نموذج تأثير القشرية الخاضعة للرقابة لإصابة الدماغ الماوس مع زرع العلاجية من الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان

إصابة الدماغ الصادمة (TBI) هو مصطلح عام للإصابة المكتسبة في الدماغ بسبب إما القوى الميكانيكية غير المباشرة (تسارع الدوران / التباطؤ أو العكس الانقلاب) من ضربات على الرأس أو ضرر مباشر من الأجسام أو موجات الانفجار. وقد قُدِّر أن هذه الظاهرة هي السبب في حوالي 9 في المائة من الوفيات في جميع أنحاء العالم، وقد لوحظت في ما يقدر بنحو 50 مليون حالة في السنة¹و2. وقدر تقرير صدر في عام 2017 عن مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها أنه في عام 2013، كان هناك ما مجموعه 2.8 مليون زيارة ووفاة في المستشفيات بسبب TBI في الولايات المتحدة³. ولا يتم الإبلاغ عن العديد من التّبع السل الأكثر اعتدالاً كل عام. TBI خطيرة يمكن أن يؤدي إلى ضعف مدى الحياة من الإدراك، وظيفة المحرك، ونوعية الحياة عموما. عواقب TBI خفيفة، وخاصة المتكررة المتصلة بالرياضة TBI، وقد تمتقدير ها فقط في الآونة الأخيرة لآثارها الصحية الغادرة 4،⁵.

النمذجة قبل السريرية هو عنصر حيوي لتطوير رؤى ميكانيكية جديدة والعلاج التصالحية المحتملة لTBI. تأثير القشرية الخاضعة للرقابة (CCI) نموذج TBI هو نموذج مفتوح الرأس من إصابة كدمة ميكانيكية إلى القشرة. يمكن تعديل معلمات التأثير لإنتاج إصابات CCI التيتتراوح من خفيفة إلى شديدة 6. إصابات CCI هي مركز ية بدلا من نشرها، كما رأينا مع نماذج أخرى من الرأس المغلقة من TBI. ويمكن إجراء CCI للحث على إصابة من جانب واحد، بحيث القشرة التعارضية يمكن أن تكون بمثابة الخدمة المدنية المتخذة أساسا للمقارنة الداخلية. يوضح هذا البروتوكول خصائص CCI خفيفة لجزء من القشرة التي تشمل المناطق الحسية الجسدية الأولية والحركية. وقد تم اختيار هذه المنطقة القشرية لمشاركتها في السلوكيات الحسية الحركية التي يمكن للعديد من اختبارات السلوك الكشف عن العجز الناجم عن الإصابة⁷. يمكن الكشف عن التحسينات السلوكية بسبب التدخلات العلاجية لTBI، وكذلك.

ومن السمات المميزة لـ TBI الخلل العصبي الواسع الانتشار في المنطقة المصابة. الخلايا العصبية المصابة تخضع لوفاة الخلية، ويتم تعطيل اتصال شبكة الخلايا العصبية^8،9. TBI يعطل تجنيد الخلايا الجذعية الذاتية، مما يؤدي إلى مزيد من العجز السلوك المصب^10،11.  وقد تم استكشاف زرع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا كإمكانية لاستعادة وظيفة في الدماغ المصاب. بالإضافة إلى إمكانية استعادة الدوائر العصبية التالفة، الخلايا المزروعة ممارسة آثار الباراكرين التي تعزز بقاء الخلايا العصبية والانتعاش الوظيفي من TBI¹². وقد تم زرع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا قبل السريرية لتقييم إمكاناتها التصالحية في نماذج من الاضطرابات العصبية^13،14،15. وقد أدى تعميم تكنولوجيا الخلايا الجذعية المتعددة القوى المستحثة¹⁶ في الآونة الأخيرة إلى تيسير تطوير العديد من خطوط الخلايا الجذعية البشرية للاستخدام التجريبي. اختبار ما قبل السريرية مع الخلايا المشتقة hiPSC هو خطوة أولى هامة لوصف فعالية خط خلية معينة العلاجية المحتملة ضد الأمراض البشرية. وقد وضع هذا المختبر بروتوكولات للتمييز hiPSCs إلى الأنماط الظاهرية العصبية¹⁷ سعيا وراء الخلايا القابلة للزرع للمساعدة في الانتعاش من إصابات الدماغ الصادمة.

