مقالة منهجية

إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط

DOI:

10.3791/59394

⸱

أبريل 19, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Physiology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 2Department of Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 3Department of Stem Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يصف لنا توليد وتطبيق مجموعة من المعدلة وراثيا التمويل نبات خطوط التعبير إيندوسيبلي، الخاصة بالانسجة مواتية في الخلايا الإنشائية الرئيسية الثلاثة وأرض قمية تبادل لإطلاق النار وأرض قمية الجذر وكامبيوم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير إيندوسيبلي والأنسجة على حدة أداة هامة وقوية لدراسة ديناميات اضطراب الوراثية الزمانية. الجمع بين جرينجاتي بالمرونة والكفاءة الاستنساخ مع نظام ثبت ومرجعية لهجر نظام (يطلق عليها هنا غرام-LhG4) للتعبير إيندوسيبلي، نحن قد ولدت مجموعة من خطوط نبات المعدلة وراثيا التي يمكن أن تدفع بالتعبير عن المستجيب كاسيت بمجموعة من أنواع الخلايا المحددة في الخلايا الإنشائية النباتية الرئيسية الثلاثة. وتحقيقا لهذه الغاية، اخترنا نظام الموارد الوراثية-LhG4 المتقدمة سابقا على أساس عامل نسخ تشيميريك ومروج المشابهة من نوع البوب ضمان رقابة مشددة على مجموعة واسعة من مستويات التعبير. وباﻹضافة إلى ذلك، تصور المجال التعبير التي تنشط فيها عامل النسخ الاصطناعية، يتم ترميز مراسل فلورسنت المترجمة ER mTurquoise2 تحت سيطرة المروج pOp4 أو pOp6 في خطوط برنامج التشغيل. هنا، نحن تصف الخطوات الضرورية لإنشاء سطر برنامج التشغيل أو المستجيب، وتبين كيف يمكن الناجمين عن خلية محددة نوع التعبير وأتباعه في أرض قمية تبادل لإطلاق النار، وأرض قمية الجذر وكامبيوم من نبات. باستخدام برنامج تشغيل عدة أو كافة خطوط، أثر سياق محدد للتعبير عن أحد أو عوامل متعددة (المستجيبة) تحت سيطرة المروج الاصطناعية البوب يمكن تقييم سرعة، على سبيل المثال في مصانع F1 من عبور بين المستجيب واحدة ومتعددة خطوط برنامج التشغيل. ويتجلى هذا النهج التعبير حمل خارج الرحم من VND7، عامل نسخ NAC قادرة على حمل خارج الرحم الثانوية خلية الجدار ترسب بطريقة ذاتية في خلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قيداً رئيسيا في علم الأحياء في عصر بوستجينوميك فك سياق الدور المحدد لعامل معين أو اضطراب الوراثية. كثيرا ما لا تسمح التأسيسي الاضطرابات الوراثية مثل النهج فقدان للوظيفة والكسب من وظيفة تحليل نقطة النهاية لعمليات التكيف مدى الحياة، تشويش التمييز بين الآثار الأولية والثانوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملثمين سياق مهام محددة أو يخفف من آثار واسعة النطاق في أنسجة بعيدة أو خلال مراحل أخرى من التنمية. وعلاوة على ذلك، في الحالات القصوى، يمكن أن يحول دون الفتك أي فكرة آليا. ومن الناحية المثالية، للالتفاف حول هذه القضايا، أحد يمكن تحليل أثر اضطراب الوراثية الحادة داخل سياق محدد مثل نوع خلية محددة بطريقة حل الوقت. ولتحقيق ذلك، هي الأدوات الجينية للخلية إيندوسيبلي، الخاصة بنوع التعبير المطلوبة1. لتوفير موارد للتقييم السريع لديناميات الزمانية المكانية استجابة للمستجيب عينها، جمعنا بين سهولة الاستنساخ المنصوص عليها في نظام جرينجاتي2 مع أثبتت فعاليتها من نظام الموارد الوراثية-LhG43، 45،،6. ونحن قد ولدت مجموعة من خطوط التعبير عن عامل النسخ تشيميريك LhG4 تنصهر فيها المجال ملزم يجند من الفئران كورتيكويد مستقبلات (GR)7 تحت سيطرة المروجين محددة نوع الخلية جيدا تتسم8. في استراحة الظروف، يبقى عامل النسخ خارج النواة، كما يرتبط المجال الموارد الوراثية قبل HSP90 سيتوسوليك. مع إضافة يجند الاصطناعية الديكساميتازون (Dex)، هو فعل إزفاء النووية وسوف التوسط LhG4 النسخ من أشرطة الكاسيت التعبير تحت سيطرة المروج الاصطناعية المشابهة من نوع البوب ، مثل مراسل mTurquoise2 وشملت في بنود برنامج التشغيل تصور المجال التعبير بعد التعريفي.  وهكذا، الخطوط برنامج تشغيل تقنيا تحتوي أيضا على كاسيت المستجيب. عبور مجموعة من بنود برنامج التشغيل مع خط يحمل كاسيت المستجيب مع، على سبيل المثال، أحد جينات للفائدة تحت التحكم من نفس نوع البوب المروج وهكذا يسمح التقييم السريع لآثار حادة أو طويلة الأجل المستجيب التعبير في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا.

