الجانب التقني من التوليف الآلي والتقييم الحركي في الوقت الحقيقي من [11C] SNAP-7941

Chrysoula Vraka; Verena Pichler; Sarah Pfaff; Theresa Balber; Marcus Hacker; Markus Mitterhauser; Wolfgang Wadsak; Cecile Philippe

doi:10.3791/59557

مقالة منهجية

الجانب التقني من التوليف الآلي والتقييم الحركي في الوقت الحقيقي من [¹¹C] SNAP-7941

DOI:

10.3791/59557

⸱

أبريل 28, 2019

Chrysoula Vraka¹ , Verena Pichler¹ , Sarah Pfaff¹ , Theresa Balber¹^,² , Marcus Hacker¹ , Markus Mitterhauser¹^,³ , Wolfgang Wadsak¹^,⁴ , Cecile Philippe¹

¹Department of Biomedical Imaging and Image-guided Therapy, Division of Nuclear Medicine, Medical University of Vienna, ²Department for Pharmaceutical Technology and Biopharmaceutics, Faculty of Life Sciences, University of Vienna, ³Ludwig Boltzmann Institute Applied Diagnostics, ⁴CBmed GmbH - Center for Biomarker Research in Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن نمثل بروتوكولا لوضع العلامات الإشعاعية مؤتمتة بالكامل من [¹¹C] SNAP-7941 وتحليل الحركية في الوقت الحقيقي من هذا PET-التتبع على P-GP التعبير عن الخلايا وعدم التعبير.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) هو تقنية تصوير جزيئية أساسية توفر رؤى في المسارات وتستخدم الأربطة الإشعاعية المستهدفة المحددة للتحقيقات في الجسم الحي. ضمن هذا البروتوكول, يتم وصف التمثيل الإشعاعي قوية وموثوق بها للتحكم عن بعد من [¹¹C] SNAP-7941, خصم لمستقبلات هرمون تركيز الميلانين 1. يبدأ التركيب الإشعاعي مع السيكلوترون المنتجة [¹¹C] CO₂ التي يتم في وقت لاحق مزيد من رد الفعل عبر انتقال مرحلة الغاز إلى [¹¹C] CH₃OTf. ثم، يتم إدخال هذا الوسيط التفاعلي إلى محلول السلائف ويشكل المتتبع الإشعاعي المعني. يتم تحديد المواد الكيميائية وكذلك النقاء الكيميائي الإشعاعي عن طريق RP-HPLC، التي تنفذ بشكل روتيني في عملية مراقبة الجودة الصيدلانية الإشعاعية. بالإضافة إلى ذلك، يتم حساب النشاط المولي كما هو ضرورة للتحقيقات الحركية في الوقت الحقيقي التالية. وعلاوة على ذلك، يتم تطبيق [¹¹C] SNAP-7941 على خلايا MDCKII-WT وMDCKII-hMDR1 لتقييم تأثير التعبير عن البروتين السكري (P-gp) على تراكم الخلايا. لهذا السبب، يتم استخدام خط الخلية التعبير عن P-GP (MDCKII-hMDR1) إما دون أو مع حظر قبل التجارب عن طريق الركيزة P-GP (±)-verapamil وتقارن النتائج لتلك التي لوحظت لخلايا النوع البري. ويبين النهج التجريبي العام أهمية الإدارة الدقيقة للوقت التي تعتبر أساسية لكل دراسة قبل السريرية والسريرية باستخدام أجهزة تتبع PET ذات العلامات الإشعاعية مع النويدات قصيرة الأجل، مثل الكربون-11 (نصف العمر: 20 دقيقة).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

^[11جيم] وقد تطورت SNAP-7941 كأول التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)-التتبع التي تستهدف مستقبلات هرمون تركيز الميلانين 1 (MCHR1) - مستقبلات تشارك أساسا في التنظيم المركزي للشهية ولتناول الطعام¹. الكربون-11 وضع العلامات من SNAP-7941، وهو خصم MCHR1 تتميز بشكلجيد، أسفرت عن أصيلة PET-التتبع 2،^3،^4،^5. ومع ذلك، فإن التركيب الإشعاعي الآلي بالكامل يشكل تحديا ً كبيراً من حيث فعالية الوقت وقابلية التكرار مع النويدات المشعة القصيرة الأجل الكربون-11 التي تقدم نصف عمر 20 دقيقة⁶. وينبغي الإبقاء على الوقت الإجمالي للتوليف عند الحد الأدنى، وكقاعدة عامة ينبغي ألا يتجاوز نصف العمر 2-3 (أي حوالي 40-60 دقيقة بالنسبة للكربون -11)⁷. وعلى وجه الخصوص، يجب تحسين إجراءات التوليف للتتبعات الراديوية التي تستهدف أنظمة المستقبلات ذات الكثافات المنخفضة للتعبير على نطاق واسع للحصول على غلة كافية وبالتالي ارتفاع النشاط المولي⁸. يتبع الاستراتيجية اصطناعيّة غالبا النويدات إشعاعيّة إنتاج ضمن [سكلوترون] وإطلاق من [¹¹[ك][ك]₂ إلى المزج. هناك، يتم تخفيض [¹¹C] CO₂ أولا إلى [¹¹C] CH₄ وتتفاعل في وقت لاحق مع اليود لإنتاج [¹¹C] CH₃I عن طريق طريقة مرحلة الغاز⁹^،¹⁰. مزيد من العلاج مع الغلة ترفلات الفضة [¹¹C] CH₃OTf مباشرة على الخط. وبعد ذلك، يُدخل هذا الكربون -11 المتفاعل المُصنّع على المتوسط في محلول يحتوي على جزيء السلائف. بالإضافة إلى ذلك، ينطوي التركيب الإشعاعي الآلي على عملية تنقية مع RP-HPLC شبه مُسبق، بما في ذلك التركيبة اللاحقة للمنتج المناسب للدراسات ما قبل السريرية والسريرية.

بغض النظر عن نصف عمر النويدات المشعة والجهد الزمني للتركيب الإشعاعي، فإن الدوائية للأدوية الإشعاعية هي الجزء الأكثر أهمية الذي يجب تقييمه أثناء تطوير PET-التتبع. من حيث التصوير العصبي، دخول الدماغ من PET-التتبع هو الشرط الأساسي. ومع ذلك، فإن حاجز الدم في الدماغ (BBB)، وهو "الحدود الأمنية" للدماغ، يعبر بشدة عن ناقلات efflux التي يمكن تفريغ جزيئات صغيرة (على سبيل المثال، PET-tracers) وتعوق بكفاءة إمكانية تطبيقها.