التجارب في هذا البروتوكول استخدام CCI من جانب واحد للحث TBI إلى القشرة الحسية الجسدية اليسرى والحركية للفئران البالغة. إصابة CCI خفيفة يؤدي إلى عجز وظيفي مستمر في الصدارة اليمنى التي تستخدم لتتبع آثار الطعوم الخلية العصبية المستمدة من hiPSC على الانتعاش الوظيفي. تم تكييف اختبار الـ Forepaw sensorimotor في هذا البروتوكول من المنهجية التي وضعها بويت وزملاؤه¹⁸ وأثبتها سابقا فليمينغ وزملاؤه¹⁹.  يحدد هذا البروتوكول سير عمل كامل لإجراء إصابة الدماغ التجريبية، وزرع العلاجية من خلايا hiPS، والتحليل السلوكي والأنسجة من مقاييس النتائج التجريبية.

وقد استعرضت لجنة الرعاية والاستخدام الحيوانية التابعة لجامعة الخدمات النظامية جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول ووافقت عليها.

1. استئصال الجمجمة وتأثير القشرية الخاضعة للرقابة

1. إعداد جهاز التأثير القشري الخاضع للرقابة واللوازم الجراحية.
   1. تحميل 1 مل زلة طرف حقنة مع 0.5 مل من المالحة المعقمة لري الجرح. إرفاق إبرة 25 G إلى حقنة للسيطرة على الري.
   2. إعداد محلول مخفف من CsA في DMSO إلى التركيز النهائي من 1 ملغ / مل. قم بتحميل حقنة ثانية بطرف 1 مل مع 0.5 مل من السيكلوسبورين A (CsA) الحل لقمع المناعة. إرفاق إبرة 25 G أو أكبر إلى حقنة CsA.
   3. قم بإرفاق مكبس الصدمات القشرية الخاضع للرقابة بذراع على إطار مجسم ومجموعة إلى زاوية 15 درجة. قم بإرفاق مسبار منتاق 3 مم بالمكبس.
   4. تعيين سرعة الارتطام إلى 1.5 م / ث ويسكن تأثير الوقت إلى 0.1 ث لإنتاج إصابة القشرية خفيفة.
2. إجراء عملية استئصال الجمجمة من جانب واحد
   1. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير المتصلة بمرذاذ الإسيوفرلوران مع مصدر الأكسجين المضغوط. حث التخدير مع ~ 3٪ isoflurane في ~ 0.7 L / دقيقة الأكسجين. تحقق من عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة اصبع القدم.
   2. انزعي فروة الرأس باستخدام كليبرز كهربائي وامسحي أي فرو فضفاض.
   3. ضع الماوس في إطار مجسم مع مخروط أنف التسليم مخدر المرفقة.
      1. ضع لوحة الاحترار إلى 37 درجة مئوية على الإطار المجسم تحت الماوس للحفاظ على درجة حرارة الجسم تحت التخدير. إصلاح الرأس في مكان مع قضبان الأذن وشريط لدغة وتوجيه الرأس بحيث العظام الأمامية الجمجمة أفقي. الحفاظ على التخدير في ~ 1.5٪ -2٪ isoflurane لمدة الجراحة.
   4. لإجراء الرعاية قبل الجراحة والإعداد الجراحي العقيم، وتطبيق مرهم العين المضادات الحيوية للعيون باستخدام مسحة القطن المعقمة. تطبيق حل يستند إلى اليود على منطقة فروة الرأس حلق. إزالة هذا مع الإيثانول 70٪. تغطية الحيوان مع الستائر الجراحية fenestrated بحيث الجزء العلوي من الرأس مرئية ولكن يتم تغطية العينين.