هنا، نحن نقدم بروتوكول وصف الإجراءات اللازمة لإنشاء خطوط السائق والمستجيب، وتثبت كيف يمكن الناجم عن خلية محددة نوع التعبير وأتباعه في أرض قمية تبادل لإطلاق النار، وأرض قمية الجذر وكامبيوم من نبات. لتوضيح ذلك ببراعة وخصوصية لهذا النهج، فنحن نستخدم عامل النسخ المعروفة VND7 وقادرة على قيادة الخلية الثانوية مثل الخشب الجدار ثيكينينجس اكتوبيكالي9. علاج F1 من عبور بين السطر برنامج تشغيل11 10، pSCRوخط المستجيب pOp6:VND7 يؤدي إلى تكوين خلايا الخشب مثل حمل خارج الرحم في غمد النشا وقف الخلايا من نبات .

لتيسير توليد التجميعات الحمض النووي الكبيرة اللازمة لتشييد والبلازميدات التعبير السائق والمستجيب، كنا جرينجاتي بسرعة وكفاءة استنساخ الأسلوب2. جرنجيت الاستنساخ أساس في النوع الثاني S تقييد الإنزيمات مثل منظمة التعاون الاقتصادي31I أو إيسوشيزومير في جيش صرب البوسنة2. هذه الإنزيمات قطع المصب من مواقعهم الاعتراف غير المتناظر المنتجة يتدلى مع اختلاف تكوين قاعدة. من خلال دمج الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةأنا تقييد مواقع في النوكليوتيد وتخصيص تسلسلات عبء محددة لعناصر الحمض النووي، استنساخ وحدات يتحقق، تيسير توليد التجمعات الكبيرة. وفي إطار جرنجيت، وحدات الحمض النووي تنقسم إلى فئات واو استناداً إلى تسلسل المتراكمة التي تعمل كمحولات ويتم تجميعها في هذا النظام. ولذلك، ينبغي أن تكون كبسولة تفجير تهدف إلى تضخيم المنتج المطلوب وفقا للوحدة النمطية المحددة2 (الشكل 1A). إذا كان هناك داخلية الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةأنا الموقع والتسلسل غير متوافق مع وحدات الإدخال والوجهة جرينجاتي، يمكنك المتابعة دون موتاجينيزينج، ولكن بكفاءة أقل. بدلاً من ذلك، استخدام الطفرات موقع الموجه لإزالة الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةوأنا تقييد مواقع مع الحرص على عدم تغيير الأحماض الأمينية في منتجات الجينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن الحصول على ناقلات ووحدات من المستودع غير هادفة للربح، أدجيني (https://www.addgene.org).

