Method Article

التصور جيرمينوسوميس و "الغشاء الداخلي" في الجراثيم العصوية نجحت

DOI:

10.3791/59388

⸱

April 15th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كتلة بروتينات مستقبلات جيرمينانت في 'جيرمينوسوميس' في الغشاء الداخلي للجراثيم العصوية نجحت . يمكننا وصف بروتوكول باستخدام القرار سوبر مجهرية وفلوري البروتينات مراسل لتصور جيرمينوسوميس. ويحدد البروتوكول أيضا مجالات الغشاء الداخلي بوغ ملطخة تفضيلي مع صبغ الغشاء FM4-64.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحجم الصغير للجراثيم ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، يسبب صعوبات في تحليلاتها مجهرية باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي. القرار فائقة ثلاثي الأبعاد "المركبة إضاءة مجهرية" (3D-سيم) أداة واعدة للتغلب على هذه العقبة، وتكشف عن تفاصيل الجزيئية لعملية إنبات أبواغ عصيات نجحت (نجحت باء). هنا، يمكننا وصف استخدام سيمتشيك المعدلة (إيماجيج)-مساعد عملية التصوير ثلاثي الأبعاد والبروتينات الفلورية مراسل مجهرية سيم من جيرمينوسوميس جراثيم نجحت ، cluster(s) من البروتينات الإنبات. ونقدم أيضا إجراء تصوير سيم 3D (قياسية) لتلطيخ FM4-64 باء-نجحت بوغ الأغشية. باستخدام هذه الإجراءات، ونحن الحصول على قرار غير مسبوقة للتعريب جيرمينوسومي وتبين أن > 80% KGB80 باء-نجحت جراثيم نائمة تم الحصول عليها بعد تبوغ على المعرفة المتوسطة والمماسح الحد الأدنى لها واحد أو اثنين من غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري البؤر. كما كانت البؤر مشرقة الملاحظة في FM4-64 الملون سيم 3D صور جراثيم مما يوحي بوجود مجالات الدهن الغشاء الداخلي لسيولة مختلفة يحتمل. مزيد من الدراسات أن استخدام مزدوج وسم الإجراءات مع الأصباغ الغشاء وجيرمينوسومي البروتينات مراسل لتقييم التعريب المشارك وهكذا الحصول على لمحة أمثل المنظمة عصيات إنبات البروتينات في الغشاء الداخلي بوغ ممكن.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جراثيم بأوامر باسيلاليس وكلوستريدياليس أيضي نائمة ومقاومة غير عادية لأنظمة تطهير قاسية، ولكن إلا إذا كانت تنبت، لا يمكن أن يسبب آثار ضارة بالبشر1. في المغذيات جيرمينانت المشغلة إنبات أبواغ عصيات نجحت (باء-نجحت)، الحدث بدء جيرمينانت ملزم لمستقبلات جيرمينانت (الموارد الوراثية) الموجود في الغشاء الداخلي بوغ (IM). وفي وقت لاحق، ترانسدوسي الموارد الوراثية إشارات للبروتين قناة سبوفا الموجود أيضا في الدردشة. وهذا يؤدي في بداية تبادل بوغ الأساسية حمض بيريدين-2, 6-ديكاربوكسيليك (حمض ديبيكولينيك؛ اتفاق دارفور للسلام؛ تضم 20 في المائة من بوغ الأساسية بالوزن الجاف) للمياه عن طريق قناة سبوفا. في وقت لاحق، الإفراج عن اتفاق دارفور للسلام يطلق تنشيط التحلل peptidoglycan اللحاء، وامتصاص كميات إضافية من الماء يتبع2،،من34. هذه الأحداث التي تؤدي إلى الإجهاد الميكانيكي على طبقات معطف، انفصامه اللاحقة، وظهور ثمرة، وأخيراً النمو الخضري. ومع ذلك، لا تزال بعيدة عن تحل التفاصيل الدقيقة الجزيئية لعملية الإنبات.

مسألة رئيسية حول إنبات بوغ تتعلق بالخصائص الفيزيائية الحيوية من الدهون المحيطة بالبروتينات إنبات الدردشة فضلا عن البروتينات قناة "الدردشة سبوفا". هذا بلير الدهن إيم غير متحرك إلى حد كبير هو الحاجز الرئيسي النفاذية للعديد من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك المواد الحافظة الكيميائية السامة، التي تمارس عملها في بوغ النواة أو الخلية النباتي السيتوبلازم5،6. Bilayer الدهن إيم من المرجح في حالة جل، على الرغم من أن هناك جزءا كبيرا من الدهون المتنقلة في التراسل الفوري5. وقد إيم بوغ أيضا إمكانات التوسع الكبير5. وبالتالي، يزيد من المساحة السطحية للدردشة 1.6-fold عند الإنبات دون تركيب غشاء إضافية ومصحوبا بفقدان هذا الغشاء مميزة منخفضة النفاذية والدهن الجمود5،6.