عيب كبير خلال التقييم قبل السريرية هي تفاعلات غير متوقعة نحو هذه الناقلين efflux، والتي غالبا ما تكون غير معترف بها في التجارب المختبرية ويؤدي إلى فشل PET-التتبع في الجسم الحي، كما لوحظ ل [¹¹C] SNAP-7941. أظهر التصوير في الفئران انخفاض تراكم الدماغ، والتي زادت بشكل كبير بعد إعطاء مثبط P-GP tariquidar¹¹. وتشير هذه البيانات إلى أن [¹¹C] SNAP-7941 هو الركيزة من هذا النظام الناقل efflux عرقلة ربط ligand المركزية MCHR1. لسوء الحظ، لا يزال هناك نقص في النماذج الكافية في المختبر مما يتيح التنبؤ باختراق BBB في مرحلة مبكرة من تطوير التتبع.

هنا، ونحن نصف التوليف الآلي من [¹¹C] SNAP-7941 باستخدام المزج لميثيلات الكربون-11. وينصب تركيز هذا العمل على تقديم لمحة عامة عن كيفية تنظيم نهج تجريبي متعاقب، بما في ذلك التوليف الآلي، ومراقبة الجودة، فضلا عن التقييم المتتالي في المختبر مع النويدات الكربونية -11 القصيرة الأجل جدا.

أولاً، يتم وصف الخطوات الرئيسية لنجاح التركيب الإشعاعي مع الحد الأدنى من النفقات الزمنية والغلة القصوى. ثم، يتم إعداد إجراء مراقبة الجودة موثوق بها مما يجعل المتتبع الإشعاعي المتاحة للدراسات السريرية المحتملة وتلبية معايير دستور الأدوية الأوروبي¹². والتحديد الكمي لتركيز الأضراس وحساب النشاط المولي المعني هو شرط أساسي للقياسات الحركية المتعاقبة.

وأخيرا، يتم تقديم طريقة جديدة ومباشرة في المختبر تقييم [¹¹C] SNAP-7941 التفاعلات نحو الناقل efflux، P-GP (hMDR1). يستخدم النموذج الحركي المقترح جهازًا سهل المقبض يسمح بتفسير فوري للبيانات ويتطلب الحد الأدنى من جهد زراعة الخلايا¹³.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحذير: في البروتوكول التالي هي خطوات متعددة المتضمنة التي تتطلب التعامل مع النشاط الإشعاعي ومعالجته. ومن المهم أن تتفق كل خطوة مع إدارة السلامة الإشعاعية التابعة للمعهد والهيئة التشريعية الوطنية المعنية. ومن الإلزامي التقليل إلى أدنى حد من التعرض للإشعاع المؤين للمشغلين المعنيين وفقا لمبدأ ALARA ("أقل قدر من المعقول يمكن تحقيقه").

1 - إدارة الوقت والتخطيط للتجربة

ملاحظة: يتطلب نصف العمر القصير للكربون-11 إدارة زمنية دقيقة لتقليلفقدان النشاط الإشعاعي (الشكل 1). ومن المهم أن يعرف أي شخص معني مجال مسؤوليته ونقطة العمل. لإعداد تجربة حركية في الوقت الحقيقي من [¹¹C] SNAP-7941، حوالي أربعة أشخاص ضرورية لعملية سلسة.

تنظيم منتج ل [¹¹C] SNAP-7941.
إعلام مشغل مراقبة الجودة الذي يقوم بتقييم المواصفات، وحساب التركيز الكتلي والنشاط المولي لوقت بدء التوليف.
عقد في الوقت الحقيقي اختبار الحركية جاهزة لحساب التخفيف وإجراء التجربة.
إرشاد عداءلنقل النشاط الإشعاعي إلى المكان المعني في نقطة زمنية ذات الصلة.

