يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج تأثير القشرية الخاضعة للرقابة لإصابة الدماغ الماوس مع زرع العلاجية من الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان

10.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59561

⸱

يوليو 10, 2019

 ,  , 
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول منهجيات نموذج الماوس لإصابة الدماغ الصادمة في الجمجمة المفتوحة وزرع الخلايا المستزرعة المتعددة القوى في الخلايا الجذعية المتعددة القوى في موقع الإصابة. كما يتم وصف الاختبارات السلوكية والأنسجة لنتائج هذه الإجراءات باختصار.

الملخص

إصابات الدماغ الصادمة (TBI) هي السبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. علم الأمراض بسبب TBI يتطور من الإهانة الميكانيكية الأولية لعمليات الإصابة الثانوية، بما في ذلك المبرمج والالتهاب. وقد كان النمذجة الحيوانية قيمة في البحث عن آليات الإصابة وتقييم العلاجات العصبية الوقائية المحتملة. يصف هذا البروتوكول نموذج التأثير القشري الخاضع للرقابة (CCI) لـ TBI البؤري المفتوح الرأس. وعلى وجه التحديد، يتم وصف المعلمات لإنتاج إصابة القشرية من جانب واحد خفيفة. يتم تحليل العواقب السلوكية للغرفة باستخدام اختبار إزالة شريط لاصق من التكامل الحسي الثنائي. فيما يتعلق بالعلاج التجريبي لعلم الأمراض TBI، يوضح هذا البروتوكول أيضا عملية لزرع الخلايا المستزرعة في الدماغ. تم اختيار ثقافات الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى التي يسببها الإنسان (hiPSCs) لقدرتها على إظهار استعادة وظيفية متفوقة في المرضى TBI الإنسان. يتم الكشف عن البقاء على قيد الحياة المزمن من hiPSCs في أنسجة الدماغ الماوس المضيف باستخدام عملية المناعة DAB المعدلة.

المقدمة

إصابة الدماغ الصادمة (TBI) هو مصطلح عام للإصابة المكتسبة في الدماغ بسبب إما القوى الميكانيكية غير المباشرة (تسارع الدوران / التباطؤ أو العكس الانقلاب) من ضربات على الرأس أو ضرر مباشر من الأجسام أو موجات الانفجار. وقد قُدِّر أن هذه الظاهرة هي السبب في حوالي 9 في المائة من الوفيات في جميع أنحاء العالم، وقد لوحظت في ما يقدر بنحو 50 مليون حالة في السنة1و2. وقدر تقرير صدر في عام 2017 عن مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها أنه في عام 2013، كان هناك ما مجموعه 2.8 مليون زيارة ووفاة في المستشفيات بسبب TBI في الولايات المتحدة3. ولا يتم الإبلاغ عن العديد من التّبع السل الأكثر اعتدالاً كل عام. TBI خطيرة يمكن أن يؤدي إلى ضعف مدى الحياة من الإدراك، وظيفة المحرك، ونوعية الحياة عموما. عواقب TBI خفيفة، وخاصة المتكررة المتصلة بالرياضة TBI، وقد تمتقدير ها فقط في الآونة الأخيرة لآثارها الصحية الغادرة 4،5.

النمذجة قبل السريرية هو عنصر حيوي لتطوير رؤى ميكانيكية جديدة والعلاج التصالحية المحتملة لTBI. تأثير القشرية الخاضعة للرقابة (CCI) نموذج TBI هو نموذج مفتوح الرأس من إصابة كدمة ميكانيكية إلى القشرة. يمكن تعديل معلمات التأثير لإنتاج إصابات CCI التيتتراوح من خفيفة إلى شديدة 6. إصابات CCI هي مركز ية بدلا من نشرها، كما رأينا مع نماذج أخرى من الرأس المغلقة من TBI. ويمكن إجراء CCI للحث على إصابة من جانب واحد، بحيث القشرة التعارضية يمكن أن تكون بمثابة الخدمة المدنية المتخذة أساسا للمقارنة الداخلية. يوضح هذا البروتوكول خصائص CCI خفيفة لجزء من القشرة التي تشمل المناطق الحسية الجسدية الأولية والحركية. وقد تم اختيار هذه المنطقة القشرية لمشاركتها في السلوكيات الحسية الحركية التي يمكن للعديد من اختبارات السلوك الكشف عن العجز الناجم عن الإصابة7. يمكن الكشف عن التحسينات السلوكية بسبب التدخلات العلاجية لTBI، وكذلك.

