسط الحد الأدنى كما هو موضح في الجدول 2 قبل الاستخدام.
  2. نمو المواد الفطرية
    1. نقل كمية صغيرة من الفطريات من التخزين على صفيحة YPD باستخدام حلقة إينوكولاتينج في غطاء الاندفاق الصفحي. الحفاظ الثقافة في 30 درجة مئوية لمدة يومين في حاضنة.
    2. استخدم حلقة إينوكولاتينج لنقل نشط حافة الفطرية المتنامية إلى 13ج،15وسم ن الحل في غطاء الاندفاق الصفحي. الحفاظ على الثقافة في 30 درجة مئوية ل 3-5 أيام عند 220 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز.
    3. الطرد المركزي في 4,000 س ز 20 دقيقة إزالة المادة طافية وجمع بيليه.
    4. استخدام الملاقط جمع ز ~0.5 بيليه رطب جيدا (> 50 الترطيب % wt) لدراسات الرنين المغناطيسي النووي. ستزداد سوءا فقدان الماء في أي لحظة إلى حد كبير القرار الطيفية.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، كمية صغيرة (0.1 g) من mycelia رطب يمكن فصلها وتجفيفها تماما تحت ن2 تدفق الغاز في غطاء محرك السيارة أو ليوفيليزير تقدير مستوى الماء وحساب نسبة كتلة جافة. عادة، بيليه الذي يحتوي على ~0.3 ز يمكن الحصول على الكتلة الجافة بعد 3 أيام. إذا كانت التجربة الرنين المغناطيسي النووي ستجري طويلة (> 7 أيام) و/أو إذا كانت دولة الفطريات يحتاج إلى إصلاح، المواد الفطرية يمكن تجميد عميق في سائل ن2 ل 10-20 دقيقة قبل إجراء مزيد من المعالجة. إذا كانت التجربة ستكون قصيرة (3-6 أيام)، التجميد يمكن تخطيها حتى تظل العينة الطازجة.
    5. خلط المواد الزائدة بنسبة 20% (v/v) من الجلسرين في أنبوب الطرد مركزي والاحتفاظ بها في ثلاجة ᵒC-80 للتخزين على المدى الطويل.