2- التوليف الآلي لـ [¹¹C] SNAP-7941 للاستخدام قبل السريري

إنتاج السيكلوترون [¹¹C] CO₂
ملاحظة: تُجرى الخطوات 2-2-1-2-2-4 في وقت واحد لإعداد وحدة التركيب الإشعاعي (انظر أيضاً الشكل1).
1. تشغيل المغناطيس من السيكلوترون.
2. حدد الهدف ¹¹C-CO₂ وبدء شعاع 65 درجة مئوية.
3. تأكيد بداية التشعيع عن طريق الضغط على زر بدء التشعيع
4. إيقاف شعاع وتأكيد إطلاق النشاط الإشعاعي في المزج عن طريق الضغط على زر التسليم، بعد أن يتم الوصول إلى الكمية المطلوبة من النشاط الإشعاعي (حوالي 120 GBq بعد 30 دقيقة).
تنفيذ التركيب الإشعاعي الآلي بالكامل
1. تأكد من أن النظام جاهز لتلقي النشاط الإشعاعي وبدء العملية التلقائية
2. مراقبة العملية التلقائية التالية.
  1. تحقق مما إذا كان^[11C]CO₂ يتم نقله تلقائيًا من السيكلوترون إلى وحدة التوليف عبر V26 (حوالي 4 دقائق) وأن^[11C]CO₂ محاصر على المنخل الجزيئي المشرب بالنيكل كعامل حفاز ([ ¹¹ C] CO₂ فخ) في درجة حرارة الغرفة.
  2. تتبع إذا كان^[11C]CO₂ فخ هو مسح تلقائيا أولا مع الهليوم (50 مل · دقيقة^-1)ثم مع غاز الهيدروجين (120 مل · دقيقة^-1). ثم لاحظ أن V27 و V25 مغلقان والمحاصرين [¹¹C] CO₂ بما في ذلك غاز الهيدروجين يتم تسخينها إلى 400 درجة مئوية وأن شكلت [¹¹C] CH₄ يتم نقلها كذلك إلى ما قبل تبريد [¹¹C] CH₄فخ ومحاصرين هناك.
  3. رصد أن V10 مغلقة، فتح V9 (نحو عمود اليود) و [¹¹C] CH₄ مرة أخرى عن طريق تسخين [¹¹C] CH₄ فخ ببطء إلى 80 درجة مئوية ونقلها إلى وحدة الدورة الدموية مع تيار الهليوم عن طريق V10 (خروج العادم). وتحقق كذلك إذا تم تحويل [¹¹C] CH₄ إلى [¹¹C] CH₃I داخل وحدة الدورة الدموية، والتي تستمر لمدة 3 دقائق تقريبا وشكلت [¹¹C] CH₃أنا محاصرباستمرار على [¹¹C] CH₃أنا فخ.
  4. تأكد من فتح صمام العادم V16 ويتم تسخين^[11C]CH₃I فخ إلى 90 درجة مئوية مع تيار من الهليوم (20 مل · دقيقة^-1)عبر V24. بموجب هذا، تتم إزالة المنتجات الثانوية المحتملة ثم يتم إغلاق V16.
3. تأكد من أن [¹¹C] CH₃أنا على استعداد للإفراج عنها في المفاعل.
4. مراقبة العملية الآلية التالية: تحقق مما إذا كان^[11C]CH₃I فخ ساخنة إلى 190 درجة مئوية وشكلت [¹¹C] CH₃أنا صدر في المفاعل عن طريق [¹¹C] CH₃OTf فخ (V32 و V33، لا يزال في 200 ° C)، V7، وV8 تحت تيار الهليوم المستمر (10-25 مل · دقيقة^-1،V24). أثناء هذه العملية، يجب أن يكون V21 و V23 (خروج العادم) مفتوحين.
5. تأكد من أن النشاط الإشعاعي وصل إلى المفاعل، بمجرد أن كمية النشاط الإشعاعي في المفاعل لم تعد تُرفع.
6. رصد العملية الآلية التالية والتحضير للتدخل اليدوي، إذا لزم الأمر
  1. تحقق مما إذا كان V23 وV21 وV8 مغلقًا تلقائيًا ويتم تسخين خليط التفاعل إلى 75 درجة مئوية. بعد 3 دقائق، لاحظ إذا تم تبريد المفاعل مع النيتروجين السائل حتى درجة الحرارة أقل من 35 درجة مئوية. في وقت لاحق، تأكد من أن يتم تبريد خليط التفاعل مع 1.5 مل من الماء عبر V2. أثناء هذه العملية، يجب أن يكون V21 و V23 (خروج العادم) مفتوحين.
  2. تتبع إذا تم إغلاق V21 و V23 ويتم نقل خليط التفاعل إلى صمام حقن HPLC عن طريق المرور من خلال كاشف السوائل في حلقة HPLC (5 مل). تتبع إذا تم حقن خليط التفاعل تلقائيا على العمود HPLC.
7. مراقبة الكروماتوغرام وقطع يدويا ذروة المنتج عن طريق زر بدء الذروة. اضغط على نهاية الذروة عندما تنخفض إشارة ذروة المنتج إلى أقل من 400 cps تقريبا بعد وقت الاحتفاظ من حوالي 8-10 دقيقة (تدفق: 5 مل · دقيقة^-1، الشكل 3).
8. تشغيل تيار الهليوم إضافية لتسريع تفريغ لمبة.
9. مراقبة ما إذا كان المصباح هو إفراغ ومراقبة زجاجة النفايات: تحقق ما إذا كان يتم إفراغ المصباح عبر V11، خرطوشة SPE وV12 في النفايات مع تيار الهليوم عبر V19 وخط الهليوم إضافية وإذا كان المنتج يحتفظ على خرطوشة SPE.
10. تأكد من أن المصباح فارغ تماما.
11. رصد العملية الآلية لتنقية SPE ونقل المنتجات
  1. تحقق مما إذا كانت خرطوشة SPE مغسولة بـ 10 مل من الماء عبر V6 وV11 وV12 في النفايات وإذا كان الإيثانول يُدخل المنتج في PCV عبر V5 وV11 وV12. وأخيرا، لاحظ إذا تم إضافة 0.9٪ NaCl في PCV عبر V4، V11 و V12 لتخفيف المنتج.
  2. تأكد من نقل حل المنتج عبر V13 وفلتر معقم في قارورة المنتج النهائي مع تيار الهليوم عبر V20.
12. تأكد من أن المنتج قد تم نقله بالكامل.

3. مراقبة الجودة (مراقبة الجودة)

ملاحظة: تشمل مراقبة جودة المستحضرات الصيدلانية الإشعاعية قياس البارامترات التالية:

النقاء الكيميائي الإشعاعي والنشاط المولي (RP-HPLC)
المذيبات المتبقية (الكروماتوغرافيا الغازية، GC)
الذبول (ضغط البخار مقياس التناضح)
درجة الحموضة (درجة الحموضة متر)
γ الطيف / النويدات المشعة النقاء (γ-مطياف)
نقاء نصف العمر/النويدات المشعة (معايرة الجرعة)

يتم تحديد جميع المعلمات الفيزيائية والكيميائية قبل إطلاق المنتج ويجب أن تكون القيم في نطاق معلمات الجودة المحددة.