1-الاستنساخ باستخدام جرينجاتي

  1. تصميم كبسولة تفجير باستخدام يتدلى المدرجة في الجدول 1، استبدال 'NNNN' مع وحدة محول نوع خاص تسلسل المدرجة أدناه: إلى الأمام: 5´AACA جتكتك أ NNNN (ن) CA* + 3´ تسلسل معين، عكس: NNNN A جتكتك 5´AACA (n) + عكس تكملة 3´ تسلسل معين. إضافة قواعد المسطرة لضمان الحفاظ على الإطار القراءة.
    يتدلى الوحدة النمطية:
    ملاحظة: في إطار جرينجاتي الافتراضية، ست وحدات، واو، يتم تجميعها مع محطة تحول ناقلات العمود الفقري في تعبير واحد بلازميد (الشكل 1). عادة، سوف المرفأ وحدة بتسلسل منظم، ب-الوحدة الطرفي ن العلامة أو "دمية" تسلسل6، ج نمطية أقراص مدمجة، علامة د-وحدة ج-محطة طرفية أو دمية، ه وحدة المدمر، ووحدة نمطية و كاسيت مقاومة لاختيار المحورة وراثيا النباتات. محول للربط مع وحدات أخرى ستنشئ متوفرة للاستخدام بدلاً من وحدة نمطية و2.
  2. [بكر] تضخيم
    1. تضخيم تسلسل الفائدة مع الإشعال مصممة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقا للبروتوكولات القياسية.
    2. فصل المنتج [بكر] على [اغروس] هلام. المكوس والعمود تطهير الجزء الصحيح باستخدام تجاري كيت (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  3. إنشاء الوحدة النمطية للإدخال
    1. بشكل منفصل هضم متجه الوحدة النمطية ويفتت بكر (الخطوة 1.2.) (الشكل 1 أ، ب) مع منظمة التعاون الاقتصادي31I/Bsaالأول باستخدام 100-500 نانوغرام من الحمض النووي (خط متجه أو جزء) وميليلتر 3 10 × الهضم المخزن المؤقت 5-10 يو الإيكولوجية31I في أنبوب وإحضار وحدة التخزين إلى 30 ميليلتر مع ddH2o.
    2. المزيج بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتدور إلى أسفل بإيجاز في 1,000 س ز. احتضان عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارة لمدة 15 دقيقة (أو بناء على توصية الوقت إنزيم التقييد التي تم شراؤها).
    3. بعد الهضم وتنقية العمود كل عينة باستخدام تجاري كيت (انظر الجدول للمواد)، وتحديد كمية الحمض النووي التي تم الحصول عليها بواسطة تحديد الكثافة البصرية على 260 nm (OD260) باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    4. ميكس نغ 30 – 100 يهضم بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات إدراج وناقل 10 – 50 نانوغرام هضمها واحتضان مع 1 ميليلتر ليجاسى T4 (يو 5/ميليلتر، و 3 ميليلتر 10 × T4 ربط المخزن المؤقت في إجمالي حجم 30 ميليلتر في درجة حرارة الغرفة ح 1 (بناء على توصية المورد ليجاسى T4) (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: حساب متجه الوحدة النمطية: الوجهة إدخال نسبة المولى المطلوبة (مثلاً، 3:1) لربط اعتماداً على تركيز وطول من دخول إدراج وحدة نمطية.
    5. لزيادة كفاءة التحويل، تعطيل الحرارة ليجاسى T4 التي تفرخ رد فعل عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. استخدام المنتج عملية ربط لتحويل المختصة كولاي الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية مختبر وانتشار البكتيريا في لوحات أجار تستكمل مع الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل)
    7. احتضان اللوحة مع البكتيريا في 37 درجة مئوية لبين عشية وضحاها.
    8. الشاشة للمستعمرات مع وحدة الإدخال المطلوب من مستعمرة PCR باستخدام كبسولة تفجير 86A1 (5-جتجتجتجاتجتجاجك-3) و 86A2 (5-جتتتكككاجتكاكجاكج-3) والشروط المعيارية PCR.
      ملاحظة: هذا المزيج التمهيدي صالحة لجميع وحدات الإدخال كما ربط أجهزة الإشعال دخول ناقلات العمود الفقري.
    9. حدد واحدة من مستعمرات لعزل بلازميد. استخدام الثقافة السائل 2 مل رطل وتستكمل مع الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل) واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر 37 درجة مئوية.