ومن السمات المميزة لـ TBI الخلل العصبي الواسع الانتشار في المنطقة المصابة. الخلايا العصبية المصابة تخضع لوفاة الخلية، ويتم تعطيل اتصال شبكة الخلايا العصبية8،9. TBI يعطل تجنيد الخلايا الجذعية الذاتية، مما يؤدي إلى مزيد من العجز السلوك المصب10،11.  وقد تم استكشاف زرع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا كإمكانية لاستعادة وظيفة في الدماغ المصاب. بالإضافة إلى إمكانية استعادة الدوائر العصبية التالفة، الخلايا المزروعة ممارسة آثار الباراكرين التي تعزز بقاء الخلايا العصبية والانتعاش الوظيفي من TBI12. وقد تم زرع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا قبل السريرية لتقييم إمكاناتها التصالحية في نماذج من الاضطرابات العصبية13،14،15. وقد أدى تعميم تكنولوجيا الخلايا الجذعية المتعددة القوى المستحثة16 في الآونة الأخيرة إلى تيسير تطوير العديد من خطوط الخلايا الجذعية البشرية للاستخدام التجريبي. اختبار ما قبل السريرية مع الخلايا المشتقة hiPSC هو خطوة أولى هامة لوصف فعالية خط خلية معينة العلاجية المحتملة ضد الأمراض البشرية. وقد وضع هذا المختبر بروتوكولات للتمييز hiPSCs إلى الأنماط الظاهرية العصبية17 سعيا وراء الخلايا القابلة للزرع للمساعدة في الانتعاش من إصابات الدماغ الصادمة.

التجارب في هذا البروتوكول استخدام CCI من جانب واحد للحث TBI إلى القشرة الحسية الجسدية اليسرى والحركية للفئران البالغة. إصابة CCI خفيفة يؤدي إلى عجز وظيفي مستمر في الصدارة اليمنى التي تستخدم لتتبع آثار الطعوم الخلية العصبية المستمدة من hiPSC على الانتعاش الوظيفي. تم تكييف اختبار الـ Forepaw sensorimotor في هذا البروتوكول من المنهجية التي وضعها بويت وزملاؤه18 وأثبتها سابقا فليمينغ وزملاؤه19.  يحدد هذا البروتوكول سير عمل كامل لإجراء إصابة الدماغ التجريبية، وزرع العلاجية من خلايا hiPS، والتحليل السلوكي والأنسجة من مقاييس النتائج التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد استعرضت لجنة الرعاية والاستخدام الحيوانية التابعة لجامعة الخدمات النظامية جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول ووافقت عليها.