بينما التفاصيل الجزيئية تنشيط إنبات البروتينات وتنظيم الدهون إيم في جراثيم مواضيع جذابة للدراسة، صغر حجم الجراثيم ب-نجحت ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، تشكل تحديا أن التحليل المجهري. استخدام الصحفيين الفلورسنت تنصهر فيها البروتينات الإنبات، تقترح غريفيث et al ابيفلوريسسينسي المجهر أدلة دامغة، في جراثيم نجحت بروتين سقالة غيرد تنظم ثلاث مفارز غرام (ألف وباء وجيم) لغيرا وب ك الموارد الوراثية، في مجموعة7. مصطلح 'جيرمينوسومي' لهذه المجموعة من البروتينات الإنبات ووصفها الهياكل ~ 300 نانومتر كبير إيم البروتين البؤر8. عند بدء الإنبات بوغ، تفريق جيرمينوسومي نيون البؤر في نهاية المطاف تغيير إلى أكبر أنماط نيون، مع > 75% سكان بوغ عرض هذا النمط في جراثيم نامي على ح 1 مع لفالين8. لاحظ أن متوسط الورقة المذكورة أعلاه يستخدم الصور من عشرات الصور الفلورسنت على التوالي، للحصول على قوة إحصائية والتغلب على عقبة إشارات الفلورية منخفضة ولاحظ أثناء التصوير. لم هذا التصور لهذه الهياكل في الجراثيم البكتيرية على حافة ما هو ممكن من الناحية التقنية مع أدوات مجهرية الكلاسيكية ولا تقييم لمقدار البؤر في بوغ واحد لم يكن التعريب سوبسيلولار بهم أكثر تفصيلاً ممكن مع هذا النهج.

هنا، نحن توضح استخدام الإضاءة تنظيماً من (SIM) للحصول على مجموعة مرئيات تفصيلية مجهرية والتحديد الكمي ل germinosome(s) في جراثيم نجحت باء، فضلا عن تلك المجالات الدهن إيم9. ويتضمن البروتوكول أيضا تعليمات تبوغ وإعداد الشرائح وتحليل الصور التي سيمتشيك (v1.0، البرنامج المساعد إيماجيج) فضلا عن10،إيماجيج،من1112.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1- باء-سوبتيليس تبوغ (التوقيت: 7 أيام قبل الملاحظة المجهرية)