إعداد معدات مراقبة الجودة
1. بدء التحضير قبل 30 دقيقة من نهاية التوليف.
2. إعداد قارورة مخروطية في حاوية واقية من الرصاص وحقنة محمية 1 مل مع إبرة مرفقة.
3. إعداد حل قياسي مرجعي من SNAP-7941 (10 μg·mL^-1)في الماء لHPLC.
4. تشغيل مقياس الحموضة، والكروماتوجراف الغاز والغازات المستخدمة، ومقياس الأوسمومتر وجميع مكونات HPLC.
5. تشغيل برنامج التحكم HPLC وحدد العمود المخصص والطريقة ذات الصلة لـ [¹¹C] SNAP-7941 (المرحلة المتنقلة: (الماء/حمض الخليك 97.5/ 2.5 v/v؛ 2.5 غرام^-1 خلات الأمونيوم؛ pH 3.5)/acetonitrile 70/30 v/v؛ التدفق: 1 مل·دقيقة ^-1) وكتابة قائمة عينة مع اثنين من القياسات (القياسية والمنتج). بدء تشغيل أسلوب تكييف العمود.
6. حقن 20 ميكرولتر من الحل المرجعي SNAP-7941 مع حقنة هاملتون بعد 10 دقيقة تكييف وبدء تشغيل التحليل.
7. غسل حقنة هاملتون مرتين مع الأسيتاتونيتريل والماء بعد الحقن.
8. بدء تشغيل برنامج التحكم GC وكتابة قائمة نموذج.
أداء مراقبة الجودة
1. قياس الغلة المشعة المطلقة للمنتج بعد نهاية التوليف ونقل 100 ميكرولتر من المنتج إلى قارورة رد فعل مع حقنة محمية بالرصاص المعدة لمراقبة الجودة.
  ملاحظة: يجب توثيق جميع البيانات التي يتم الحصول عليها من مراقبة الجودة وفقاً للوائح الوطنية.
2. HPLC التحليلية: قياس النقاء الكيميائي الإشعاعي والنقاء الكيميائي وإعلام الشخص المسؤول عن تجارب زراعة الخلايا على الفور من النتائج.
  1. رسم 40 درجة مئوية من عينة مراقبة الجودة وحقن إلى HPLC. بدء تشغيل عن طريق تحريك ذراع صمام الحقن من الحمل إلى حقن (الشكل3).
    ملاحظة: أثناء التشغيل (8 دقائق) ، يمكن إجراء قياسات أخرى للبروتوكول لتجنب الاضمحلال قدر الإمكان.
  2. فتح الكروماتوغرام ودمج جميع القمم في قناة النشاط الإشعاعي. مقارنة وقت الاحتفاظ بالمنتج (5.0-7.0 دقيقة) مع وقت الاحتفاظ بالمعيار المرجعي. قارن المنطقة تحت المنحنى في النسبة المئوية لجميع القمم المتكاملة. يجب أن تكون ذروة المنتج أكثر من 95٪ (نقاء كيميائي إشعاعي) من مجموع المناطق المتكاملة (قناة الراديو).
  3. دمج الإشارة في قناة الأشعة فوق البنفسجية لتحديد النقاء الكيميائي. الشوائب الرئيسية عادة ما تكون السلائف SNAP حمض في 2.8-3.5 دقيقة. يتم حسابتركيز [nat C]SNAP-7941 من منحنى المعايرة بعد التكامل. حساب تركيز SNAP-7941 في μmol·mL^-1 وتحديد النشاط المولي عن طريق المعادلة التالية:
3. بالنسبة للكروماتوغرافيا الغازية، نقل 20 ميكرولتر من عينة مراقبة الجودة في قارورة زجاجية مخصصة. وضعه في autosampler وبدء القياس. بعد الانتهاء من القياس، افتح الرسم اللوني ودوّن أرقام القمم المدمجة تلقائيًا. يجب أن لا تحتوي العينة على أكثر من 410 جزء في المليون acetonitrile و 10٪ الإيثانول.
4. Osmolality: ضع قرص عينة ورقية على جوفاء مخصصة وتطبيق 10 ميكرولتر من العينة. اضغط على الزر إغلاق لقياس الذبول. بعد 3 دقائق، يعرض الجهاز الذبول التي يجب أن تكون في نطاق 190-500 mosm·kg^-1.
5. الرقم الهيدروجيني: اغسل القطب بالماء. قياس الرقم الهيدروجيني عن طريق وضع القطب الكهربائي في العينة. يجب أن يكون درجة الحموضة في نطاق 5.0-8.5. اغسل القطب الكهربائي مرة أخرى بعد القياس ووضع القطب الكهربائي في محلول الأس الهيدروجيني المرجعي.
6. γ-الطيف: وضع عينة مراقبة الجودة في مطياف γ، وفتح برنامج التحكم وبدء القياس. إيقاف القياس وكتابة الطاقة المقاسة التي يجب أن تكون 511 كيلوفولت (نطاق 420-520 كيلوفولت). افتح قائمة الملف وآمن الملف مع رقم المجموعة المعنية. تذكر الطيف المحفوظ في البرامج المخصصة وطباعة الطيف.
7. نصف العمر: قياس نشاط عينة مراقبة الجودة مرتين باستخدام معاير الجرعة. اكتب الأوقات ذات الصلة وحساب نصف عمر الأسي.
الافراج عن
1. بعد أن يتم اختبار جميع المعلمات والنتائج وفقا للمبادئ التوجيهية للسلطات النمساوية، والإفراج عن المتتبع الإشعاعي. يجب على عامل التشغيل توقيع صحة البيانات.