1. استئصال الجمجمة وتأثير القشرية الخاضعة للرقابة

  1. إعداد جهاز التأثير القشري الخاضع للرقابة واللوازم الجراحية.
    1. تحميل 1 مل زلة طرف حقنة مع 0.5 مل من المالحة المعقمة لري الجرح. إرفاق إبرة 25 G إلى حقنة للسيطرة على الري.
    2. إعداد محلول مخفف من CsA في DMSO إلى التركيز النهائي من 1 ملغ / مل. قم بتحميل حقنة ثانية بطرف 1 مل مع 0.5 مل من السيكلوسبورين A (CsA) الحل لقمع المناعة. إرفاق إبرة 25 G أو أكبر إلى حقنة CsA.
    3. قم بإرفاق مكبس الصدمات القشرية الخاضع للرقابة بذراع على إطار مجسم ومجموعة إلى زاوية 15 درجة. قم بإرفاق مسبار منتاق 3 مم بالمكبس.
    4. تعيين سرعة الارتطام إلى 1.5 م / ث ويسكن تأثير الوقت إلى 0.1 ث لإنتاج إصابة القشرية خفيفة.
  2. إجراء عملية استئصال الجمجمة من جانب واحد
    1. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير المتصلة بمرذاذ الإسيوفرلوران مع مصدر الأكسجين المضغوط. حث التخدير مع ~ 3٪ isoflurane في ~ 0.7 L / دقيقة الأكسجين. تحقق من عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة اصبع القدم.
    2. انزعي فروة الرأس باستخدام كليبرز كهربائي وامسحي أي فرو فضفاض.
    3. ضع الماوس في إطار مجسم مع مخروط أنف التسليم مخدر المرفقة.
      1. ضع لوحة الاحترار إلى 37 درجة مئوية على الإطار المجسم تحت الماوس للحفاظ على درجة حرارة الجسم تحت التخدير. إصلاح الرأس في مكان مع قضبان الأذن وشريط لدغة وتوجيه الرأس بحيث العظام الأمامية الجمجمة أفقي. الحفاظ على التخدير في ~ 1.5٪ -2٪ isoflurane لمدة الجراحة.
    4. لإجراء الرعاية قبل الجراحة والإعداد الجراحي العقيم، وتطبيق مرهم العين المضادات الحيوية للعيون باستخدام مسحة القطن المعقمة. تطبيق حل يستند إلى اليود على منطقة فروة الرأس حلق. إزالة هذا مع الإيثانول 70٪. تغطية الحيوان مع الستائر الجراحية fenestrated بحيث الجزء العلوي من الرأس مرئية ولكن يتم تغطية العينين.
    5. قم بعمل شق خط الوسط (1.5-2 سم) على فروة الرأس باستخدام مشرط أو مقص.  استخدام مسحات القطن المعقمة لتنظيف الجرح ولمسح اللفافة اليسرى من خط الوسط في بريما.
    6. استخدم مسبار الصدم لتحديد موقع استئصال الجمجمة.
      1. تعيين نقطة مرجعية مجسمة (X = 0، Y = 0) إلى bregma.  ضبط التحقيق أفقيا إلى 2 مم اليسار من خط الوسط. قم برسم دائرة قطرها 5 مم حول المسبار باستخدام علامة آمنة جراحياً فائقة البقشيش. رفع وتدوير تأثير خارج الموقف.
    7. استخدام عالية السرعة أداة اليد مجموعة السيارات الدقيقة الدوارة لجعل ثقب مفتوح في الجمجمة باستخدام جولة طرف 0.6 مم أو 0.8 مم لدغ الحفر بت في ~ 70٪ -80٪ السرعة القصوى. تطبيق الضغط الخفيف على الجمجمة أثناء الحفر على طول مخطط محيطي 5 ملم لرقيقة هذه الحدود.
      1. لا تطبق الضغط الزائد أثناء الحفر. وهذا يمكن أن يسبب إصابة القشرية بسبب الاهتزاز, ضغط, أو الاختراق العرضي. السماح لسرعة بت الحفر للقيام بالعمل.
      2. لا حفر في أي بقعة معينة لفترة طويلة جدا لتجنب ارتفاع درجة حرارة الاحتكاك من الجمجمة. ري استئصال الجمجمة في بعض الأحيان مع محلول ملحي معقم لإزالة الحطام والحد من التدفئة من أداة دوارة.
      3. إيلاء اهتمام وثيق أثناء الحفر على خط خياطة الإكليل لأن هذه النقاط عرضة للنزيف.
    8. استخدام زوج من ملاقط غرامة لإزالة رفرف الجمجمة عندما يتم رقيق مخطط استئصال الجمجمة بما فيه الكفاية. أمسك الرفرف بشكل ميدي، ورفع ويسحب بلطف أفقيا ً بحركة شعاعية.
      1. لا تضر الأم دورا عند رفع رفرف. وهذا يمكن أن يسبب إصابات خطيرة ونزيف.
  3. إجراء إصابة خفيفة في تأثير القشرية الخاضعة للرقابة
    1. تنظيف التحقيق تأثير مع وسادة الكحول معقمة الإعدادية. نقل التحقيق تأثير مرة أخرى إلى موقف على القشرة المكشوفة. خفض التحقيق حتى يمس سطح الأم دورا. وضع علامة على هذا الموضع كـ Z = 0.
    2. سحب المكبس والانتقال إلى Z = -1.0 ملم.
    3. رفع المكبس بسرعة ونقل الذراع من الموقف. تطبيق كميات سخية من المالحة لري القشرة بعد الإصابة. شطف موقع الجراحة مع المالحة حسب الحاجة وخياطة شق فروة الرأس باستخدام stiches توقف بسيطة مع خياطة الحرير 5.0.
  4. إجراء الرعاية بعد العملية الجراحية على الماوس
    1. توقف عن التخدير تسليم CsA عن طريق الحقن تحت الجلد في سكرفي في 10 مغ/كغ جرعة. ضع الماوس في قفص نظيف ودافئ قبل العملية الجراحية.
    2. توفير مسكن أسيتامينوفين في مياه الشرب في 1.0 ملغ / مل.
      ملاحظة: توفير التسكين وفقا لإجراءات التشغيل القياسية IACUC المناسبة ومراعاة متغيرات النتائج التجريبية (على سبيل المثال، التخدير، التهاب الأعصاب).
    3. توفير الطعام تشاو مبللة في قفص الانتعاش الدافئة للمساعدة في الإماهة والانتعاش.
  5. انتقل من القسم 2 إلى القسم 4 أعلاه عند إجراء عمليات التحكم في استئصال الجمجمة فقط (الشام).