  1. 1 يوم
    1. متتالية ثقافة بكتيرية في لوحة (تريبتوني 1%، استخراج الخميرة 0.5%، 1% كلوريد الصوديوم، 1% أجار) أجار مرق لوريا بيرتاني (رطل)13 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للحصول على مستعمرات واحدة. استخدام سلالة KGB80 نجحت (PS4150 جيركا القط جيركب-متشيري جيركك، وكان غيرد-التجارة والنقل) وعن سلالة الخلفية الأصل نجحت PS4150 (PS832 ΔgerE::spc، ΔcotE::tet) كما هو موضح سابقا7.
      ملاحظة: استخدام الجراثيم مع الخلفية ΔcotEΔgerE ضروري في التصور جيرمينوسومي، بغية التقليل إلى أدنى حد من أوتوفلوريسسينسي من طبقات معطف سبور7.
    2. تعقيم كل وسائل الإعلام، وأنابيب، بيبيتس وغيرها من المواد الثقافة لاستخدامه مع الأساليب المناسبة.
  2. 2 يوم
    1. تطعيم مستعمرة واحدة إلى 5 مل متوسطة رطل في الصباح الباكر واحتضان الثقافة تحت التحريك المستمر في أنبوب ملولبة على 200 لفة في الدقيقة/دقيقة و 37 درجة مئوية حتى OD600 تصل إلى 0.3-0.4 (حوالي 7 ح).
    2. جعل 500 مل من والمماسح المتوسطة (درجة الحموضة 7.5) التي تحتوي على 3 نانومتر (NH4)6مو7س24·4H2س، 0.4 ميكرومتر ح3بو3و 30 نانومتر كوكل2·6H2س و 10 نانومتر CuSO4·5H2س، 10 نانومتر زنسو4·7H2س، مم 1.32 ك2هبو4، 0.4 مم مجكل2·6H2س، مم 0.276 ك2حتى4مم 0.01 فيسو4·7H2س، 0.14 ملم كاكل2·2H2س، 80 مم اجتماعات، 4 مم 10 مم تريسيني مم 0.1 الحركة2·2H2س، د-الجلوكوز-مونوهيدرات، و 10 ملم NH4Cl.
    3. تعد بسداده ملولبة الأنابيب 10-1-10-7 تخفيف المسلسل ثقافة رطل في 5 مل والمماسح المتوسطة واحتضانها الثقافات بين عشية وضحاها تحت التحريك المستمر في 200 لفة في الدقيقة/دقيقة و 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تخفيف المسلسل أعد هنا تهدف إلى الحصول على إضعاف في أوائل المرحلة الأسية في صباح اليوم التالي. هذه الخطوة والخطوة التالية ضرورية للسماح للخلايا لتتكيف مع متوسط النمو مخزنة والمماسح.
  3. 3 يوم
    1. حدد واحدة من تخفيف والمماسح مع OD600 من 0.3-0.4. تطعيم 0.2 مل الثقافة إلى المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) 20 مل متوسطة والمماسح في دورق مخروطي 250 مل واحتضان تحت التحريك المستمر حتى OD600 تصل إلى 0.3-0.4 (ح ~ 7).
    2. تطعيم والمماسح تبوغ استناداً إلى المتوسط (250 مل) مع ثقافة ما قبل 1% (v/v) من الخطوة 1.3.1 واحتضان لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية في قارورة لتر مخروطية تحت التحريك المستمر. لتلطيخ FM4-64 من جراثيم PS4150، إضافة التحقيق 2 ميكروغرام/مل FM4-64 (انظر الجدول للمواد) إلى ح متوسطة 1 أو 2 تبوغ بعد بلوغ ذروة OD600 القيمة للنمو الخضري (عادة حوالي 2) والسماح الثقافة إلى وفي وقت لاحق سبورولاتي حين حمايتها من الضوء5.
  4. يوم 7: الحصاد من جراثيم
    1. تحديد العائد تبوغ (جراثيم مقابل الخلايا النباتية) باستخدام الطوري في 100 X التكبير لتمييز جراثيم مرحلة مشرقة من مرحلة الزنزانات المظلمة وجراثيم ربما غير ناضجة. ويتوقع عائد بوغ مشرق مرحلة 90%.
    2. بيليه الجراثيم في س 4,270 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في جولة أسفل أنابيب الطرد المركزي. أغسل بيليه سبور 2-3 مرات مع 40 مل الماء المعقم 1 نوع ديمينيراليزيد فائقة نقية في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 مل (انظر الجدول للمواد). زيادة ونقصان لأسفل في كل غسل في س 4,270 ز لمدة 15 دقيقة (4 درجات مئوية).
  5. يوم 7: تنقية سبور
    1. بوغ تنقية: تعليق بيليه بوغ في 750 ميليلتر من 20% كثافة النطاق المتوسط التدرج (انظر الجدول للمواد)، وتحميل على 800 ميليلتر من 50% كثافة النطاق المتوسط التدرج في أنابيب معقمة ميكروسينتريفوجي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في س 21,500 ز. بيليه الحصول عليها تحتوي على جراثيم مجاناً. تعليق بيليه بوغ في 200 ميليلتر من 20% كثافة النطاق المتوسط التدرج وتحميل على 1 مل من 50% كثافة النطاق المتوسط التدرج في أنبوب ميكروسينتريفوجي، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 21,500 ز.
    2. غسل إعداد بوغ النهائية والتخزين: بيليه الحصول عليها تحتوي على جراثيم نائمة المنقي. أغسل الماء (انظر الجدول للمواد) بيليه سبور 2-3 مرات مع 1.5 مل من 1 نوع فائقة نقية معقمة وأسفل تدور بينهما في س 9,560 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. وأخيراً، تعليق بيليه في الماء 1 نوع فائقة نقية معقمة ل التطوير التنظيمي نهائي600 من حوالي 30. ويمكن تخزين مختبرين للجراثيم في-80 درجة مئوية لمدة 8 أسابيع14.