    10. بروتوكول والبلازميدات عزل من ثقافة السائل بين عشية وضحاها مع "مجموعة" مصغرة من الإعدادية أو استخراج المطلوب (انظر الجدول للمواد).
    11. تحديد والبلازميدات مع إدراج الصحيح، إجراء تحليل إنزيم التقييد، على سبيل المثال عن طريق تحديد اثنين من الإنزيمات التي تقطع فريد في إدراج الخاص بك عن طريق خلط 200 نانوغرام بلازميد، 2 ميليلتر 10 × الهضم العازلة، يو 5-10 لتحديد تقييد الإنزيمات و ddH2 يا إلى 20 ميليلتر.
    12. التسلسل والبلازميدات المحدد باستخدام كبسولة تفجير 86A1 و 86A2 (راجع الخطوة 1.3.9.).
  4. إنشاء وحدة نمطية الوجهة:
    ملاحظة: بلازميد الوجهة استخدام الوجهة المرغوب فيه الوحدة النمطية pGGZ001 أو pGGZ002 أو pGGZ0032 (الشكل 1).
    1. في أنبوب إضافة ومزيج 50 – 150 نانوغرام ناقل الوجهة فارغة (pGGZ003، على سبيل المثال)، شغل 50-300 نانوغرام لكل وحدة إدخال، 2 ميليلتر 10 × الهضم العازلة العازلة، ميليلتر 1.5 ملم 10 ATP، 1 ميليلتر ليجاسى T4 (يو 30/ميليلتر)، 5-10 ميليلتر يو إيكو31I ودرهم2س لإجمالي حجم 20 ميليلتر.
      ملاحظة: حساب نسبة المولى المطلوب إدخال الوحدة النمطية: الوجهة ناقلات (مثلاً 3:1) لربط اعتماداً على تركيز وطول من دخول إدراج وحدة نمطية.
    2. خلط والقيام برد فعل جرنجيت2 استخدام ثيرموسيكلير بكر التناوب 30 مرة بين 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 16 درجة مئوية لمدة دقيقة 2، تليها خطوات وحيدة لمدة 5 دقائق عند 50 درجة مئوية و 5 دقائق عند 80 درجة مئوية.
    3. إضافة إلى زيادة الكفاءة، 1 ميليلتر ليجاسى T4 (30 U/ميليلتر) وميليلتر 1.5 ملم 10 ATP لرد الفعل واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة، تليها المنظمة الحرارة من T4 الحمض النووي ليجاسى عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. استخدام رد فعل ربط لتحويل المختصة كولاي وتنتشر البكتيريا في لوحات أجار تستكمل مع السبيكتينوميسين عامل انتقائية مناسبة (50 ميكروغرام/مل).
    5. احتضان تحول كولاي على اللوحة في 37 درجة مئوية لبين عشية وضحاها.
    6. تأكيد التحويل، إعادة متتالية كل من المستعمرات واحد المحدد في السبيكتينوميسين (50 ميكروغرام/مل) والامبيسلين (100 ميكروغرام/مل) الذي يحتوي على لوحات، على التوالي. استخدم فقط المستعمرات التي تنمو في السبيكتينوميسين ولكن ليس على لوحات الأمبيسلّين.
    7. احتضان المستعمرات كولاي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    8. حدد واحدة من مستعمرات لعزل بلازميد. استخدام الثقافة السائل 2 مل رطل وتستكمل مع السبيكتينوميسين (50 ميكروغرام/مل) واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر 37 درجة مئوية.
    9. عزل والبلازميدات المقابلة مع "مجموعة" صغيرة الإعدادية (انظر الجدول للمواد).
    10. التحقق من تحليل إنزيم التقييد (انظر 1.3.12). وتحديد تسلسل نيات إيجابية باستخدام كبسولة تفجير 3 88 (5-أككتكتكججكتتكتج-3)، 4 88 (5-ككتتتتاكجتككتج-3). إذا كان لا يمكن أن تكون متسلسلة الإدراج تماما مع هذه الإشعال، تصميم كبسولة تفجير داخلي للتسلسل.
      ملاحظة: لتحديد استنساخ مع العدد الصحيح موسيقى البوب تكرار تسلسل (انظر المناقشة)، في كبسولة تفجير pOp6 (pOp6_F، 5-تجكاتاتجتكجاجكتكاجا-3؛ و pOp6_R، 5-كتاتاتاجاجاججتكت-3) التي تربط في يمكن استخدام اختصار المرافقة متواليات التضخيم بكر والتفريد جل اللاحقة لتميز بالحجم.
  5. إنشاء سوبيرمودولي المتوسطة