2. زرع مجسمة من تعليق الخلية

  1. بدء عملية زرع الخلايا حوالي 24 ساعة بعد استئصال الجمجمة.
  2. إعداد معدات زرع الخلايا واللوازم الجراحية
    1. ملء حقنة 1 مل زلة طرف مع المالحة معقمة لري الجرح. إرفاق إبرة 25 G إلى حقنة للسيطرة على الري.
    2. ملء 1 مل زلة طرف حقنة مع محلول CsA لقمع المناعة. إرفاق إبرة 25 G أو أكبر إلى حقنة CsA. إعادة ملء حقنة CsA حسب الحاجة بين العمليات الجراحية.
    3. إعداد الإبر الزجاجية من 1.0 مم OD البورسليكات الزجاج الماصات الشعرية باستخدام الأساليب القياسية.
    4. استخدام ملاقط غرامة لكسر نصائح إبرة إلى ما يقرب من 200 ميكرومتر قطرها. تأكد من أن رمح أسطواني من الإبرة لا يزيد عن 2.5 سم.
  3. معايرة مضخة الحقنة للاستخدام مع حقنة 10 ميكرولتر.  أدخل معدل تدفق قدره 0.2 ميكرولتر/دقيقة لتقديم حجم إجمالي قدره 2.0 ميكرولتر.
  4. إعداد تعليق الخلايا الجذعية متعددة القوى (iPSC) المستحثة من قبل الإنسان.
    1. قم بإجراء جميع عمليات معالجة الخلايا في غطاء محرك السيارة BSL-2 باستخدام تقنيات المناولة العقيمة القياسية.
    2. إعداد ثقافات الخلايا مسبقًا وفقًا للشروط القياسية المحددة لنوع الخلية. يرجى الرجوع إلى ليستشكا وآخرون17 كمثال على ذلك.
      ملاحظة: استخدمت التجارب الموضحة في هذه المظاهرة مختلف الخلايا الظاهرية العصبية المشتقة من hiPSCs.
    3. فكّن الخلايا برفق إلى تعليق خلية واحدة باستخدام حل مفرزة الخلايا، أو أي وسائل الأنزيمية أو الكيميائية المفضلة الأخرى.
    4. عد الخلايا في التعليق، ثم تمييع التعليق إلى 5 × 104 خلايا / ميكرولتر في الحد الأدنى من خلية الثقافة المتوسطة (على سبيل المثال، DMEM) في أنبوب اختبار الوجه 1.7 مل الأعلى.
    5. لاحظ الملاحظات التالية للزرع:
      1. الحفاظ على الخلايا في تعليق في 37 درجة مئوية لمدة الإجراءات.
      2. تحميل الحقنة فقط مباشرة قبل إجراء الحقن intraparenchymal (الخطوة 4.5 أدناه).
        ملاحظة: الجاذبية يمكن أن يسبب تعليق الخلية لتسوية أو التشبث إلى جانب الحقنة إذا وضعت على جانبها. وهذا يؤدي إلى مخالفات في عدد الخلايا التي يتم حقنها.
      3. تخصيص ~ 5 × 105 خلايا (تعليق 10 درجة مئوية) لكل ماوس إذا كان إجراء عمليات زرع الخلايا متعددة في يوم واحد.
  5. إجراء جراحة زرع التاكسي المجسم
    1. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير المتصلة بمرذاذ الإسيوفرلوران مع مصدر الأكسجين المضغوط. حث التخدير مع ~ 3٪ isoflurane في ~ 0.7 L / دقيقة الأكسجين.
    2. ضع الماوس في إطار مجسم مع مخروط الأنف مخدر المرفقة.
      1. إصلاح الرأس في مكان مع قضبان الأذن وشريط لدغة وتوجيه الرأس بحيث العظام الأمامية الجمجمة أفقي. الحفاظ على التخدير في ~ 1.5٪ -2٪ isoflurane لمدة الجراحة.
    3. إجراء الرعاية قبل الجراحة وإعداد العقيم
      1. تطبيق مرهم العيون ترطيب تحتوي على المضادات الحيوية للعيون باستخدام مسحة القطن.