4- تقييم التفاعلات مع ناقل الـ P-gp

خلية ثقافة
1. بدء تدفق الهواء laminar (القوات المسلحة اللبنانية) من منضدة وتنظيف مقاعد البدلاء على الأقل 15 دقيقة قبل البدء في العمل.
2. امزج وسط زراعة الخلايا في ظل ظروف معقمة في القوات المسلحة اللبنانية مع 10% من FCS (50 مل) و0.5% من المضادات الحيوية (2.5 مل) مع ماصة حجمية معقمة باستخدام معونة الأنابيب الآلية.
3. ذوبان MDCKII-hMDR1 وMDCKII-WT الخلايا وزراعة في T75 أو T175 قارورة ثقافة الخلية 10-14 يوما قبل التجارب في ظل ظروف العقيم (القوات المسلحة اللبنانية).
4. تغيير المتوسطة في اليوم التالي لإزالة جميع الخلايا غير الملتصقة والمبرمجة.
5. استبدال كل ثلاثة أيام المتوسطة مع واحد الطازجة (12 مل لT75 و 23 مل لقارورة ثقافة الخلية T175، على التوالي).
6. تقسيم الخلايا وفقا للجدول الزمني للتجارب إلى قوارير جديدة أو لأطباق ثقافة الخلية على التقاء 80٪ لتجنب ثنائية الطبقة المتنامية.
إعداد الخلايا للتجارب
1. تقسيم الخلايا قبل يومين من التجارب والبذور في تركيز 2.5 × 10⁵ خلايا لكل 2 مل في مستوى مائل من طبق ثقافة الخلية (الشكل4). استخدم جهاز عداد خلية أوتوماتيكي أو غرفة عد Neubauer لحساب الخلايا وحساب نسبة التقسيم المناسبة.
2. إزالة المتوسطة يوم واحد قبل التجارب، وغسل الخلايا على طبق الثقافة مع 4 مل من DPBS وإضافة الطازجة 5 مل من خلية الثقافة المتوسطة. ضع الطبق أفقياً في الحاضنة.
3. غسل الخلايا مع DPBS على الأقل 0.5 ساعة قبل التجارب واستبدالها مع 2 مل من FBS المتوسطة الحرة. فحص التقاء ومورفولوجيا الخلية مع المجهر.
إجراء التجارب في ثلاثة إعدادات مختلفة.
1. استخدم طبق بيتري للتجارب كما هو موضح في 4.2.3.
2. علاج الخلايا لمدة 0.5 ساعة قبل التجارب مع هيدروكلوريد 10 μM (±)-فيراباميل.
3. إضافة 0.98 درجة مئوية من محلول مخزون فيراباميل (20.4 مم (±)-فيراباميل هيدروكلوريد في DMSO). المحتوى النهائي DMSO هو ≤ 0.05٪ أثناء العلاج.
4. احتضان الخلايا لمدة 0.5 ساعة مع التحكم في السيارة (DMSO). استخدام نفس الحجم كما تستخدم لعلاج المخدرات.
تجارب من ال [ر-تيم] إنقوس (ل كلّ ثلاثة إعدادات)
1. قم بتشغيل الجهاز والكمبيوتر وتأكد من اتصالهما بشكل صحيح، ثم افتح برنامج التحكم.
2. اختر الخيار هدف واحد، قم بإلغاء قفل القالب وضبط الإعداد التالي:
  عدد الوظائف: 2 (2)
  وقت الكشف (ثانية): 3 (ثلاثة)
  وقت تأخير الكشف (ق): 2 (اثنان)
  اسم المرحلة الأولى: خط الأساس
3. أدخل طبق ثقافة الخلية في دعم يميل من الجهاز، والتأكد من أن القطب الخلية على الجانب السفلي ومغطاة المتوسطة ثقافة الخلية.
4. بدء تشغيل عبر زر ابدأ. يطلب النظام حفظ الملف. اختر اسم ملف ومسار حفظ. يظهر مركز التحكم ويبدأ قياس خط الأساس (يبدأ دعم طبق ثقافة الخلية بالدوران).
5. حدد ضمن خياراتأخرى:
  مقياس الوقت: دقائق
  تصحيح النويدات: الكربون-11
6. تحقق من جميع المربعات ضمن المنحنيات في الرسم البياني (الخلفية (الأحمر)، والهدف (الأزرق) والهدف ناقص الخلفية (أسود)).
7. الحصول على معلمات مراقبة الجودة: النشاط المولي [GBq.μmol^-1]وتركيز النشاط [MBq.mL^-1]في نهاية التوليف.
8. حساب حجم التتبع المعني ل15 nM من [^natC] SNAP-7941 في حجم فحص 2 مل.
9. إعداد ماصة إلى حجم كل منهما وaliquot من المنتج [¹¹C] SNAP-7941 في التدريع الرصاص.
10. انقر فوق إيقاف مؤقت في إطار مركز التحكم. انتظر حتى يتوقف دوران الطبق والشريط الجانبي مع عنوان توقف والمرحلة التالية تحدث.
11. افتح غطاء الجهاز الحركي في الوقت الحقيقي. أدر طبق الثقافة دعم 90 درجة إلى اليسار. أضف الحجم المحسوب للتتبع وأعد إلى الموضع الأولي. ثم أغلق غطاء الجهاز. اضغط على الفور الزر متابعة لبدء التجربة.
12. إنهاء التجربة بعد 20 دقيقة عن طريق تحديد وقفة وإنهاء تشغيل في وقت لاحق (اضغط على نهاية تشغيل في الشريط الجانبي).
تحليل البيانات ومعالجتها باستخدام برنامج إحصائي
1. افتح برنامج التحكم في الوقت الحقيقي. انقر على فتح الملفات لاستدعاء الحركية المطلوبة. يتم توضيح الحركية في إطار مركز التحكم.
2. اختر عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن مباشرة على الحركية تصدير منحنيات. حفظ الملف النصي الذي يحتوي على البيانات الأولية. افتح برنامج الإحصاءات والصق ملف البيانات الأولية للتجارب في الوقت الحقيقي.
3. ابدأ بالوقت (المحور س) عند إضافة المتتبع الإشعاعي (استبعاد قياس الخلفية) وتطبيع الإشارة إلى النسبة المئوية لـ CPS القصوى (عدد الأشخاص في الثانية).
4. قم بتحميل كافة البيانات التي تمت تسويتها إلى ملف GraphPad Prism جديد.
5. حساب القيم المتوسطة والانحراف المعياري.
6. قم بتوضيح البيانات التي تم الحصول عليها كرسم بياني يوضح الانحراف (معدل الزيادة) لـ "معدل الزيادة" في عمليات التتبع الثلاثة جميعها.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أسفر التركيب الإشعاعي الآلي بالكامل لـ [¹¹C]SNAP-7941 عن 5.7 ± 2.5 GBq (4.6 ± 2.0٪ في EOB، 14.9 ± 5.9٪ على أساس [¹¹C] CH₃OTf؛ ن = 10) من المنتج المصاغ. واستمر التوليف العام حوالي 40 دقيقة، حيث كانت هناك حاجة إلى 15 دقيقة لإعداد [¹¹C] CH₃OTf عن طريق طريقة مرحلة الغاز، وكان من الضروري 5 دقائق أخرى لوضع العلامات الإشعاعية للسلائف، تليها 10 دقيقة من شبه preparative RP-HPLC تنقية و 10 دقيقة لاستخراج C18 المرحلة الصلبة وصياغة. ثم تم تسليم aliquot صغير (حوالي 100-200 ميكرولتر) إلى الشخص المسؤول عن مراقبة الجودة، في حين تم تمرير قارورة المنتج الأصلي التي تحتوي على التتبع الجاهزة للاستخدام إلى المجرّب للتحليل الحركي في الوقت الحقيقي.