2-إعداد دخناء أ Solid-state الرنين المغناطيسي ودراسات إدارة التخطيط الوطني

  1. إعداد دخناء أ لتجارب الرنين المغناطيسي النووي الصلبة
    1. دياليزي ال 13ج، 15المسمى ن الفطرية من عينة (الخطوة 1.2.4.) ضد 1 لتر عازلة الفوسفات 10 ملم (pH 7.0) في 4 درجات مئوية باستخدام كيس الغسيل الكلوي مع وزن الجزيئي كاتشين 3.5 استقطاع لإزالة الجزيئات الصغيرة من متوسط نمو لإجمالي مدة 3 أيام. تغيير المخزن المؤقت مرتين يوميا.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، العينة يمكن غسلها عن 6-10 مرات استخدام المياه لإزالة الجزيئات الصغيرة المتبقية.
    2. نقل العينة إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق (10,000 س ز) استخدام الطرد مركزي benchtop. إزالة المادة طافية وجمع المواد الفطرية المتبقية.
    3. حزمة 70-80 ملغ شكل موحد 13عينة المسمى ج ورطب جيدا لصق في دوار2 زرو 4 ملم أو 30-50 مغ للدوارات 3.2 mm لتجارب الرنين المغناطيسي النووي. متكررة ضغط العينة برفق باستخدام قضيب معدني وامتصاص المياه الزائدة باستخدام الورق.
    4. محكم في آب الدوار وإدراج العينة في المطياف لتوصيف الرنين المغناطيسي النووي الصلبة.
      ملاحظة: اقترحت الدوارات العلامة التجارية الجديدة للتقليل من احتمال تعطل الدوار وعينه الانسكاب في مطياف الرنين المغناطيسي النووي. إذا لزم الأمر، يمكن إدراج كل إف المتاح مع ختم مسامير ليكون بمثابة حاوية ثانوي داخل الدوار.
  2. إعداد عينات دخناء أ لتجارب إدارة التخطيط الوطني
    1. إعداد 100 ميليلتر من التثقيف المذيبات29،44 (يعرف أيضا باسم مصفوفة إدارة التخطيط الوطني) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل 13ج،15المسمى ن العينات فطرية. مصفوفة إدارة التخطيط الوطني هذا يحتوي على خليط من د8-الجلسرين/د2س/ح2س (60/30/10 المجلد %).
      ملاحظة: إذا كانت العينات غير مسمى التحقيق، ثم إعداد مصفوفة إدارة التخطيط الوطني باستخدام 13المنضب ج د8-الجلسرين (12ج3، 99.95 في المائة؛ د8، 98 ٪) وإشارة د2س وح2س لتجنب 13ج مساهمة من المذيبات.
    2. حل 0.7 ملغ أموبول45 في 100 ميليلتر من المذيبات التثقيف للنموذج 10 مم حل جذري الأسهم. دوامة لمدة 2-3 دقيقة لضمان أن الجذور هي حل تماما في الحل.
    3. ينقع 10 مغ من دياليزيد 13ج، 15المسمى ن المواد الفطرية كما هو موضح في الخطوات السابقة (الخطوات 2.1.1 و 2.1.2) إلى 50 ميليلتر من حل أموبول، وطحن الخليط باستخدام مدقة وهاون لضمان تغلغل الجذور في أقل ما يقال جدران الخلايا المسامية.
      ملاحظة: للحد من معدل فقدان الماء، طحن يمكن أيضا تجري في أنبوب ميكروسينتريفوجي باستخدام ميكروبيستلي.
    4. إضافة ميليلتر 30 آخر من الحل الجذري لبيليه مطحون للصودا الكاوية المزيد العينة الفطرية.