      2. غسل موقع الشق مع المالحة المعقمة لتنظيف الموقع وتخفيف الغرز. ضعي الإيثانول برفق 70% مع مسحة قطنية لتعقيم موقع الشق.
    4. إزالة الغرز باستخدام ملاقط غرامة ومقص العيون. موقع جراحة الري واستئصال الجمجمة مع محلول ملحي معقم وفير.
      1. النظر في الحيوان للاستبعاد إذا كانت القشرة يعرض خصائص غير مؤهلة بما في ذلك الفتق المفرط، وتغير اللون، والأوعية الدموية تعطلت، أو نزيف.
    5. تحميل حقنة زرع الخلية
      1. نقل تعليق الخلية من حاضنة 37 درجة مئوية إلى غطاء محرك السيارة سلامة حيوية ثقافة الخلية. تدور بلطف أو اضغط على الأنبوب لضمان تعليق خلية متجانسة.
      2. استخدام pipettor الصغيرة لتحميل ~ 7.5 درجة مئوية تعليق الخلية في حقنة هاملتون من خلال نهاية الغطاس.
        1. عقد حقنة في زاوية ~ 120 درجة مع نهاية الغطاس التي تواجه أسفل. إدراج الغطاس، مع الحرص على عدم إدخال فقاعة الهواء بين التعليق وطرف الغطاس.
      3. إرفاق الجمعية طوقا إلى إبرة ماصة، ثم إرفاق الإبرة إلى الحقنة.
      4. دفع الغطاس لنقل تعليق الخلية في إبرة ماصة.  إذا كان هناك مقاومة ضد تدفق التعليق، واستخدام ملاقط غرامة لكسر طرف إبرة لتكبير القطر.
    6. إرفاق الحقنة إلى مضخة حقنة مجسمة.  تقدم الغطاس للتأكد من أن الجمعية مضخة حقنة يعمل بشكل صحيح.
    7. نقل الإبرة في إحداثيات للحقن.
      1. محاذاة طرف إبرة إلى بريما. تعيين إحداثيات X و Y إلى 0. ثم نقل طرف إبرة على استئصال الجمجمة إلى 2.0 مم الجانبية و -1.0 مم الخلفي إلى بريما.  المس طرف الإبرة إلى سطح الأم دورا وتعيين إحداثيات stereotaxic إلى Z = 0.
      2. دفع الغطاس لضمان تعليق الخلية تتدفق بشكل كاف قبل إدخال الإبرة في الدماغ.
      3. إدخال الإبرة في الدماغ إلى عمق Z = -1.4 ملم. هذه الإحداثيات stereotaxic وضع الكسب غير المشروع في الرمادي المسألة البيضاء الحدود من القشرة العميقة20.
    8. بدء ضخ الحقنة لضخ تعليق الخلية. تعيين جهاز ضبط الوقت مقاعد البدلاء المختبر إلى 15 دقيقة وبدء جهاز ضبط الوقت. استخدام مجهر مسافة العمل لمسافات طويلة لمراقبة تدفق تعليق الخلية.
      1. ري موقع الجراحة مع المالحة المعقمة أثناء الحقن للحفاظ على ترطيب الأنسجة.
      2. في 15 دقيقة، سحب ببطء إبرة زرع.  ري موقع الجراحة مع المالحة وإغلاق الشق مع الغرز.
    9. إجراء الرعاية بعد العملية الجراحية
      1. توقف عن التخدير تسليم CsA عن طريق الحقن تحت الجلد في سكرفي في 10 مغ/كغ جرعة. ضع الماوس في قفص نظيف ودافئ قبل العملية الجراحية.
      2. توفير مسكن أسيتامينوفين في مياه الشرب في 1.0 ملغ / مل.
        ملاحظة: توفير التسكين وفقا لبروتوكول التشغيل القياسي المناسب IACUC (SOP) ومراعاة متغيرات النتائج التجريبية.
      3. توفير قفص الحساء المبللة لاسترداد الأغذية للمساعدة في الإماهة والانتعاش.
  6. مواصلة حقن CsA اليومية في 10 ملغ / كغ طوال مدة بقاء الماوس.