تم الانتهاء من مراقبة الجودة في غضون 10 دقيقة بعد نهاية التوليف. وكان النشاط المولي في نطاق 72 ± 41 GBq/μmol (ن = 10) وكان النقاء الكيميائي الإشعاعي دائما > 95٪. جميع المعلمات الأخرى (درجة الحموضة، osmolality، المذيبات المتبقية) تفي بمعايير الإفراج. بالنسبة للفحص الحركي في الوقت الحقيقي، تم اختيار ثلاثة إعدادات تجريبية مختلفة: (أ) خلايا MDCKII-WT المعالجة وغير المعالجة (المركبة)، (B) غير المعالجة أو المعالجة بخلايا مركبة MDCKII-hMDR1 و(C) خط الخلية الأخير مع حظر قبل الوقت الحقيقي اختبار الحركية للناقل باستخدام (±)-فيراباميل. تطبيق [¹¹C]SNAP-7941 على خط الخلية النمط البري MDCKII-WT (P-GP غير صريحة) وMDCKII-hMDR1 (P-GP التعبير) يظهر سلوك حركي مختلف، كما أن هناك تراكم سريع لخط الخلية النمط البري، في حين لم يلاحظ أي تراكم لخلايا MDCKII-hMDR1. ومع ذلك، أدى منع P-GP efflux الناقل فيخلايا MDCKII-hMDR1 مع (±)-فيراباميل إلى حركية مماثلةفي الوقت الحقيقي كما رأينا بالفعل لخط الخلية النمط البري (الشكل 5).

figure-results-1
الشكل 1: لمحة عامة عن تدفق العمل. تدفق العمل من التركيب الإشعاعي، ومراقبة الجودة، وأداء القياس الحركي في الوقت الحقيقي من [¹¹C] SNAP-7941. تشير الأسهم السوداء إلى طريقة نقل النشاط الإشعاعي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مخطط التركيب الإشعاعي للمركب الآلي. تبديل الدائرة من المزج الآلي، بدءا من وحدة الدورة الدموية ل [¹¹C] CH₃I /^[11C]CH₃OTf الإنتاج، مفاعل لإدخال النشاط في محلول السلائف وتنقية SPE (SPE = استخراج المرحلة الصلبة؛ PCV = قارورة جمع المنتجات). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التصوير اللوني التمثيلي للتركيب الإشعاعي الآلي بالكامل لـ [¹¹C] SNAP-7841. ويتضح من مخطط الألوان RP-HPLC شبه التمهيدية في الجزء العلوي والرسم البياني بعد تنقية على الجزء السفلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: إعداد طبق ثقافة الخلية للتجارب في الوقت الحقيقي. وتشمل الخطوة 1 البذر من 2.5 × 10⁵ تصل إلى 1 × 10⁶ اعتمادا على نوع الخلية ومعدل نموها. فيما بعد, الثقافة وضعت طبق في طائرة منحرفة (تقريبا 30-45°). لذلك، يمكن استخدام الجهاز المعدني الموردة أو غطاء طبق ثقافة الخلية في الحاضنة لتثبيت موقف مائل من الطبق. في اليوم التالي (24 ساعة) يتم تعديل الطبق أفقيا، ويتم إضافة وسط ثقافة الخلية الطازجة لتغطية سطح الخلية تماما. في يوم التجربة، يتم فحص صلاحية الخلية والتقاءها. وفقا للبروتوكول التجريبي، يتم غسل الخلايا مع DPBS، يتم استبدال المتوسطة المتوسطة المصل خالية (2 مل)، ويتم تغيير موضع طبق الثقافة إلى موقف مائل حتى بداية التجارب. من الآن فصاعدا، يمكن علاج الخلايا مع المانع أو السيارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: قياسات حركية في الوقت الحقيقي لـ [¹¹C] SNAP-7941. تظهر حركية الوقت الحقيقي التمثيلية لـ [¹¹C]SNAP-7941 في ثلاث مجموعات مختلفة: استخدام خلايا MDCKII-WT; خلايا MDCKII-hMDR1 منعت مسبقا مع (±) -فيراباميل كما مثبطات P-GP وخلايا MDCKII-hMDR1 دون انسداد. يوضح المحور ص معدل الزيادة في خلايا MDCKII-hMDR1 وWT المحجوبة مسبقًا مقارنة بنتائج خلايا MDCKII-MDR1 غير المعالجة أو المعالجة بالمركبات، على التوالي (لا يمكن الاستفادة منها، 0٪). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أنشئ التركيب الإشعاعي لـ [¹¹C] SNAP-7941 على وحدة تركيب تجارية. ونظرا لإمكانية التشغيل الآلي الكامل لإجراء الإعداد، فإن التركيب الإشعاعي الذي ثبت أنه موثوق به، وتحققت تحسينات فيما يتعلق بالحماية من الإشعاع للمشغل. إعداد المزج له تأثير هائل على نوعية المتتبع الإشعاعي، وخاصة من حيث النشاط المولي. وبالتالي، من الضروري العمل باستمرار في ظل ظروف خاملة (مثل الغلاف الجوي للهيليوم)، وشطف جميع الخطوط الموجودة قبل سفينة التفاعل (الخط المستهدف، [¹¹C]CH₃I دورة الإنتاج والمفاعل (انظر الشكل2)). وعلاوة على ذلك، تسخين الفخاخ والأفران ذات الصلة قبل بدء التوليف لإزالة الرطوبة والكربون في الغلاف الجوي يزيد من النشاط المولي بشكل مفيد. خصوصا العمود AgOTf، مشربة مع الكربون الجرافيت، حساسة للغاية للرطوبة. حتى كميات طفيفة من أي مصدر للرطوبة يزعج تحويل [¹¹C] CH₃I إلى [¹¹C] CH₃OTf. قبل البدء في التوليف، و [¹¹C] CO₂ فخ و [¹¹C] CH₃فخ يجب أن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة مرة أخرى من أجل تمكين المحاصرين اللاحقة. وعلاوة على ذلك، يوصى بحل السلائف قبل وقت قصير من بدء التوليف وإضافة القاعدة مباشرة إلى محلول السلائف.

يجب أن تكون مراقبة الجودة لـ carbon-11 radiotracers مصممة بشكل رشيد لسير عمل مستمر وسريع. ومع ذلك، فإن أهم المعلمات لدراسات زراعة الخلايا هي النقاء الكيميائي الإشعاعي والنشاط المولي للحصول على نتائج صحيحة. يتطلب التقييم الصحيح للنشاط المولي طريقة تحليلية قوية HPLC ومنحنى المعايرة يجب أن يغطي نطاق تركيز المنتج النهائي. والجزء الصعب بالنسبة للأجهزة الراديوية هو تحقيق تركيز يتجاوز الحد الأقصى للقياس الكمي (LOQ) بسبب كميات صغيرة، يتم إنتاجها أثناء التركيب الإشعاعي. وبالتالي، فإن الفن هو العثور على التوازن بين الأنشطة الموليعالية لتجنب تشبع مستقبلات وتركيزات عالية بما فيه الكفاية لتكون لا تزال قادرة على تحديد كمية الإشارة غير المشعة.