    1. للجمع بين مجموعتين من مجموعات مستقلة من وحدات الإدخال، كما هو مطلوب لتوليد الموارد الوراثية-LhG4 سائق الخطوط مع كاسيت المستجيب مراسل المتكاملة، أول بناء اثنين الوسيطة والبلازميدات، يسمى سوبيرمودوليس2، قبل تجميع التعبير النهائي بلازميد في pGGZ001 أو pGGZ003.
    2. تأكد من إضافة محول F-H في نهاية سوبيرمودولي الأول ومحول H-A في بداية سوبيرمودولي الثانية (تلك التي تخدم كاتصالات بين اثنين بنيات) ك وصف2.
      ملاحظة: فقط وحدة الوسيطة pGGN000 يحمل كاسيت المقاومة. لتوليد بلازميد التعبير، القيام برد فعل جرينجاتي مع ناقل الوجهة والمتوسطة pGGN000 و pGGM000 سوبيرمودوليس. وبدلاً من ذلك، مزيج من ناقل الوجهة، pGGN000 سوبيرمودولي المتوسطة، والوحدات الوحيدة المتبقية القيام برد فعل جرنجيت2. الأسلوب الأخير هو أقل كفاءة من السابق ولكن يمكن أن يكون أسرع.
    3. لإنشاء سوبيرمودولي pGGM000/pGGN000، خلط 1.5 ميليلتر (100-300 نانوغرام/ميليلتر) لكل من وحدات الإدخال مع 1 ميليلتر (30 نانوغرام/ميليلتر) فارغة وسيط ناقل (pGGM000 أو pGGN000)، والهضم المخزن المؤقت 10 x ميليلتر 2، ميليلتر 1.5 ملم 10 ATP، 1 ميليلتر ليجاسى T4 (30 U/ميليلتر) ، و 5-10 يو الإيكولوجية31I في إجمالي حجم 20 ميليلتر.
      ملاحظة: حساب متجه الوحدة النمطية: الوجهة إدخال نسبة المولى المطلوبة (مثلاً، 3:1) لربط اعتماداً على تركيز وطول من إدراج وحدة الإدخال
    4. خلط والقيام برد فعل جرينجاتي كما في الخطوة 1.4.2
    5. إضافة إلى زيادة الكفاءة، 1 ميليلتر ليجاسى T4 و 1.5 ميليلتر ATP (10 ملم)، واحتضان ح 1 في درجة حرارة الغرفة، متبوعاً بالحرارة-المنظمة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. استخدام 10 ميليلتر من رد فعل ربط تحويل المختصة كولاي والانتصارات في لوحات تتضمن كاناميسين (50 ميكروغرام/مل).
    7. أداء الحضانة بين عشية وضحاها لتحول كولاي على لوحة عند 37 درجة مئوية.
    8. إعادة متتالية كل المستعمرات واحدة مختارة في كاناميسين (50 ميكروغرام/مل) والامبيسلين (100 ميكروغرام/مل) الذي يحتوي على لوحات، على التوالي.
    9. أداء الحضانة بين عشية وضحاها من المستعمرات كولاي على لوحة عند 37 درجة مئوية.
    10. حدد واحدة من المستعمرات التي تنمو على كاناميسين فقط ولكن ليس على الأمبيسلّين لعزل بلازميد. استخدام الثقافة السائل 2 مل رطل وتستكمل مع كاناميسين (50 ميكروغرام/مل) واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر 37 درجة مئوية.
    11. عزل والبلازميدات المقابلة الإعدادية المصغر باستخدام كيت (انظر الجدول للمواد).
    12. التحقق من البلازميدات بتحليل إنزيم التقييد (انظر 1.3.12). وتأكيد بالتسلسل باستخدام كبسولة تفجير 87E2 (5´-أجكاتكااكتاجكاجاج-3´) و 87E3 (5´-كجتتكككجتجاتاتجك-3´) الصلب إلى العمود الفقري pGGM000/pGGN000. إذا كان لا يمكن أن تكون متسلسلة الإدراج تماما مع هذه الإشعال، تصميم كبسولة تفجير داخلي للتسلسل.
      ملاحظة: إذا لم تنجح الاستنساخ في ناقلات pGGM000 أو pGGN000، هو أحد الحلول الممكنة هضم pGGM000 أو pGGN000 مع منظمة التعاون الاقتصادي31I وتشغيل على جل وتنقية من الهلام الجزء العمود الفقري (حوالي 2000 bp) pGGM000 أو pGGN000 دون كاسيت ككدب (حوالي 1400 bp). ثم تمضي عادة برد فعل عملية ربط.
  6. تحول سلالة A. tumefaciens بسوب+ (مثل بورصة عمان)، أصل بسا النسخ المتماثل (أوري ألف tum.) في ناقلات الوجهة تتطلب وجود بسوب بلازميد مساعد12. متواصلة من البكتيريا على ألواح رطل المحتوية على كلورامفينيكول (34 ميكروغرام/مل)، كاناميسين (50 ميكروغرام/مل)، بالسبيكتينوميسين (50 ميكروغرام/مل) والتتراسيكلين (12.5 ميكروغرام/مل). احتضان تحول A. tumefaciens على اللوحة في حاضنة 28 درجة مئوية لمدة يومين أو ثلاثة أيام.