3. لاصق اختبار إزالة الشريط من التكامل sensorimotor

  1. قطع الشريط الكهربائي إلى شرائط 3 مم × 5 مم باستخدام سكين حلاقة صغيرة قبل إجراء اختبار السلوك. استخدام سطح الزجاج على نحو سلس لقطع شرائط لاصقة.
    ملاحظة: استخدام الشريط الأصفر والأحمر، كما الفئران صعوبة في التمييز بين هذه الألوان21.
    1. حدد مرآة صغيرة تناسبها بشكل جيد داخل مربع من البلاستيك واضحة.
      1. إصلاح المرآة في مكان في زاوية 45 درجة تقريبا مع الطين النمذجة أو شريط لاصق من أجل عرض السلوك الحيواني من أدناه.
    2. ضع مربع ومرآة الجمعية على مقاعد البدلاء في غرفة اختبار السلوك مخصصة هادئة.  ترتيب الاسطوانة على مربع من البلاستيك فوق المرآة.
    3. ترتيب القماش التعامل، ملاقط، وشرائط لاصقة على مقاعد البدلاء بجوار مربع اختبار السلوك.
    4. تنظيف مربع واسطوانة مع 70٪ الإيثانول والمناشف الورقية.  السماح للأسطح لتجف تماما.
    5. أحضر الفئران إلى غرفة اختبار السلوك السماح للفئران بالتكيف مع غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل اختبار السلوك.
    6. إزالة إمدادات المياه من الأقفاص لتقليل أحداث التبول أثناء الاختبار، والتي يمكن أن تتداخل مع كفاءة أداء الاختبار.
  2. إجراء اختبار إزالة لاصقة
    ملاحظة: يتم تنفيذ اختبار السلوك هذا أفضل بواسطة اثنين إلى ثلاثة محققين: واحد لتشغيل ساعات التوقف و واحد أو اثنين لمعالجة الفئران ومراقبة السلوك.
    1. استخدام كل ملاقط لقشر شريط لاصق واحد من كل لون.
      1. اختيار لون الشريط الذي يتوافق مع الذي الصدارة وتبقى متسقة طوال المحاكمة.
    2. استخدام القماش التعامل مع لتقييد الماوس من قبل scruff من الرقبة والظهر بحيث يحمل الماوس الصدارة بعيدا عن جسدها ورأسه.
    3. استخدام ملاقط لوضع شريط لاصق على سطح الأخمص من كل الصدارة. استخدام ضغط إصبع حساسة ومتسقة لتأمين شرائط إلى الكفوف.
    4. وضع الماوس بسرعة في اسطوانة من البلاستيك. بدء اثنين من ساعات التوقف عندما يكون الماوس كل الكفوف الأربعة على مربع من البلاستيك.
    5. استخدام ساعتين لتسجيل latencies للأحداث الأربعة التالية: إشعار مخلب اليسار، وإزالة مخلب اليسار، وإشعار مخلب الحق، وإزالة مخلب الحق.
      1. تسجيل حدث إشعار عندما يجعل الحيوان الاعتراف لا لبس فيه من شريط لاصق عن طريق هز أو ترفرف مخلب أو عض الشريط.
      2. تسجيل حدث إزالة عندما يزيل الحيوان بشكل فعال الشريط من سطح الأخمص ية.
        ملاحظة: لا يتم استبعاد الحدث إزالة بواسطة الشريط قراءة أو إذا كان الشريط يتمسك السطح الجانبي للمقدمة.
      3. إيقاف جهاز ضبط الوقت في 120 ثانية إذا لم تتم إزالة الشريط المقابل.
      4. تسجيل الأوقات المنقضية للأحداث الأربعة على ورقة البيانات.
    6. إجراء تجربة ثانية على كل ماوس
      1. السماح لمدة لا تقل عن 5 دقائق أن ينقضي بين التجارب للماوس الفردية للحد من الإجهاد، والتي يمكن أن تتداخل مع الأداء الفعال في الاختبار.
      2. تنظيف الجهاز مع المناشف الورقية بين الفئران اختبار لإزالة النفايات عند اختبار الفئران متعددة من قفص واحد.
        1. تنظيف الجهاز جيدا مع الإيثانول 70٪ والمناشف الورقية عند اختبار الفئران من أقفاص متعددة.
      3. عكس ترتيب وضع اللون مخلب للمحاكمة الثانية من الدورة لعشوائية أي تأثير من اللون.
    7. حساب متوسط زمن الوصول لكل حدث بين تجربتين لكل جلسة يومية لكل الحيوان.
  3. تنظيف الجهاز والتعامل مع القماش جيدا بالماء، واستبدال إمدادات المياه قفص، وإعادة الفئران إلى مرفق الاحتجاز الخاصة بهم.
  4. كرر الخطوات 3.1-3.2 على النقاط الزمنية التجريبية المتتابعة لتصميم تجريبي التدابير المتكررة.
    ملاحظة: كرر الخطوات 3-2-1-3-2-5-3 يومياً لمدة 5 أيام قبل أي جمع بيانات لتكيف الحيوانات مع المهمة. يوصى بالحصول على بيانات خط الأساس قبل الجراحة.

4. Diaminobenzidine (DAB) التحليل المناعي الهيسيكيميائي للبقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع والأمراض الإصابة