2-نزع

  1. علاج الجراثيم PS4150 مع 0.1 M كلوريد الصوديوم/0.1 م NaOH/1% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)/0.1 M ديثيوثريتول (DTT) في 70 درجة مئوية حاء 1 يغسل الجراثيم 10 مرات مع الماء 1 نوع فائقة نقية معقمة15،16. بالقيام بذلك، أي تمتز مسبار FM4-64 في الغشاء الخارجي بوغ وستتم إزالة الطبقات الخارجية.

3-ساترة وإعداد الشرائح11 (توقيت: ح 1 قبل المراقبة)

  1. قبل تنظيف عالية الدقة كوفيرسليبس (انظر الجدول للمواد) مع HCl م 1 لمدة 30 دقيقة في حمام مائي تهتز برفق. أغسل كوفيرسليبس مرتين في نقية فائقة 1 نوع المياه، وتخزينها في 100% (المجلد/المجلد) EtOH. والسماح لهم الجافة والتحقق من الوضوح قبل الاستخدام. قبل تنظيف الشرائح الزجاجية في 70% EtOH. والسماح لهم الجافة والتحقق من الوضوح قبل الاستخدام.

4-أخذ العينات الفلورسنت الجزئي المجالات الخرز الصغير أو جراثيم في الإطار الجينات الشريحة10 (توقيت 15 دقيقة)

  1. الحارة قبل عامين 70% EtOH تنظيفها والهواء الشرائح الزجاجية المجففة (انظر الجدول للمواد) لعدة ثوان على كتلة تدفئة 70 درجة مئوية وإسقاط ميكروليتر 65 من تعقيم 2% [اغروس] عقد في 70 درجة مئوية فوق شريحة زجاجية واحدة ومكان الشريحة الزجاجية الأخرى على أعلى لنشر ب [اغروس] الفترة الشرائح. وسوف يجف التصحيح [اغروس] في حوالي 5 دقائق.
  2. قطع التصحيح [اغروس] إلى مقطع 1 × 1 سم بعد إزالة إحدى الشرائح الزجاجية وإضافة 0.4 ميكروليتر من عينة (الفلورسنت الجزئي المجالات الخرز الصغير أو جراثيم من/mL8~ 10)، ونقل التصحيح إلى ساترة عالية الدقة بوضع ساترة على التصحيح و انزلاق من إيقاف تشغيله.
  3. إصلاح الإطار الجينات (1.5 x 1.6 سم2, 65 ميليلتر) على شريحة المجففة، التي وضعت ساترة إغلاق جميع زوايا الإطار، ومن ثم استكمال الشريحة لاستخدامه في الفحص المجهري.

5-التصوير11،17(توقيت: ح 1)

  1. التقاط الصور الإرسال والأسفار من الجراثيم وكذلك خليط من الأحمر والأصفر والأخضر تعديل كاربوكسيلات نيون الجزئي المجالات الخرز الصغير في "مجهر إضاءة منظم" (انظر الجدول للمواد) مجهزة 100 × (موضوعي النفط الفتحة العددية = 1.49)، اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا والصورة برمجيات تحليل (انظر الجدول للمواد). تولد كل الصور في درجة حرارة الغرفة دون الإخلال بالإضاءة المحيطة. تأكد من تنظيف دائماً 100 × الهدف والشريحة مع الإيثانول 75% قبل التصوير.
  2. التركيز على 100 نانومتر (قطر) الفلورسنت الجزئي المجالات الخرز الصغير وتحسين انتشار النقطة الدالة (psf) عن طريق ضبط الطوق التصويب على الهدف 100 x حتى يتم الحصول على psf متماثل، وبالتالي التقليل من عدم وضوح الصورة. Psf هو استجابة الدافع أو رد نظام التصوير إلى نقطة المصدر أو كائن نقطة.
  3. حدد مجال رؤية مع الجزئي المجالات الفلورسنت الخرز الصغير الجولة حوالي الساعة 10. تطبيق [غرتينغ] التركيز التكيف لكلا 561 نانومتر و 488 نانومتر الإثارة أطوال الموجه كدليل لبرامج تحليل الصورة.
  4. تركز الجراثيم مع انتقال الضوء والتقاط صورة انتقال ضوء في وضع متوسط 16 × مع التعرض 200 مللي ثانية لكل صورة.
  5. التقاط الصور 3D-سيم الفلورية الخام من الجراثيم مع وضع الإضاءة "3D-سيم"، إعدادات الكاميرا إلى وضع قراءات كسب الإلكترون (م) ضرب 10 ميغاهيرتز في 14-بت، وكسب م في 175. تثير المسبار FM4-64 في جراثيم PS4150 مع 561 ضوء الليزر في شمال البحر الأبيض المتوسط في 20% طاقة الليزر، ووقت إضاءة 400 مللي ثانية.
  6. تثير جيركب-مشري والجراثيم غيرد-التجارة والنقل في KGB80 مع، على التوالي، 561 نانومتر الليزر الخفيفة في قوة الليزر 30% 1 s، وشمال البحر الأبيض المتوسط 488 الليزر الضوء على 60% الليزر السلطة لضبط المكدس ض س. 3 في الأعلى أسفل وضع، 0.2 ميكرون/الخطوة والخطوات 7 20 خطوات جيرمينوسومي و تحليل التراسل الفوري، على التوالي.
    ملاحظة: وقد طبقت هذه المعلمات الليزر بغية ضمان قيمة سطوع الحد أقصى من إطار الرسم البياني من حوالي 4000.