   5. قم بعمل شق خط الوسط (1.5-2 سم) على فروة الرأس باستخدام مشرط أو مقص.  استخدام مسحات القطن المعقمة لتنظيف الجرح ولمسح اللفافة اليسرى من خط الوسط في بريما.
   6. استخدم مسبار الصدم لتحديد موقع استئصال الجمجمة.
      1. تعيين نقطة مرجعية مجسمة (X = 0، Y = 0) إلى bregma.  ضبط التحقيق أفقيا إلى 2 مم اليسار من خط الوسط. قم برسم دائرة قطرها 5 مم حول المسبار باستخدام علامة آمنة جراحياً فائقة البقشيش. رفع وتدوير تأثير خارج الموقف.
   7. استخدام عالية السرعة أداة اليد مجموعة السيارات الدقيقة الدوارة لجعل ثقب مفتوح في الجمجمة باستخدام جولة طرف 0.6 مم أو 0.8 مم لدغ الحفر بت في ~ 70٪ -80٪ السرعة القصوى. تطبيق الضغط الخفيف على الجمجمة أثناء الحفر على طول مخطط محيطي 5 ملم لرقيقة هذه الحدود.
      1. لا تطبق الضغط الزائد أثناء الحفر. وهذا يمكن أن يسبب إصابة القشرية بسبب الاهتزاز, ضغط, أو الاختراق العرضي. السماح لسرعة بت الحفر للقيام بالعمل.
      2. لا حفر في أي بقعة معينة لفترة طويلة جدا لتجنب ارتفاع درجة حرارة الاحتكاك من الجمجمة. ري استئصال الجمجمة في بعض الأحيان مع محلول ملحي معقم لإزالة الحطام والحد من التدفئة من أداة دوارة.
      3. إيلاء اهتمام وثيق أثناء الحفر على خط خياطة الإكليل لأن هذه النقاط عرضة للنزيف.
   8. استخدام زوج من ملاقط غرامة لإزالة رفرف الجمجمة عندما يتم رقيق مخطط استئصال الجمجمة بما فيه الكفاية. أمسك الرفرف بشكل ميدي، ورفع ويسحب بلطف أفقيا ً بحركة شعاعية.
      1. لا تضر الأم دورا عند رفع رفرف. وهذا يمكن أن يسبب إصابات خطيرة ونزيف.
3. إجراء إصابة خفيفة في تأثير القشرية الخاضعة للرقابة
   1. تنظيف التحقيق تأثير مع وسادة الكحول معقمة الإعدادية. نقل التحقيق تأثير مرة أخرى إلى موقف على القشرة المكشوفة. خفض التحقيق حتى يمس سطح الأم دورا. وضع علامة على هذا الموضع كـ Z = 0.
   2. سحب المكبس والانتقال إلى Z = -1.0 ملم.
   3. رفع المكبس بسرعة ونقل الذراع من الموقف. تطبيق كميات سخية من المالحة لري القشرة بعد الإصابة. شطف موقع الجراحة مع المالحة حسب الحاجة وخياطة شق فروة الرأس باستخدام stiches توقف بسيطة مع خياطة الحرير 5.0.
4. إجراء الرعاية بعد العملية الجراحية على الماوس
   1. توقف عن التخدير تسليم CsA عن طريق الحقن تحت الجلد في سكرفي في 10 مغ/كغ جرعة. ضع الماوس في قفص نظيف ودافئ قبل العملية الجراحية.
   2. توفير مسكن أسيتامينوفين في مياه الشرب في 1.0 ملغ / مل.
      ملاحظة: توفير التسكين وفقا لإجراءات التشغيل القياسية IACUC المناسبة ومراعاة متغيرات النتائج التجريبية (على سبيل المثال، التخدير، التهاب الأعصاب).
   3. توفير الطعام تشاو مبللة في قفص الانتعاش الدافئة للمساعدة في الإماهة والانتعاش.
5. انتقل من القسم 2 إلى القسم 4 أعلاه عند إجراء عمليات التحكم في استئصال الجمجمة فقط (الشام).