  1. قتل الحيوانات وإجراء التسريب عبر العضلة.
    1. إعداد حلول من 0.1 M الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) و 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في PBS. موازنة الوظيفة الهيدروجينية لكلا الحلين إلى 7.4.
    2. وضع الحلين على الجليد في غطاء محرك السيارة الدخان. وضع مضخة التمعجية في غطاء محرك الدخان، وتشغيل المضخة لملء الأنابيب مع PBS. تعيين معدل تدفق المضخة إلى ~ 7 مل / دقيقة.  قم بتوصيل إبرة 25 G إلى أنبوب تدفق المضخة.
    3. ضع صينية تصريف مع الركيزة الناعمة في غطاء محرك السيارة. رفع نهاية واحدة من علبة في زاوية طفيفة بحيث السوائل التسريب استنزاف إلى الطرف السفلي.
    4. ضع الماوس في غرفة التخدير التعريفي. ملء الغرفة مع 4٪ isoflurane باستخدام ضغط 100٪ غاز السيارة الأكسجين.
    5. نقل الماوس مخدر من الغرفة إلى مخروط الأنف التخدير. تقليل الإيسوفلوران إلى 2٪.
    6. إجراء استئصال الصدر لفضح القلب. توقف عن التخدير، حيث أن استئصال الصدر يسبب القتل الرحيم.
    7. ضع إبرة تدفق مضخة التسريب بعناية في البطين الأيسر على طول المحور الطويل للقلب. لا تخترق الحاجز القلب، وهذا سوف يسبب التسريب الفقراء.
    8. استخدام مقص صغير لقطع الأذين الأيمن، ثم تشغيل على الفور على مضخة التمعجي.
    9. استمر في تدفق PBS حتى يتم إزالة السائل الذي يغادر الأذين الأيمن من الدم.
      1. أطفئ المضخة نقل أنبوب مدخول المضخة إلى حاوية PFA. أعد تشغيل المضخة. استمر في دمج PFA حتى يكون الحيوان جامدًا بما فيه الكفاية أو حتى يتم ضخ حجم 20 مل من خلال.
      2. أطفئ المضخة إزالة إبرة تدفق من القلب. نقل أنبوب تناول من PFA إلى PBS، وطرد تماما PFA من الأنابيب.
  2. إزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق تشريح دقيق. وضع الدماغ في حاوية صغيرة مليئة 4٪ بارافورمالدهايد، والسماح للدماغ لإصلاح ما بعد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  3. في اليوم التالي بعد التثبيت، استبدال P مع PBS و 0.1٪ أزيد الصوديوم. تخزين العقول في هذا الحل حتى التحضير للقسم الأنسجة.
  4. جمع 40-50 درجة مئوية أقسام من أنسجة الدماغ الفورمالديهايد ثابتة عن طريق microtome تجميد أو درجة حرارة الغرفة تهتز.
  5. الأنسجة تراجع في بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ في الماء لتعطيل بيروكسيداسيس الذاتية، والتي يمكن أن تنتج تلطيخ غير محدد.
  6. إجراء استرداد مستضد باستخدام حمض الستريك العازلة (10 MM سيترات الصوديوم، 0.05٪ بوليسوربات-20، درجة الحموضة 6.0) في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. إجراء وضع العلامات على الأجسام المضادة بالطرق القياسية.  الرجوع إلى لوندل وآخرون. s التقرير22 من هذا المختبر لمزيد من التفاصيل.
    1. استخدم مجموعة إبطال IgG للماوس (راجع جدولالمواد) لتقليل التفاعل المتبادل مع الأجسام المضادة الذاتية. احتضان الأنسجة في المخزن المؤقت تحييد IgG لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT)، باتباع توجيهات الشركة المصنعة.
    2. استخدام الأجسام المضادة للمستضد النووي المضادة للإنسان (hNA؛ 1:500 تخفيف) عند زرع الخلايا المشتقة من iPSC الإنسان لتحديد موقع الخلايا المزروعة. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة باستخدام التحريض لطيف.
    3. بعد الإنزلاق بعيدا ً عن محلول الأجسام المضادة الأولي، احتضن الأنسجة مع الأجسام المضادة للماوس المضادة للماوس المترافقة بـ HRP في 1:250 تخفيف لمدة 2 ساعة في RT.
    4. أداء تفاعل كروموجين DAB بالطرق القياسية للكشف عن وضع العلامات المناعية. السماح رد فعل DAB لتطوير لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT.
  8. قم بإرفاق الأنسجة الملونة بالشرائح وتطبيق قسائم الغطاء باستخدام الأساليب القياسية.
  9. قياس أعداد الخلايا المسماة باستخدام الاستريولوجية غير المتحيزة كما هو موضح سابقا23،24. إجراء تحليل باستخدام 20 ميكرومتر المقاطع البصرية والفاصل الزمني بين القسم من ثلاثة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تسهل جراحة استئصال الجمجمة إصابة الدماغ التجريبية وزرع الخلايا العلاجية: يتطلب نموذج التأثير القشري الخاضع للرقابة لإصابة الدماغ والعلاج اللاحق لزراعة الخلايا إزالة دقيقة للجمجمة المنضوية. يمكن إجراء استئصال الجمجمة على أي سطح الظهر من الجمجمة للسماح بالتلاعب إلى منطقة الدماغ ذات الاهتمام. يصور الرسم التخطيطي في الشكل 1 مخطط استئصال الجمجمة قطره 5 مم للكشف عن القشريات الحسية الجسدية والحركية الأولية (الشكل1ألف). في 24 ح بعد استئ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