6-إعادة بناء سيم 3D صور Raw من FM4-64 الملون جراثيم PS4150

  1. تؤدي "إعادة شريحة" سيم ن FM4-64 الملون PS4150 الجراثيم البيانات الخام. انقر فوق الزر بارام إعادة بناء شريحة على ورقة التبويب لوحة سيم ن لفتح نافذة سيم ن "شريحة الإعمار".
  2. تعيين معلمات التعمير في إطار إعادة الإعمار شريحة سيم ن . للحصول على صور مثالية أعيد بناؤها، اتبع اقتراح التعليمات سيم ن وانقر فوق عناصر التحكم المناسبة في إطار سيم ن شريحة الإعمار لضبط التباين تعديل الإضاءة (IMC) السيارات، عالية قمع الضوضاء القرار (هرنس) إلى 1.00 و الخروج من قمع طمس التركيز (أوفبس) إلى 0.05 كنقطة انطلاق.
  3. انقر فوق الزر إعادة شريحة في نافذة سيم ن شريحة الإعمار لإعادة بناء الصورة. تقييم جودة الصور أعيد بناؤها بالصور سريعة فورييه تحويل (FFT) ونقاط إعادة الإعمار، مما عرض بعد إعادة إعمار12.
  4. ضبط هرنس من 0.10 إلى 5.00 و أوفبس من 0.01 إلى 0.50 بالنقر فوق عناصر التحكم المناسبة في إطار إعادة الإعمار شريحة سيم ن حتى يتم الحصول على أفضل إعدادات المعلمة.
  5. انقر فوق الزر " تطبيق " في إطار Reconstuction شريحة سيم ن لتطبيق تغيير المعلمات. انقر فوق الزر إغلاق لإغلاق الإطار.
  6. جعل FM4-64 الملون PS4150 جراثيم الخام الصورة النشطة، وانقر فوق الزر إعادة شريحة على صفحة التبويب لوحة سيم ن لتنفيذ إعادة الإعمار شريحة. حفظ الصورة أعيد بناؤها.

7-صورة التحليل

  1. تحويل الصور الزائفة-ويديفيلد من جيرمينوسومي KGB80
    1. تحويل سيم 3D صور خام من KGB80 إلى الصور الزائفة-ويديفيلد بتفعيل البرنامج المساعد إيماجيج سيمتشيك الأداة المساعدة SI البيانات الخام إلى ويديفيلد الزائفة12مع النقر على يسار. المتوسطات الصور من البيانات الخام سيم ويديفيلد الزائفة وتجمع، على سبيل المقارنة، أي ما يعادل ويديفيلد التقليدية إنارة12صورة. ل ImageJ نفسها انظر https://imagej.net/Welcome. حدد جراثيم ~ 25 عشوائياً في كل صورة الإرسال المعكوس لتحليلها في وقت لاحق جيرمينوسومي في الصور الزائفة-ويديفيلد نيون.
    2. حدد في مجموعها ما يقرب من 350 (في هذا المثال، 346) KGB80 الجراثيم في الحقول لعرض 14 من شريحتين. ينبغي أن يحسب الأرقام البؤر الفلورسنت غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري في جراثيم KGB80 المحدد بشكل مستقل باثنين من الباحثين. الباحث يمكن الرجوع إلى الصور 3D-سيم الخام كلما كان في شك وجود بؤر جيرمينوسومي نيون منفصلة في الجراثيم.
    3. تقييم الكثافات كحد أقصى لكل بؤرة غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري وكثافة صورة كل بوغ KGB80 في ثلاثية الأبعاد مع إيماجيج المتكاملة.
  2. تحليل الصور الزائفة-ويديفيلد من جيرمينوسومي KGB80
    1. استخدام قيمة كثافة متكامل يعني مكدسات 7 ككثافة إشارة المتكاملة بوغ KGB80. تحديد كثافة الخلفية بالتصوير الخلفية سلالة PS4150 باستخدام إعدادات متطابقة. تعتبر البقع الفلورسنت في فرادى KGB80 جراثيم البؤر جيرمينوسومي عندما تكون واضحة يمكن تمييزها عن الخلفية.
    2. تطبيق اختبارات ANOVA أحادي الاتجاه لتحديد أهمية مع البرمجيات 9.0 المنشأ. النظر في القيم ف < 0.05 إحصائيا هامة. استخدام معامل ارتباط الرتب سبيرمان18 لتقييم الترابط بين عدد البؤر غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري وقياسات كثافة إشارة المتكاملة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويقدم البروتوكول الحالي إجراء تصوير مجهر سيم للجراثيم البكتيرية. وأجريت إجراءات إعداد تبوغ والشريحة كما هو مبين في الشكل 1 قبل التصوير. في وقت لاحق، تم تطبيق إجراءات التصوير والتحليل سواء بالنسبة لتعتيم (الفلورسنت البروتين المسمى البروتينات الإنبات) ومشرق عينات سبور (المسبار محبتين الملون إيم) كما هو مبين في النص التالي.