2-جيل من نبات من النباتات المعدلة وراثيا

  1. التحول من التمويل نبات.
    ملاحظة: تحويل محطات التمويل (أ) ذكرت تشانغ et al., 200613.
  2. اختيار الخطوط المعدلة وراثيا.
    1. لتحديد النباتات المحولة، استخدام نظام التحديد المستخدمة في جابي-كات14 للمقاومة إلى السلفاديازين15.
    2. لتحديد خطوط مستقرة مع حدث دمج واحد ممكن، اختر تلك في توليد T2، تبين أن نسبة الفصل 3:1 في علامة المقاومة. تنتشر هذه الخطوط إلى جيل T3 وتحديد النباتات متماثل للجينات المقاومة. وبدلاً من ذلك، إجراء تحليل "لطخة جنوبي" أو قياسية كمية في الوقت الحقيقي بكر (SA-qPCR)16 لتحديد خطوط الإدراج واحد.

3-تحريض ترانس-التنشيط في نبات السائق خطوط

  1. الجذر
    1. لاختبار تعبير مراسل في التمويل (أ) سائق الخطوط التي تم إنشاؤها من خلال الخطوات 1 و 2 من تعقيم البذور كما هو موضح أدناه.
      1. إضافة 0.5-1.0 مل من 70% إيثانول + 0.01 ٪ المنظفات غير الأيونية للبذور حوالي 100 (20 ملغ) في أنبوب رد فعل 1.5 مل وعكس الأنبوبة عدة مرات. تدور إلى أسفل في 1000 غ س 15 ق و aspirate المادة طافية.
      2. إضافة 0.5-1.0 مل إيثانول المطلقة. قلب الأنبوبة عدة مرات، وزيادة ونقصان لأسفل ل 1,000 x ز 15 s وتجاهل المادة طافية.
      3. إضافة 0.5-1.0 مل إيثانول مطلقة وعكس تي أنبوب بضع مرات، تدور ثم إلى أسفل في س 1,000 ز 15 s وتجاهل المادة طافية.
      4. تسمح للبذور الجافة داخل غطاء محرك السيارة. إذا سوف تكون طبقات في أنابيب البذور تابع مع الخطوة 3.1.1.6.
      5. إضافة 0.5-1.0 مل من الماء المعقم وعكس الأنبوبة عدة مرات. تدور إلى أسفل في 1,000 س ز 15 s وتجاهل المادة طافية.
      6. إضافة 0.5-1.0 مل من الماء المعقم وعكس الأنبوبة عدة مرات. تدور إلى أسفل في 1,000 س ز 15 s وتجاهل المادة طافية.
      7. إضافة 0.5-1.0 مل الماء المعقم.
    2. إعداد نصف قوامها Murashige وسكوغ متوسطة، درجة الحموضة 5.8 وإضافة السكروز أجار و 1% مصنع 0.9 في المائة. بعد إضافة التعقيم الديكساميتازون (Dex)، حلت في [دمس]، إلى تركيز نهائي 10-30 ميكرومتر إلى لوحات تعريفية ومبلغ مساو من [دمس] إلى لوحات التحكم، على التوالي.
    3. وضع بذور لتصوير الجذر على لوحات والتجهيزه لهم عن 48 ساعة في الظلام والبرد (4 درجات مئوية).
    4. وضع لوحات في وضع عمودي في حاضنة نبات (يوم طويل 16/8 (ح)، 22 درجة مئوية، والرطوبة، 65%) وزراعتها لمدة خمسة أيام.
    5. خمسة أيام بعد الإنبات (همرشولد)، صورة الشتلات باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري.
  2. الجذعية
    1. تعقيم البذور كما هو موضح في 2.1.1. ووضع بذور ½ مرض التصلب العصبي المتعدد واجار مصنع 0.9% ولوحات السكروز 1%. التجهيزة عن 48 ساعة في الظلام والبرد (4 درجات مئوية).
    2. ستة إلى سبعة أيام بعد الإنبات، نقل الشتلات التربة، كل مصنع في وعاء واحد (يوم 16/8 (ح)، 22 درجة مئوية، والرطوبة، 65% من طويل).
    3. حمل ترانس-التنشيط في ينبع بسقي مع الحل صورية أو التنفيذ المباشر، أو بغمس النباتات في التنفيذ المباشر أو حلول وهمية، على التوالي.
    4. للري، استخدام حل التنفيذ المباشر 25 ميكرومتر في المياه التي أعدت من مخزون من 25 مم التنفيذ المباشر الذائبة في الإيثانول. المياه كل 2-3 أيام حتى الوقت المطلوب للاستقراء.
    5. غمس، تحضير كوب ل 1، 750 مل مياه التي تحتوي على 0.02% سيلويت L-77 مع 25 ميكرومتر من التنفيذ المباشر أو ما يعادلها من [دمس] للتنفيذ المباشر والعلاج الوهمي، على التوالي. تراجع معامل واحد لمدة 30 ق في استحثاث أو الحل صورية. كرر كل 2-3 أيام حتى الوقت المطلوب للتصوير.
      ملاحظة: بعد الغمس، النباتات ينبغي الاحتفاظ بالرطوبة العالية لمدة ساعة واحدة.
  3. تبادل لإطلاق النار قمية أرض (SAM)
    1. تعقيم البذور كما هو موضح في 2.1.1. إعداد لوحات مع ½ مرض التصلب العصبي المتعدد واجار مصنع 0.9% والمتوسطة السكروز 1% ووضع البذور على لوحات. تخزين اللوحات لمدة يومين في الظلام والبرد للتقسيم الطبقي.
    2. وضع لوحات في وضع عمودي في حاضنة مصنع. ستة إلى سبعة أيام بعد الإنبات، نقل الشتلات بالتربة، وكل مصنع في وعاء واحد (يوم 16/8 (ح)، 22 درجة مئوية، والرطوبة، 65% من طويل).
    3. عندما تنبع حوالي 1 سم طويلة (25-30 همرشولد)، رش نورات سام مع 10-50 ميكرون التنفيذ المباشر في ح20 ارتداء قناع لوجه. للاستقراء والتصوير في مراحل لاحقة من التطور، حمل سامز ينبع أطول أو يطلق النار على الجانب.
      ملاحظة: يمكن أيضا أن يكون سامز الناجمة عن باينتبروشينج الحل التنفيذ المباشر لمنع قطرات الرذاذ. استخدام قناع عندما يتم تطبيق التنفيذ المباشر عن طريق الرش.
    4. تشريح بعثات ح 24-48 بعد التعريفي، والمضي قدما للتصوير (انظر 4.3).
      ملاحظة: استخدمت فقط من النباتات غير العمدي للنشر لتقليل الاحتمالية لإسكات الجينات. واستخدمت النباتات في T2/T3 للتصوير.

