كتلة بروتينات مستقبلات جيرمينانت في 'جيرمينوسوميس' في الغشاء الداخلي للجراثيم العصوية نجحت . يمكننا وصف بروتوكول باستخدام القرار سوبر مجهرية وفلوري البروتينات مراسل لتصور جيرمينوسوميس. ويحدد البروتوكول أيضا مجالات الغشاء الداخلي بوغ ملطخة تفضيلي مع صبغ الغشاء FM4-64.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصور جيرمينوسوميس و "الغشاء الداخلي" في الجراثيم العصوية نجحت
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الحجم الصغير للجراثيم ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، يسبب صعوبات في تحليلاتها مجهرية باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي. القرار فائقة ثلاثي الأبعاد "المركبة إضاءة مجهرية" (3D-سيم) أداة واعدة للتغلب على هذه العقبة، وتكشف عن تفاصيل الجزيئية لعملية إنبات أبواغ عصيات نجحت (نجحت باء). هنا، يمكننا وصف استخدام سيمتشيك المعدلة (إيماجيج)-مساعد عملية التصوير ثلاثي الأبعاد والبروتينات الفلورية مراسل مجهرية سيم من جيرمينوسوميس جراثيم نجحت ، cluster(s) من البروتينات الإنبات. ونقدم أيضا إجراء تصوير سيم 3D (قياسية) لتلطيخ FM4-64 باء-نجحت بوغ الأغشية. باستخدام هذه الإجراءات، ونحن الحصول على قرار غير مسبوقة للتعريب جيرمينوسومي وتبين أن > 80% KGB80 باء-نجحت جراثيم نائمة تم الحصول عليها بعد تبوغ على المعرفة المتوسطة والمماسح الحد الأدنى لها واحد أو اثنين من غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري البؤر. كما كانت البؤر مشرقة الملاحظة في FM4-64 الملون سيم 3D صور جراثيم مما يوحي بوجود مجالات الدهن الغشاء الداخلي لسيولة مختلفة يحتمل. مزيد من الدراسات أن استخدام مزدوج وسم الإجراءات مع الأصباغ الغشاء وجيرمينوسومي البروتينات مراسل لتقييم التعريب المشارك وهكذا الحصول على لمحة أمثل المنظمة عصيات إنبات البروتينات في الغشاء الداخلي بوغ ممكن.
المقدمة
جراثيم بأوامر باسيلاليس وكلوستريدياليس أيضي نائمة ومقاومة غير عادية لأنظمة تطهير قاسية، ولكن إلا إذا كانت تنبت، لا يمكن أن يسبب آثار ضارة بالبشر1. في المغذيات جيرمينانت المشغلة إنبات أبواغ عصيات نجحت (باء-نجحت)، الحدث بدء جيرمينانت ملزم لمستقبلات جيرمينانت (الموارد الوراثية) الموجود في الغشاء الداخلي بوغ (IM). وفي وقت لاحق، ترانسدوسي الموارد الوراثية إشارات للبروتين قناة سبوفا الموجود أيضا في الدردشة. وهذا يؤدي في بداية تبادل بوغ الأساسية حمض بيريدين-2, 6-ديكاربوكسيليك (حمض ديبيكولينيك؛ اتفاق دارفور للسلام؛ تضم 20 في المائة من بوغ الأساسية بالوزن الجاف) للمياه عن طريق قناة سبوفا. في وقت لاحق، الإفراج عن اتفاق دارفور للسلام يطل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1- باء-سوبتيليس تبوغ (التوقيت: 7 أيام قبل الملاحظة المجهرية)
-
1 يوم
- متتالية ثقافة بكتيرية في لوحة (تريبتوني 1%، استخراج الخميرة 0.5%، 1% كلوريد الصوديوم، 1% أجار) أجار مرق لوريا بيرتاني (رطل)13 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للحصول على مستعمرات واحدة. استخدام سلالة KGB80 نجحت (PS4150 جيركا القط جيركب-متشيري جيركك، وكان غيرد-التجارة والنقل) وعن سلالة الخلفية الأصل نجحت PS4150 (PS832 ΔgerE::spc، ΔcotE::tet) كما هو موضح سابقا7.