2. زرع مجسمة من تعليق الخلية

1. بدء عملية زرع الخلايا حوالي 24 ساعة بعد استئصال الجمجمة.
2. إعداد معدات زرع الخلايا واللوازم الجراحية
   1. ملء حقنة 1 مل زلة طرف مع المالحة معقمة لري الجرح. إرفاق إبرة 25 G إلى حقنة للسيطرة على الري.
   2. ملء 1 مل زلة طرف حقنة مع محلول CsA لقمع المناعة. إرفاق إبرة 25 G أو أكبر إلى حقنة CsA. إعادة ملء حقنة CsA حسب الحاجة بين العمليات الجراحية.
   3. إعداد الإبر الزجاجية من 1.0 مم OD البورسليكات الزجاج الماصات الشعرية باستخدام الأساليب القياسية.
   4. استخدام ملاقط غرامة لكسر نصائح إبرة إلى ما يقرب من 200 ميكرومتر قطرها. تأكد من أن رمح أسطواني من الإبرة لا يزيد عن 2.5 سم.
3. معايرة مضخة الحقنة للاستخدام مع حقنة 10 ميكرولتر.  أدخل معدل تدفق قدره 0.2 ميكرولتر/دقيقة لتقديم حجم إجمالي قدره 2.0 ميكرولتر.
4. إعداد تعليق الخلايا الجذعية متعددة القوى (iPSC) المستحثة من قبل الإنسان.
   1. قم بإجراء جميع عمليات معالجة الخلايا في غطاء محرك السيارة BSL-2 باستخدام تقنيات المناولة العقيمة القياسية.
   2. إعداد ثقافات الخلايا مسبقًا وفقًا للشروط القياسية المحددة لنوع الخلية. يرجى الرجوع إلى ليستشكا وآخرون¹⁷ كمثال على ذلك.
      ملاحظة: استخدمت التجارب الموضحة في هذه المظاهرة مختلف الخلايا الظاهرية العصبية المشتقة من hiPSCs.
   3. فكّن الخلايا برفق إلى تعليق خلية واحدة باستخدام حل مفرزة الخلايا، أو أي وسائل الأنزيمية أو الكيميائية المفضلة الأخرى.
   4. عد الخلايا في التعليق، ثم تمييع التعليق إلى 5 × 10⁴ خلايا / ميكرولتر في الحد الأدنى من خلية الثقافة المتوسطة (على سبيل المثال، DMEM) في أنبوب اختبار الوجه 1.7 مل الأعلى.
   5. لاحظ الملاحظات التالية للزرع:
      1. الحفاظ على الخلايا في تعليق في 37 درجة مئوية لمدة الإجراءات.
      2. تحميل الحقنة فقط مباشرة قبل إجراء الحقن intraparenchymal (الخطوة 4.5 أدناه).
         ملاحظة: الجاذبية يمكن أن يسبب تعليق الخلية لتسوية أو التشبث إلى جانب الحقنة إذا وضعت على جانبها. وهذا يؤدي إلى مخالفات في عدد الخلايا التي يتم حقنها.
      3. تخصيص ~ 5 × 10⁵ خلايا (تعليق 10 درجة مئوية) لكل ماوس إذا كان إجراء عمليات زرع الخلايا متعددة في يوم واحد.
5. إجراء جراحة زرع التاكسي المجسم
   1. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير المتصلة بمرذاذ الإسيوفرلوران مع مصدر الأكسجين المضغوط. حث التخدير مع ~ 3٪ isoflurane في ~ 0.7 L / دقيقة الأكسجين.
   2. ضع الماوس في إطار مجسم مع مخروط الأنف مخدر المرفقة.
      1. إصلاح الرأس في مكان مع قضبان الأذن وشريط لدغة وتوجيه الرأس بحيث العظام الأمامية الجمجمة أفقي. الحفاظ على التخدير في ~ 1.5٪ -2٪ isoflurane لمدة الجراحة.
   3. إجراء الرعاية قبل الجراحة وإعداد العقيم
      1. تطبيق مرهم العيون ترطيب تحتوي على المضادات الحيوية للعيون باستخدام مسحة القطن.