    5. حزمة بيليه في دوار ياقوت 3.2 ملم، وضغط أقل ما يقال وإزالة المذيب التثقيف الزائدة. إضافة المكونات سيليكون 3.2 ملم لمنع فقدان الماء. عادة، يمكن أن تكون معبأة 5-30 ملغ عينة للدوار. المبلغ المحدد يجب أن يتحدد بشرط الحساسية تجارب الرنين المغناطيسي النووي لإجراء.
    6. إدراج وتدور العينة في مطياف التثقيف وقياس طيف تعزيز التثقيف تحت إشعاع الموجات الدقيقة ومقارنتها مع طيف الموجات قبالة. هذا سيؤدي إلى تعزيز عامل اليورو/إيقاف، التي ينبغي أن تكون 20-40 لهذه المواد المعقدة. تشغيل التجارب المصممة لتحديد بنية جدار الخلية.

3-إعداد الكتلة الحيوية النباتية للرنين المغناطيسي ودراسات إدارة التخطيط الوطني

  1. تحضير المواد النباتية للرنين المغناطيسي النووي الصلبة
    1. إنتاج موحد 13ج المسمى نباتات داخلية باستخدام اللوازم2 13شركة في نمو الدائرة 13ج-جلوكوز وسيط أو كما هو موضح سابقا46،47 أو مباشرة شراء مواد المسمى من شركات العلامات النظائر.
      ملاحظة: 13ج-الجلوكوز يمكن فقط استخدام في النمو الظلام لتجنب إدخال 12ج بعملية التمثيل الضوئي.
    2. قطع شكل موحد المسمى 13ج المواد النباتية إلى قطع صغيرة (عادة 1-2 ملم في البعد) باستخدام شفرة حلاقة مختبر.
      ملاحظة: تبعاً للغرض، جدران الخلية المستخرجة تستخدم أحياناً لتحديد الخصائص الهيكلية وبروتوكولات مفصلة في21،الدراسات السابقة46.
    3. إذا كان سابقا تجفف العينة، إضافة 100 ميليلتر من الماء إلى 30 ملغ مواد النباتية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، الدوامة، حجته في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 يوم. الطرد المركزي في س 4,000 ز لمدة 10 دقائق وإزالة المياه الزائدة باستخدام ماصة.
    4. إذا كانت العينة المجففة ابدأ في أي نقطة، مباشرة استخدام العينة دون تلقي مزيد من العلاج.
    5. حزمة المواد النباتية الناتجة إلى 3.2 مم أو 4 مم2 زرو الدوارات لتجارب الرنين المغناطيسي النووي الصلبة.
  2. تحضير المواد النباتية لدراسات إدارة التخطيط الوطني
    1. إعداد 60 ميليلتر حل الأسهم من 10 مم أموبول الراديكالية كوصف الخطوات 2.2.1 و 2.2.2.
    2. قطع شكل موحد المسمى 13ج المواد النباتية دراستها إلى قطع صغيرة (1-2 مم في البعد) استخدام شفرة حلاقة مختبر وتزن 20 ملغ المواد النباتية.
    3. اليد طحن القطع النباتية إلى جزيئات صغيرة (~ 1-2 مم) باستخدام قذائف الهاون والمدقة. مساحيق النهائي لها مظهر متجانس.
    4. إضافة 40 ميليلتر من الحل الأسهم التثقيف أعدت في الخطوة السابقة (الخطوة 2.2.2) للمواد النباتية وطحن ملطفة لمدة 5 دقائق لضمان متجانسة الاختلاط مع الراديكالية.
    5. إضافة آخر ميليلتر 20 من حل الأسهم كذلك هيدرات المواد النباتية بعد الطحن.
    6. حزمة العينة النباتية متوازن في دوار ياقوت 3.2 ملم لتجارب إدارة التخطيط الوطني. إدراج المكونات سيليكون لتجنب فقدان الماء.