ملاحظة: استخدام الجراثيم مع الخلفية ΔcotEΔgerE ضروري في التصور جيرمينوسومي، بغ....
- متتالية ثقافة بكتيرية في لوحة (تريبتوني 1%، استخراج الخميرة 0.5%، 1% كلوريد الصوديوم، 1% أجار) أجار مرق لوريا بيرتاني (رطل)13 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للحصول على مستعمرات واحدة. استخدام سلالة KGB80 نجحت (PS4150 جيركا القط جيركب-متشيري جيركك، وكان غيرد-التجارة والنقل) وعن سلالة الخلفية الأصل نجحت PS4150 (PS832 ΔgerE::spc، ΔcotE::tet) كما هو موضح سابقا7.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويقدم البروتوكول الحالي إجراء تصوير مجهر سيم للجراثيم البكتيرية. وأجريت إجراءات إعداد تبوغ والشريحة كما هو مبين في الشكل 1 قبل التصوير. في وقت لاحق، تم تطبيق إجراءات التصوير والتحليل سواء بالنسبة لتعتيم (الفلورسنت البروتين المسمى البروتينات الإنبات) ومشرق عينات سبور (المسبار محبتين الملون إيم) كما هو مبين في النص التالي.
تعريب جيرمينوسوميس في جراثيم نجحت
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويتضمن البروتوكول عرضت إجراء سيم 3D قياسية لتحليل الملون جراثيم نجحت 64 FM4 يتضمن تبوغ وإعداد الشرائح وعمليات التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، وصف البروتوكول تعديل سيمتشيك (إيماجيج)-ساعدت 3D التصوير عملية مجهرية سيم من جيرمينوسوميس بوغ نجحت المسمى مع الصحفيين الفلورسنت. الإجراء الأخير الذي سمح لنا بمراقبة هذه الهيكلية خافت مع التباين المحسن. باقتران إجراءات التصوير اثنين، فإنه من الممكن تصور الهياكل الفرعية المنفصلة في بوغ نفس مع المجهر سيم ذاتها، وبالتالي تحسين لدينا أساسا لفهم ميكانيكية لعملية الإنبات. علم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وأعلن لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون كريستيان زيلينبيرج لمساعدته أثناء تصوير سيم. جي دبليو يقر "مجلس المنح الدراسية الصيني" لزمالة درجة دكتوراه وشكرا إيرين ستيلينجويرف لمساعدة لها المرحلة الأولية من التصوير.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شرائح الزجاج المجفف بالهواء | Menzel Gl & auml ؛ ser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100 & هدف النفط (NA = 1.49) | |||
| B. subtilis< / em> KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan< / em>) | |||
| B. subtilis < / em>PS4150 (PS832 & Delta; gerE :: spc ، & دلتا ؛ cotE :: tet < / em>) | |||
| قوارير Erlenmeyer 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| قوارير Erlenmeyer 250 مل | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres المجهرية المعدلة بالكربوكسيل | Invitrogen ، 0.1 & mu ؛ m | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz تدرج الكثافة غير الأيونية متوسط | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| ImageJ | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD كاميرا | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| أنابيب الطرد الدقيق 1.5 مل | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| برنامج التصوير المجهر | نيكون ، اليابان | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultra Pure المياه المنزوعة للمعادن | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| نيكون Eclipse Ti المجهر | |||
| زجاجة غطاء برغي من مادة البولي بروبيلين 180 مل 75003800 | Thermo Fisher Scientific | ||
| أغطية دقيقة | بول مارينفيلد | 117650 | |
| أنابيب سفلية مستديرة 15 مل | أنابيب غطاء برغي ثيرمو فيشر Scientific | Nunc TM | |
| 50 مل | ثيرمو فيشر Scientific | Nunc TM |
المراجع
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Re....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