      2. غسل موقع الشق مع المالحة المعقمة لتنظيف الموقع وتخفيف الغرز. ضعي الإيثانول برفق 70% مع مسحة قطنية لتعقيم موقع الشق.
   4. إزالة الغرز باستخدام ملاقط غرامة ومقص العيون. موقع جراحة الري واستئصال الجمجمة مع محلول ملحي معقم وفير.
      1. النظر في الحيوان للاستبعاد إذا كانت القشرة يعرض خصائص غير مؤهلة بما في ذلك الفتق المفرط، وتغير اللون، والأوعية الدموية تعطلت، أو نزيف.
   5. تحميل حقنة زرع الخلية
      1. نقل تعليق الخلية من حاضنة 37 درجة مئوية إلى غطاء محرك السيارة سلامة حيوية ثقافة الخلية. تدور بلطف أو اضغط على الأنبوب لضمان تعليق خلية متجانسة.
      2. استخدام pipettor الصغيرة لتحميل ~ 7.5 درجة مئوية تعليق الخلية في حقنة هاملتون من خلال نهاية الغطاس.
         1. عقد حقنة في زاوية ~ 120 درجة مع نهاية الغطاس التي تواجه أسفل. إدراج الغطاس، مع الحرص على عدم إدخال فقاعة الهواء بين التعليق وطرف الغطاس.
      3. إرفاق الجمعية طوقا إلى إبرة ماصة، ثم إرفاق الإبرة إلى الحقنة.
      4. دفع الغطاس لنقل تعليق الخلية في إبرة ماصة.  إذا كان هناك مقاومة ضد تدفق التعليق، واستخدام ملاقط غرامة لكسر طرف إبرة لتكبير القطر.
   6. إرفاق الحقنة إلى مضخة حقنة مجسمة.  تقدم الغطاس للتأكد من أن الجمعية مضخة حقنة يعمل بشكل صحيح.
   7. نقل الإبرة في إحداثيات للحقن.
      1. محاذاة طرف إبرة إلى بريما. تعيين إحداثيات X و Y إلى 0. ثم نقل طرف إبرة على استئصال الجمجمة إلى 2.0 مم الجانبية و -1.0 مم الخلفي إلى بريما.  المس طرف الإبرة إلى سطح الأم دورا وتعيين إحداثيات stereotaxic إلى Z = 0.
      2. دفع الغطاس لضمان تعليق الخلية تتدفق بشكل كاف قبل إدخال الإبرة في الدماغ.
      3. إدخال الإبرة في الدماغ إلى عمق Z = -1.4 ملم. هذه الإحداثيات stereotaxic وضع الكسب غير المشروع في الرمادي المسألة البيضاء الحدود من القشرة العميقة²⁰.
   8. بدء ضخ الحقنة لضخ تعليق الخلية. تعيين جهاز ضبط الوقت مقاعد البدلاء المختبر إلى 15 دقيقة وبدء جهاز ضبط الوقت. استخدام مجهر مسافة العمل لمسافات طويلة لمراقبة تدفق تعليق الخلية.
      1. ري موقع الجراحة مع المالحة المعقمة أثناء الحقن للحفاظ على ترطيب الأنسجة.
      2. في 15 دقيقة، سحب ببطء إبرة زرع.  ري موقع الجراحة مع المالحة وإغلاق الشق مع الغرز.
   9. إجراء الرعاية بعد العملية الجراحية
      1. توقف عن التخدير تسليم CsA عن طريق الحقن تحت الجلد في سكرفي في 10 مغ/كغ جرعة. ضع الماوس في قفص نظيف ودافئ قبل العملية الجراحية.
      2. توفير مسكن أسيتامينوفين في مياه الشرب في 1.0 ملغ / مل.
         ملاحظة: توفير التسكين وفقا لبروتوكول التشغيل القياسي المناسب IACUC (SOP) ومراعاة متغيرات النتائج التجريبية.
      3. توفير قفص الحساء المبللة لاسترداد الأغذية للمساعدة في الإماهة والانتعاش.
6. مواصلة حقن CsA اليومية في 10 ملغ / كغ طوال مدة بقاء الماوس.