^[11جيم] تم تأكيد SNAP-7941 لتكون الركيزة قوية من الناقل P-GP الإنسان، كما لوحظ أي تراكم في الخلايا MDCKII-hMDR1 غير المعالجة أو المركبات بسبب efflux السريع. وعلى النقيض من ذلك، فإن كلا ً من اللإعدادات التجريبية (MDCKII-WT أو خلايا MDCKII-hMDR1 المحظورة مسبقًا) قدمت نتائج مماثلة (تراكم [¹¹C]SNAP-7941)، مما يدعم تعدد استخدامات هذا الاختبار في المختبر. خلايا MDCKII-hMDR1 هي مناسبة للغاية لتجارب LigandTracer بسبب الانفذيب مستقرة، والنمو السريع والمستمرة ضد الإجهاد القص الناجم ة عن طبق ثقافة الخلية الدورية. وبالتالي فإن عدم وجود [¹¹C] SNAP-7941 التناول في الدماغ الفئران والفئران قد يحدث بسبب efflux من خلال الناقل P-GP. بسبب الانجراف من خلايا الكلى الكلاب مع البروتين المقاومة للأدوية المتعددة البشرية 1 (hMDR-1، P-GP)، والقيمة التنبؤية لهذه الطريقة لefflux الناقل ملزمة في البشر عالية، وهو أمر إيجابي من حيث التطبيق السريري في المستقبل. ومع ذلك، لم يتم التحقق حتى الآن من الانتقائية ضد الناقل efflux الأخرى. لذلك، يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى، والتعبير عن مختلف ناقلات efflux بارزة كما بروتين مقاومة سرطان الثدي (BCRP) أو البروتين المقاومة متعددة-1 (MRP-1)، لدراسة التفاعلات نحو هذه الناقلين. الأسلوب بالمقارنة مع تراكم الكلاسيكية أو النقل الاختبارات بسيطة جدا ويعطي نتائج نوعية على الفور. وعلاوة على ذلك، فإن أكبر ميزة هي أن هذه التكنولوجيا تمكن من تقييم التفاعل المباشر بين متتبع PET والهدف في الوقت الحقيقي، على النقيض من التجربة التقليدية باستخدام القياس الكمي غير المباشر (الإزاحة في الغالب). وبالإضافة إلى ذلك، يوفر برنامج التشعاع الإشعاعي في الوقت الحقيقي مرونة تجريبية (مثل تصحيح اضمحلال النويدات، وقياس الوقت والمواقف، وما إلى ذلك) وبالتالي، حرية عالية للمستخدمين. على الجانب الآخر، تشمل قيود الطريقة انخفاض الإنتاجية عينة، كما يمكن قياس طبق خلية واحد فقط في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار بعض المسائل التقنية والتشغيلية الأخرى: فالتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا للإشعاع الخلفي؛ والتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا إزاء الإشعاع الخلفي؛ والتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا إزاء الإشعاع الخلفي؛ والتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا إزاء الإشعاع الخلفي؛ والتكنولوجيا الموصوفة حساسة جدا للإشعاع اتلاف. وبالتالي، ينبغي الإبقاء على مصادر الإشعاع عن بعد، وينبغي التركيز على قياس الخلفية قبل التجربة. وثمة مسألة أخرى تتعلق بالتجارب في درجات حرارة أعلى من درجة حرارة الغرفة، وهي تسخين الدعم المائل: قد يؤثر تبخر وسيلة ثقافة الخلية على الكاشف. بدلا من التدفئة، ويفضل أن يتم وضع الجهاز كله في الحاضنة. وعلاوة على ذلك، يقتصر الأسلوب على خطوط الخلايا الملتصقة. من خلال دوران طبق ثقافة الخلية، قد تنفصل الخلايا الحساسة عن الطبق، مما قد يؤدي إلى نتائج غير صالحة.

ومع ذلك، إذا كان المُجرِّب يعيّن الاهتمام بهذه العيوب الطفيفة، فإن ّ الأسلوب يقدّم نتائج سريعة وموثوقة لتحليل السلوك الحركي لـ PET-tracers قبل السريرية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما نكشف عنه