4-معيار الرنين المغناطيسي النووي الصلبة تجارب لتوصيف الأولية الحيوية الغنية بالكربوهيدرات

ملاحظة: يتم توفير لمحة موجزة عن تجارب الرنين المغناطيسي النووي في هذا القسم. ومع ذلك، يتطلب توضيح الهيكلية عادة خبرة واسعة. ولذلك، يوصي ببذل جهود تعاونية مع سبيكتروسكوبيستس الرنين المغناطيسي النووي.

  1. قياس 1-د 13ج عبر الاستقطاب (CP)، 13ج الاستقطاب المباشر (DP) مع 2-s و 35-s سلة التأخير، و 1ح-13"ج كفؤ"48،49 الأطياف للحصول على فهم عام للديناميكية توزيع مكونات الخلية (الشكل 1a). جدر الخلايا عادة الجزء جامدة نسبيا ويحمل إشارات المهيمنة في الطيف CP.
  2. قياس بسلسلة من التجارب علاقة13ج 2D القياسية 13ج-للمهمات صدى إشارات 13ج. بدء تشغيل مع عدم كفاية إعادة تركيز50،51 للحصول على اتصال الكربون، التي تحتاج إلى مساعدة بسلسلة من التجارب من خلال الفضائية مثل 1.5 ms رفدر52 (الشكل 1b) والحبل 50 مللي ثانية/الدر53 التجارب.
    ملاحظة: إذا كان من اهتمام لإيجاد عينة غنية بعنصر معين، على سبيل المثال، الابتدائية أو جدران الخلايا الثانوية، ثم شرائح متعددة أو محطات متعددة قد تحتاج إلى تقاس بشكل منفصل للعثور على العينة على النحو الأمثل.
  3. إجراء تجارب الارتباط13ج 2D 15N--الذي يمكن أن يقاس بتسهيل مهام صدى للبروتينات والكربوهيدرات نيتروجيناتيد.
    ملاحظة: التعيين الرنين عادة ما تستغرق وقتاً طويلاً. يجري حاليا وضع طريقة لتسهيل الإحالة صدى إشارات الكربوهيدرات لأولئك العلماء دون خبرة سابقة.
  4. قياس تجارب أكثر تخصصا لتحديد التقارب المكاني (الشكل 1 ج، د) والماء وموبيليتيس من الجزيئات الحيوية المعقدة لتحديد هيكل ثلاثي الأبعاد للمواد الغنية بالكربوهيدرات ووصف بصورة منتظمة سابقا22،29.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلامات النظائر إلى حد كبير يعزز حساسية الرنين المغناطيسي النووي ويجعل من الممكن لقياس مجموعة من 2D 13ج-13ج و 13ج-15ن أطياف الارتباط لتحليل تكوين والماء والتنقل والتعبئة من البوليمرات، التي سوف تكون متكاملة لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد للعمارة خلية جدار (الشكل 1). إذا نجحت عملية تسمية موحدة، يمكن جمع مجموعة كاملة من ج د 1 13و 15ن أطياف ضمن ح 1 وكل طيف 2D القياسية ينبغي أن لا تزيد عن 24 ساعة لقياس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالمقارنة مع أساليب الكيمياء الحيوية، الرنين المغناطيسي النووي الصلبة مزايا كأسلوب غير المدمرة وعالية الدقة. الرنين المغناطيسي النووي أيضا الكمية في التحليل التركيبي، وخلافا لمعظم أساليب تحليلية أخرى، لا أوجه عدم اليقين وأدخلت بالذوبان المحدودة من البوليمرات الحيوية. إنشاء البروتوكول الحالي يسهل الدراسات المستقبلية على الحيوية الغنية بالكربوهيدرات والبوليمرات فونكتيوناليزيد. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تحليل البيانات وتعيين الرنين يمكن تستغرق وقتاً طويلاً وعادة ما يتطلب التدريب المنتظم. الكتاب حاليا بوضع أدوات وقواعد ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا شيء الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل "المؤسسة الوطنية للعلوم" من خلال المكتب جبهة الخلاص الوطني-1833040. مختبر المجال المغناطيسي وطنية عالية (نهمفل) معتمد من قبل "المؤسسة الوطنية للعلوم" من خلال هيئة الهجرة واللاجئين-1157490، وفي ولاية فلوريدا. نظام ماس-إدارة التخطيط الوطني في نهمفل تموله جزئيا OD018519 S10 المعاهد الوطنية للصحة، وجبهة الخلاص الوطني تشي-1229170.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأمونيوم موليبدات رباعي الهيدراتأكروس أورجانكس12054-85-2
AMUPolCortecnetC010P002
ميزان الوزن التحليليأوهاوسB730439218موديل PA84C
Bioclave 16 لترVWR470230-598
خزانة السلامة الحيويةشركة Labconco302319100
حمض البوريكVWRBDH9222في 15-30 درجة ؛ C
الكوبالت (II) كلوريد سداسي هيدراتهانيويل |فلوكا60820& 98٪
كبريتات النحاس (II) خماسي الهيدراتBDHBDH9312& ge ؛ 98٪
Corning LSE هز حاضنةThermo Fisher Scientific7202152
D2< / sub>OSigma Aldrich15188299.9 ذرة ٪
D 6< / sub>-DMSOسيجما ألدريتش15187499.9 ذرة ٪
D 8< / sub>-glycerolSigma Aldrich447498& ge ؛ 99 ذرة ٪ D
أنابيب غسيل الكلى 3.2 كيلو دالتونسيجما ألدريتشD2272132724
فوسفات ثنائي البوتاسيومVWRBDH9266 98٪
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516& ge ؛ 99.5
Heraus Megafuge 16R الطرد المركزيThermo Fischer Scientific750004271الحد الأقصى RCF 25،830 × g
HR-MAS طقم إدراج يمكن التخلصمنه BrukerB4493Kel-F
Iron (II) كبريتات هيبتاهيدراتAlfa Aesar14498& ge ؛ 99+ ٪
كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتVWR10034998تخزين في 18-26 درجة ؛ C
المنغنيز (II) كلوريد رباعي الهيدراتAlfa Aesar11563& ge ؛ 99
فوسفات أحادي البوتاسيومVWR470302-254& ge ؛ 99٪
مقياس الأس الهيدروجينيMettler ToledoB706689216
رباعي الصوديوم إيثيلين ديامين تترا أسيتاتAcros Organics13235-36-9& ge ؛ 99.5
كبريتات الزنك هيبتاهيدراتألفا إيسار33399 98٪
12< / sup>C3 ، d8< / sub>-glycerolIsotope LaboratoryCDLM-8660<sup>12< / sup>C3 ، 99.95٪ ؛ D8 ، 98٪
13< / sup>C6-glucoseSigma Alrdrich364606& ge ؛ 99٪ (CP)
15< / sup>N-نترات الصوديومSigma Aldrich364606& ge ؛ 98 ٪ 15N ، > 99 (cp)
3.2 مم دوار الياقوت NMRCortecnetB6939
3.2 مم قابس سيليكونBrukerB7089
4 مم طقم دوار MASBrukerH14355زركونيا
متجر ٪ ٪ ٪ Cambridge

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435(2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902(2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747(2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347(2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

13 15

مقالات ذات صلة