3. لاصق اختبار إزالة الشريط من التكامل sensorimotor

1. قطع الشريط الكهربائي إلى شرائط 3 مم × 5 مم باستخدام سكين حلاقة صغيرة قبل إجراء اختبار السلوك. استخدام سطح الزجاج على نحو سلس لقطع شرائط لاصقة.
   ملاحظة: استخدام الشريط الأصفر والأحمر، كما الفئران صعوبة في التمييز بين هذه الألوان²¹.
   1. حدد مرآة صغيرة تناسبها بشكل جيد داخل مربع من البلاستيك واضحة.
      1. إصلاح المرآة في مكان في زاوية 45 درجة تقريبا مع الطين النمذجة أو شريط لاصق من أجل عرض السلوك الحيواني من أدناه.
   2. ضع مربع ومرآة الجمعية على مقاعد البدلاء في غرفة اختبار السلوك مخصصة هادئة.  ترتيب الاسطوانة على مربع من البلاستيك فوق المرآة.
   3. ترتيب القماش التعامل، ملاقط، وشرائط لاصقة على مقاعد البدلاء بجوار مربع اختبار السلوك.
   4. تنظيف مربع واسطوانة مع 70٪ الإيثانول والمناشف الورقية.  السماح للأسطح لتجف تماما.
   5. أحضر الفئران إلى غرفة اختبار السلوك السماح للفئران بالتكيف مع غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل اختبار السلوك.
   6. إزالة إمدادات المياه من الأقفاص لتقليل أحداث التبول أثناء الاختبار، والتي يمكن أن تتداخل مع كفاءة أداء الاختبار.
2. إجراء اختبار إزالة لاصقة
   ملاحظة: يتم تنفيذ اختبار السلوك هذا أفضل بواسطة اثنين إلى ثلاثة محققين: واحد لتشغيل ساعات التوقف و واحد أو اثنين لمعالجة الفئران ومراقبة السلوك.
   1. استخدام كل ملاقط لقشر شريط لاصق واحد من كل لون.
      1. اختيار لون الشريط الذي يتوافق مع الذي الصدارة وتبقى متسقة طوال المحاكمة.
   2. استخدام القماش التعامل مع لتقييد الماوس من قبل scruff من الرقبة والظهر بحيث يحمل الماوس الصدارة بعيدا عن جسدها ورأسه.
   3. استخدام ملاقط لوضع شريط لاصق على سطح الأخمص من كل الصدارة. استخدام ضغط إصبع حساسة ومتسقة لتأمين شرائط إلى الكفوف.
   4. وضع الماوس بسرعة في اسطوانة من البلاستيك. بدء اثنين من ساعات التوقف عندما يكون الماوس كل الكفوف الأربعة على مربع من البلاستيك.
   5. استخدام ساعتين لتسجيل latencies للأحداث الأربعة التالية: إشعار مخلب اليسار، وإزالة مخلب اليسار، وإشعار مخلب الحق، وإزالة مخلب الحق.
      1. تسجيل حدث إشعار عندما يجعل الحيوان الاعتراف لا لبس فيه من شريط لاصق عن طريق هز أو ترفرف مخلب أو عض الشريط.
      2. تسجيل حدث إزالة عندما يزيل الحيوان بشكل فعال الشريط من سطح الأخمص ية.
         ملاحظة: لا يتم استبعاد الحدث إزالة بواسطة الشريط قراءة أو إذا كان الشريط يتمسك السطح الجانبي للمقدمة.
      3. إيقاف جهاز ضبط الوقت في 120 ثانية إذا لم تتم إزالة الشريط المقابل.
      4. تسجيل الأوقات المنقضية للأحداث الأربعة على ورقة البيانات.
   6. إجراء تجربة ثانية على كل ماوس
      1. السماح لمدة لا تقل عن 5 دقائق أن ينقضي بين التجارب للماوس الفردية للحد من الإجهاد، والتي يمكن أن تتداخل مع الأداء الفعال في الاختبار.
      2. تنظيف الجهاز مع المناشف الورقية بين الفئران اختبار لإزالة النفايات عند اختبار الفئران متعددة من قفص واحد.
         1. تنظيف الجهاز جيدا مع الإيثانول 70٪ والمناشف الورقية عند اختبار الفئران من أقفاص متعددة.
      3. عكس ترتيب وضع اللون مخلب للمحاكمة الثانية من الدورة لعشوائية أي تأثير من اللون.
   7. حساب متوسط زمن الوصول لكل حدث بين تجربتين لكل جلسة يومية لكل الحيوان.
3. تنظيف الجهاز والتعامل مع القماش جيدا بالماء، واستبدال إمدادات المياه قفص، وإعادة الفئران إلى مرفق الاحتجاز الخاصة بهم.
4. كرر الخطوات 3.1-3.2 على النقاط الزمنية التجريبية المتتابعة لتصميم تجريبي التدابير المتكررة.
   ملاحظة: كرر الخطوات 3-2-1-3-2-5-3 يومياً لمدة 5 أيام قبل أي جمع بيانات لتكيف الحيوانات مع المهمة. يوصى بالحصول على بيانات خط الأساس قبل الجراحة.