تعريب جيرمينوسوميس في جراثيم نجحت

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتضمن البروتوكول عرضت إجراء سيم 3D قياسية لتحليل الملون جراثيم نجحت 64 FM4 يتضمن تبوغ وإعداد الشرائح وعمليات التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، وصف البروتوكول تعديل سيمتشيك (إيماجيج)-ساعدت 3D التصوير عملية مجهرية سيم من جيرمينوسوميس بوغ نجحت المسمى مع الصحفيين الفلورسنت. الإجراء الأخير الذي سمح لنا بمراقبة هذه الهيكلية خافت مع التباين المحسن. باقتران إجراءات التصوير اثنين، فإنه من الممكن تصور الهياكل الفرعية المنفصلة في بوغ نفس مع المجهر سيم ذاتها، وبالتالي تحسين لدينا أساسا لفهم ميكانيكية لعملية الإنبات. علم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون كريستيان زيلينبيرج لمساعدته أثناء تصوير سيم. جي دبليو يقر "مجلس المنح الدراسية الصيني" لزمالة درجة دكتوراه وشكرا إيرين ستيلينجويرف لمساعدة لها المرحلة الأولية من التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
شرائح الزجاج المجفف بالهواءMenzel Gl & auml ؛ ser630-2870
APO TIRF N20R8 100 & هدف النفط (NA = 1.49)
B. subtilis< / em> KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan< / em>)
B. subtilis < / em>PS4150 (PS832 & Delta; gerE :: spc ، & دلتا ؛ cotE :: tet < / em>)
قوارير Erlenmeyer 1 LSigma-AldrichZ567868
قوارير Erlenmeyer 250 ملSigma-AldrichZ723088
FluoSpheres المجهرية المعدلة بالكربوكسيلInvitrogen ، 0.1 & mu ؛ mF8803
FM4-64Thermo Fisher ScientificF34653
Histodenz تدرج الكثافة غير الأيونية متوسطSigma-AldrichD2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD كاميراAndor Technologyhttps://imagej.net/Welcome
LB AgarSigma-AldrichL2897
أنابيب الطرد الدقيق 1.5 ملThermo Fisher Scientific3451PK
برنامج التصوير المجهرنيكون ، اليابانNIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultra Pure المياه المنزوعة للمعادنMilliporeMilli-Q IQ 7003
نيكون Eclipse Ti المجهر
زجاجة غطاء برغي من مادة البولي بروبيلين 180 مل 75003800Thermo Fisher Scientific
أغطية دقيقةبول مارينفيلد117650
أنابيب سفلية مستديرة 15 ملأنابيب غطاء برغي ثيرمو فيشر ScientificNunc TM
50 ملثيرمو فيشر ScientificNunc TM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290(2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972(2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915(2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293(1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636(2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388(2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacillus subtilis SporesGerminosome Localization3D Structured Illumination MicroscopySuper Resolution ImagingInner Membrane AnalysisFluorescent Reporter ProteinsGermination Protein ClustersFM4 64 Membrane StainingImageJ SIMcheck PluginSpore Germination Process

Related Articles