CCI خفيفة كنظام نموذجي لاختبار العلاج التجديدي التجريبي
نموذج CCI هو أداة قيمة للتحقيق في آليات اختلال وظائف الأنسجة بعد الإصابة الميكانيكية في القشرة. قابلية المعلمات الإصابة هي سمة جذابة من هذا النموذج. تغيير عمق Z من التأثير، وسرعة، أو وقت يسكن يمكن أن تزيد أو تقلل من شدة الإصابة على النحو المطلوب من قبل المحقق10،25. نموذج CCI خفيفة من إصابة الدماغ الملتوية, عندما أجريت بشكل صحيح, ينبغي أن يسبب موت الخلايا القشرية متواضعة والحد الأدنى من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من مركز علم الأعصاب والطب التجديدي (CNRM، رقم المنحة G170244014). ونحن نقدر مساعدة ماهيما ديوان وكلارا سيلبريد في الدراسات التجريبية إزالة لاصقة. أجرى كريسلين رادومسكي إصابات أولية في الدماغ وعمليات زرع خلايا. قدمت أماندا فو ولورا تاكر من مختبر الدراسات الأساسية للدراسات ما قبل السريرية في جامعة الولايات المتحدة الوطنية للدراسات ما قبل السريرية نصائح قيمة حول العمليات الجراحية الحيوانية واختبار السلوك، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل محاقنبيكتون ديكنسون (BD)  ؛ 309659
1.7 مل أنابيب اختبار فليب توب DenvilleC2170
10 حقنة ميكرولترهاميلتون7635-01
25G إبر حقنة انزلاقية دقيقةBecton Dickinson (BD)  ؛ 305122
70٪ إيثانولالمنتج المفضل ؛ يختلف حسب المنطقة
تعليق الأسيتامينوفين عن طريق الفمتايلينول (للأطفال)مخفف إلى 1 مجم / مل في
مبخر مخدرVetland521-11-22
قماششراء من متجر
BetadinePurdue ProductsNDC-67618-151-32
الأكسجينالمنتج المفضل ؛ يختلف حسب المنطقة
سيكلوسبورين ASigma-Aldrich30024-100mg
DAB طقم تلطيخمختبرات ناقلاتSK-4100
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418-500 مل
DMEMInvitrogen (ThermoFisher)A14430-01
الحمار المضاد للفأر الجسم المضاد IgG ، HRP المترافقJackson ImmunoResearch715-035-151
الشريط الكهربائي3M Corporationالشراء من الملقط
الناعممتعدد الأقسام أدوات العلوم الدقيقة11254-20
ملقطأدوات العلوم الدقيقة91106-12
ماصات شعرية زجاجية ، 1 مم OD ، معرف 0.58 ممأدوات الدقة العالمية1B100F-3
طقم المحركات الدقيقة الدوارة عالية السرعةForedom Electric Co. K.1070 - K.107018
مجموعة مثالية من 5نقاط خلية علمية & nbsp ؛60-1000
تجسيمي ل CCI & nbsp ؛Leica Biosystems39463920
isofluraneBaxterNDC-10019-360-60
مؤقتات مقاعد البدلاءالمختبرية Fisher Scientific14-649-17
مجتذب MicropipetteInstruments، Inc.PMP-102أي مجتذب سوف يكفي
زلات غطاء المجهرFisherbrand12-545-E
المجهر شريحة تركيب متوسطالمنتج من اختيار
المرآةشراء من متجر متعدد الأقسام
الماوس المضاد للإنسان المستضد النووي الأجسام المضادةMilliporeMAB1281
الماوس على الماوس حجب كيتناقلات مختبراتBMK-2202
حامل إبرة hemostatأدوات العلوم الدقيقة12002-12
مرهم العيونFalcon PharmaceuticalsNDC-61314-631-36
مقص زنبركي للعيونأدوات العلوم الدقيقة15018-10
صندوقالشراء من متجر متعدد الأقسام
اسطوانةالشراء من متجر متعدد الأقسام
QSI مضخة حقنة آليةStoelting53311
ضغط إبرة قابلة للإزالةهاميلتون55750-01
إطار تجسيمي صغير للقوارضStoelting51925
مقص صغيرأدوات العلومالدقيقة 14060-09
StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher)A1110501
ضمادات تحضير الكحول المعقمةFisherbrand06-669-62
مسحات قطنية معقمة / Kendall Q-tipsTyco Healthcare540500
ExtileSaline HospiraNDC-0409-1966-07
ساعات توقيت (2)فيشر ساينتفيك06-662-56
شرائح مجهر Superfrost PlusGold Fisherbrand15-188-48
خيوط خيوط - 5.0 حرير بإبرة منحنيةOasisMV-682
مائي مناولة المضغوط في المتجر تأثير واحد تأثير بلاستيكي بلاستيكية تركيب

المراجع

  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  2. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
  3. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
  4. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
  5. Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
  6. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781(2014).
  7. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  8. Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280(2014).
  9. Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
  10. Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142(2013).
  11. Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
  12. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
  13. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
  14. Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
  15. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  17. Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
  18. Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
  19. Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303(2013).
  20. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
  21. Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
  22. Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
  23. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
  24. Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
  25. Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
  26. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  27. Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
  28. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232(2014).
  29. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
  30. Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
  31. Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
  32. Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
  33. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
  34. Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
  35. Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
  36. Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
  37. Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج تأثير القشرية الخاضعة للرقابة لإصابة الدماغ الماوس مع زرع العلاجية من الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.