4-التصوير التعبير مراسل في نبات السائق خطوط.

  1. الجذر
    1. نقل الشتلات من اللوحة إلى حل (PI) يوديد propidium ميكروغرام/مل 10 ومكافحة وصمة عار لمدة 5 دقائق.
    2. وضع الجذور في مجهر التصوير الدائرة (دائرة زراعة الأنسجة 1-جيدا في تغطية الزجاج الثاني، انظر الجدول للمواد) وصورة لها باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر مع 63 × الهدف غمر المياه (انظر الجدول للمواد).
    3. لتصور الأسفار PI، استخدم الطول موجي إثارة للانبعاثات 488 نانومتر وجمع بين 590 و 660 شمال البحر الأبيض المتوسط. MTurquoise2 fluorescence استخدام 458 نانومتر الإثارة وجمع الانبعاثات بين 460 و 615 نانومتر.
  2. الجذعية
    1. أداء اليد أفقية قطع أجزاء من مصنع ينبع مع شفرة حلاقة، نسق جزء من حوالي 3 سم. الإصلاح تنبع بالإصبع على الجانب المعاكس للقسم المطلوب قطع. إجراء العديد من التخفيضات غرامة تسلسلياً ولكن لاحظ أنه ينبغي مقارنة المقاطع فقط من موقف مماثل في الساق.
    2. بعد كل قص وتزج ريزربليد في طبق بتري يحتوي على مياه الحنفية وجمع المقاطع الجذعية. وصمة عار المقاطع عند هذه النقطة أو جبل مباشرة على شرائح المجهر.
    3. لتلوين، تعد من 1 مل من 250 ميكروغرام/مل من محلول PI من الماء في طبق بتري صغيرة (انظر الجدول للمواد). تزج الفروع لمدة 5 دقائق، وشطف لهم في المياه. نقلها إلى شرائح المجهر مع الملقط غرامة أو فرشاة طلاء غرامة. الحرص على عدم ضغط العينات مع ساترة.
    4. صورة العينات باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر مع 25 x غمس عدسة غمر المياه (انظر الجدول للمواد). استخدام 561 نانومتر الليزر تثير PI الأسفار وجمع من 570 إلى 620 نانومتر. استخدام 405 نانومتر لإثارة المستجيب فلوروفوري mTurquoise2 المشفرة بواسطة برنامج تشغيل الخط بنيات وجمع الانبعاثات من 425 إلى 475 نيوتن متر.
  3. إطلاق النار على أرض قمية
    1. قطع الجذع 2 سم تحت الحافة تبادل لإطلاق النار مع الملقط. عقد الجذعية في يد واحدة واستخدام الملقط غرامة لإزالة براعم الزهور وبريمورديا كبيرة. لإزالة بريمورديا الشباب، إصلاح SAM في وضع رأسي في طبق بتري يحتوي على 3% [اغروس]. استخدام مجهر والملقط لإزالة primordia الشباب قريبة من SAM. بدلاً من ذلك، استخدم قنية حقن (انظر الجدول للمواد) لقطع هذه بريمورديا.
    2. وصمة عار سام تشريح في حل 250 ميكروغرام/مل بي 5-10 دقيقة إجراء تلطيخ أما مباشرة بواسطة بيبيتينج بضع قطرات من تلطيخ الحل على رأس سام استعداد أو نقل العينة إلى أنبوب مليء تلطيخ الحل. الاحتفاظ سام مغمورة تماما أثناء الإجراء المصبوغة.
    3. ضع سام الملون إلى طبق بتري صغيرة (انظر الجدول للمواد) مع 3% [اغروس] متوسطة وتغطي SAM مع ddH2o.
    4. صورة تشريح سامز استخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر مجهزة 25 x غمس عدسة غمر المياه (انظر الجدول للمواد).
    5. استخدام 561 نانومتر الليزر تثير PI الأسفار وجمع من 570 إلى 620 نانومتر. استخدام 405 نانومتر لإثارة mTurquoise2 فلوروفوري وجمع الانبعاثات من 425 إلى 475 نيوتن متر.
      سجل رصات الصور التي تغطي 50 ميكرومتر في الاتجاه z مع حجم خطوة 0.5 ميكرومتر.
      ملاحظة: يتطلب سام التصوير كما هو موضح هنا ليزر [كنفوكل] تستقيم المسح مجهر وعدسة (هنا، مياه غمس العدسة) مع المسافة العمل منذ فترة طويلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جيل خطوط السائق والمستجيب عن طريق الاستنساخ جرنجيت