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل صندوق العلوم النمساوي (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). ونحن ممتنون للدعم التقني الذي تقدمه ت. زنز وأ. كركال. وعلاوة على ذلك، نشكر ك. باليتش على إعداد الفريقين وشركة H. Spreitzer لتوزيعهما السلائف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي>الجدول 1: قائمة المواد والأجهزة الخاصة بالتخليق الإشعاعي الآلي بالكامل ل [11C] SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni Reduced , 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		لتخليق الحمض النووي ، < ؛ 10 جزء في المليون H_{2< / sub>O}
أسيتونيتريل	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية		HPLC درجة
أسيتات الأمونيوم	ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا
حمض الخليك	ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا
الإيثانول	ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا		96٪
كلوريد الصوديوم	ب. براون ، ميلسونجن ، ألمانيا		0.9٪
رباعي بوتيل لامونيوم هيدروكسيد	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية
ميثانول	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية		HPLC
خرطوشة SPE	ووترز ، ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية		SepPak C18plus
عمود RP-HPLC شبه التحضيري	ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا		كروموليث SemiPrep RP-18e ، 100-10 مم
Precolumn	ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا		واقي الكروموليث RP-18e ، 5-4.6 ملم
مقدمة	جامعة فيينا ، النمسا
مركب مرجعي	جامعة فيينا ، النمسا		SNAP-7941
ثلاثي فلورو الميثان سلفونات الفضة	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية
Graphpa GC	Alltech ، ديرفيلد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية		80/100 شبكة
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare ، أوبسالا ، السويد
[^{11< / sup>C] CO_{2< / sub> هدف الضغط العالي}}	Air Liquide ، فيينا ، النمسا
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare ، أوبسالا ، السويد
N_{2< / sub> + 1٪ O_{2< / sub>}}	Air Liquide ، فيينا ، النمسا		الغاز
المستهدف <قوي>الاسم	Company	Catalog Number	Comments
الجدول 2: قائمة المواد والأجهزة لمراقبة الجودة ل [¹¹C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	هيتاشي فانتارا النمسا GmbH (فيينا ، النمسا)		مضخة HPLC
ميرك هيتاشي ، L7400	هيتاشي فانتارا النمسا GmbH (طوكيو ، اليابان)		كاشف الأشعة فوق البنفسجية
NaI-radiodetector	Raytest (ستراوبنهاردت ، ألمانيا)		كاشف الإشعاع NaI-Radiodetector
أداء الكروموليث RP-18e ، 100-4.6 ملم	ميرك (دارمشتات ، ألمانيا)		عمود HPLC
430-GC	بروكر (بريمن ، ألمانيا)		كروماتوجراف الغاز
عمود الشعيرات الدموية ID-BP20 ؛ 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (فيكتوريا ، أستراليا)		غاز الشعيرات الدموية
Wesco ، مقياس التناضح Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (فيينا ، النمسا)		مقياس التناضح
g- مطياف			g- مطياف
الغاز برنامج التحكم في كروماتوغرافيا الغاز	VARIAN (بالو ألتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)الإصدار		1.9.302.952 برنامج
التحكم في مطياف جاما	ORTEC (أوك ريدج ، تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)		Maestro لنظام التشغيل Windows الإصدار 6.06
برنامج استدعاء طيف جاما	ORTEC (أوك ريدج ، تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)		Winplots الإصدار 3.21
برنامج التحكم HPLC	Raytest (Straubenhardt ، ألمانيا)		Gina Star الإصدار 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim ، ألمانيا)		مقياس الأس الهيدروجيني
Name< / strong>	Company	Catalog Number	Comments
<قوي>الجدول 3: قائمة المواد والأجهزة لتقييم السلوك الحركي في الوقت الفعلي ل [^{11< / sup>C] SNAP-7941.< / >}
خلايا كلى Madin-Darby القوي (MDCKII-hMDR1) معهد	السرطان الهولندي (NKI ، أمستردام ، هولندا) التعبير		عن خط
خلايا الكلى للكلاب في مادين داربي (MDCKII-WT)	معهد هولندا للسرطان (NKI ، أمستردام ، هولندا)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH ، فيينا ، النمسا		Gibco 61965-026
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) VWR	International GmbH ، فيينا ، النمسا		Gibco 10270-106
Penicillin / Streptomycin	VWR International GmbH ، فيينا ، النمسا		Gibco 15140
طبق زراعة الخلايا	Greiner Bio-One GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا		Cellstar 100 مم × 20 مم ، Mfr.No. 664160
في المختبر < / em> تجارب DMEM
GlutaMAX	VWR International GmbH ، فيينا ، النمسا		Gibco 61965-026
(±)-فيراباميل هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)
DMSO	Sigma Aldrich (سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)		276855-100 مل
طبق زراعة الخلايا	Greiner Bio-One GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا		Cellstar 100 مم × 20 مم ، Mfr.No. 664160
ماصات بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها	VWR International GmbH ، فيينا ، النمسا		Sterilin ، 5 مل & ndash ؛ 25 مل
أطراف ماصة معقمة	VWR International GmbH ، فيينا ، النمسا		Eppendorf epT.I.P.S. بيوبور 20 ومايكرو ؛ L & ndash; 200 وميكرو ؛ قوارير
ثقافة الخلية	L Greiner Bio-One GmbH ، Frickenhausen ، ألمانيا		Cellstar 250 مل ، 75 سم ^{2 < / sup> غطاء لولبي مرشح أحمر ، Mfr.No.658175}
LigandTracer التحكم الإصدار 2.2.2	Ridgeview Instruments AB ، أوبسالا ، السويد.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB ، أوبسالا ، السويد.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB ، أوبسالا ، السويد.
برنامج GraphPad Prism 6.0	GraphPad ، Inc.
عداد الخلايا الآلي المحمول	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
مستشعرات عداد الخلايا	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 & micro ؛ م (Cat.No. PHCC60050)

الجليدي الصف لحمض SNAP خط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saito, Y., Maruyama, K. Identification of melanin-concentrating hormone receptor and its impact on drug discovery. Journal of Experimental Zoology. 305, 761-768 (2006).
Philippe, C., et al. Preclinical in vitro & in vivo evaluation of [11C]SNAP-7941 - the first PET tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1. Nuclear Medicine and Biology. 40, 919-925 (2013).
Philippe, C., et al. Radiosynthesis of [ 11C]SNAP-7941-the first PET-tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1 (MCHR1). Applied. Radiation and Isotopes. 70, 2287-2294 (2012).
Philippe, C., et al. SNAPshots of the MCHR1 : a Comparison Between the PET-Tracers [ 18 F ] FE @ SNAP and [ 11 C ] SNAP-7941. Molecular Imaging Biology. , 1-12 (2018).
Schirmer, E., et al. Syntheses of precursors and reference compounds of the melanin- concentrating hormone receptor 1 (MCHR1) Tracers [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP for positron emission tomography. Molecules. 18, 12119-12143 (2013).
Miller, P. W., Long, N. J., Vilar, R., Gee, A. D. Synthese von 11C-, 18F-, 15O- und 13N-Radiotracern für die Positronenemissionstomographie. Angewandte Chemie. 120, 9136-9172 (2008).
Pichler, V., et al. An overview on PET radiochemistry: part 1 - covalent labels - 18 F, 11 C, and 13 N. Journal of Nuclear Medicine. 59, 1350-1354 (2018).
Pichler, V., et al. Molar activity - The keystone in 11C-radiochemistry: An explorative study using the gas phase method. Nuclear Medicine and Biology. 67, 21-26 (2018).
Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied Radiation and Isotopes. 48, 153-157 (1997).
Dahl, K., Halldin, C., Schou, M. New methodologies for the preparation of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals. Clinical and Translational Imaging. 5, 275-289 (2017).
Raaphorst, R. M., et al. Radiopharmaceuticals for assessing ABC transporters at the blood-brain barrier. Clinical. Pharmacollogy & Therapeutics. 97, 362-371 (2015).
Nics, L., et al. Speed matters to raise molar radioactivity: Fast HPLC shortens the quality control of C-11 PET-tracers. Nuclear Medicine and Biology. 57, 28-33 (2018).
Zeilinger, M., et al. New approaches for the reliable in vitro assessment of binding affinity based on high-resolution real-time data acquisition of radioligand-receptor binding kinetics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Research). 7, 22(2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

11 P Glycoprotein RP HPLC ALARA

الجانب التقني من التوليف الآلي والتقييم الحركي في الوقت الحقيقي من [11C] SNAP-7941

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة

الجانب التقني من التوليف الآلي والتقييم الحركي في الوقت الحقيقي من [¹¹C] SNAP-7941