جرينجاتي استنساخ نظام يستند إلى GoldenGate الاستنساخ واستخدام endonuclease تقييد IIS نوع جيش صرب البوسنةأنا أو ما إيسوشيزومير إيكو31I. كما يمكن أن يكون يتدلى تنتج إنزيم بعيدة من موقعها على الاعتراف غير المتناظر، تكوين قاعدة من يتدلى بحرية تشكيل المختار، الذي هو الأساس نمطية للنظام. ويتم إدراج كل عنصر ولدت بكر، على سبيل المثال، تسلسل منظم أو الأقراص المدمجة أو المنهي، أولاً ناقل إدخال معينة مع مطابقة يتدلى الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تصف الخطوات الضرورية لإنشاء وتطبيق مجموعة أدوات متنوعة وشاملة لنوع الخلية إيندوسيبلي، محددة ترانس-التنشيط. عبور خطوط تحمل أشرطة الكاسيت المستجيب تحت سيطرة المروج البوب مع خطوط برنامج تشغيل يسمح لدراسة آثار سوء التعبير في الجيل F1، تمكين التقييم السريع لاضطراب الوراثية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. وبدلاً من ذلك، المستجيب بنيات يمكن استخدامها لتحويل خطوط برنامج التشغيل، أو بتكييف استراتيجية الاستنساخ وسائق والمستجيب بناء يمكن أيضا أن يقترن في تي-دنا واحد. تطبيقات لهذا النظام وتتراوح مكانياً ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عمل في مختبراتنا معتمد من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) منح WO 1660/6-1 (إلى جنوب غرب) و "الموارد الوراثية" 2104/4-1 (إلى آثاريا) و SFB1101 (إلى آثاريا و J.U.L) ومجلس البحوث الأوروبي منح consolidator (بلانتستيمس 647148) إلى آثاريا  جنوب غرب معتمد من خلال "الزمالة إيمي نويثر" من DFG من خلال منحة WO 1660/2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.1
ATPSigma-AldrichA9187
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
تنقية العمودQiagenQIAquick PCR Purification Kit (250)
غرفة الثقافة للتصويرSarstedt AG & Co. غرفةزراعة الأنسجة KG 1 بئر ، على غطاء زجاجي II
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD4903
DMSOفيشر العلمي ، المملكة المتحدةD139-1
Eco< / em>31Iقنية حقن Thermo Fisher ScientificFD0294
(0.30 × 12 مم ، 30 جم × 1/2)Sterican ، Braun
KanamycinCarl Roth GmbH + Co. KGT832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO لامدا الأزرق 63x الغمر المائي objectivLeica, Wetzlar, Germany
MS mediumDuchefa, Haarlem, NetherlandsM0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA هدف الغمر في الماءنيكون ، ميناتو ، طوكيو ، اليابان
طبق بتري 35/10 ملمGreiner Bio-One GmbH ، ألمانيا627102
طبق بتري 60/150 ملمGreiner Bio-One GmbH ، ألمانيا628102
طبق بتري 120/120/17Greiner Bio-One GmbH ، ألمانيا688102
أجار مصنعدوشيفا ، هارلم ، هولنداP1001
استخراج البلازميدQiagenQIAprep Spin Miniprep
Kit بروبيديوم يوديد (PI)Sigma-AldrichP4170
Razorbladeكلاسيك ، Wilkinson Sword GmbH7005115E
أنابيب التفاعلSarstedt AG & Co. KG72.690.001
Silwet L-77Kurt Obermeier GmbH & Co. KG ، باد بيرلبورغ ، ألمانيا
SpectinomycinAppliChem GmbH3834.001
مقياس الطيفالضوئي الحراري فيشر ScientificNanoDrop 2000c
السكروزكارل روث GmbH + Co. KG4621.1
SulfadiazineSigma-AldrichS6387
TetracyclineAppliChem GmbH2228.0025
T4 Ligase 5 U/µ ؛ لثيرمو فيشر العلميEL0011
T4 Ligase 30 U/µ ؛ لثيرمو فيشر العلميEL0013

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
  2. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  3. Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
  4. Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
  5. Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
  6. Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
  7. Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
  8. Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
  9. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
  10. Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
  11. Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
  12. Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
  13. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
  14. Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
  15. GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
  16. Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489(2013).
  17. Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
  18. Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
  19. Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
  20. Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
  21. Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9(2005).
  22. Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
  23. Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LhGR GreenGate

مقالات ذات صلة