4. Diaminobenzidine (DAB) التحليل المناعي الهيسيكيميائي للبقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع والأمراض الإصابة

1. قتل الحيوانات وإجراء التسريب عبر العضلة.
   1. إعداد حلول من 0.1 M الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) و 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في PBS. موازنة الوظيفة الهيدروجينية لكلا الحلين إلى 7.4.
   2. وضع الحلين على الجليد في غطاء محرك السيارة الدخان. وضع مضخة التمعجية في غطاء محرك الدخان، وتشغيل المضخة لملء الأنابيب مع PBS. تعيين معدل تدفق المضخة إلى ~ 7 مل / دقيقة.  قم بتوصيل إبرة 25 G إلى أنبوب تدفق المضخة.
   3. ضع صينية تصريف مع الركيزة الناعمة في غطاء محرك السيارة. رفع نهاية واحدة من علبة في زاوية طفيفة بحيث السوائل التسريب استنزاف إلى الطرف السفلي.
   4. ضع الماوس في غرفة التخدير التعريفي. ملء الغرفة مع 4٪ isoflurane باستخدام ضغط 100٪ غاز السيارة الأكسجين.
   5. نقل الماوس مخدر من الغرفة إلى مخروط الأنف التخدير. تقليل الإيسوفلوران إلى 2٪.
   6. إجراء استئصال الصدر لفضح القلب. توقف عن التخدير، حيث أن استئصال الصدر يسبب القتل الرحيم.
   7. ضع إبرة تدفق مضخة التسريب بعناية في البطين الأيسر على طول المحور الطويل للقلب. لا تخترق الحاجز القلب، وهذا سوف يسبب التسريب الفقراء.
   8. استخدام مقص صغير لقطع الأذين الأيمن، ثم تشغيل على الفور على مضخة التمعجي.
   9. استمر في تدفق PBS حتى يتم إزالة السائل الذي يغادر الأذين الأيمن من الدم.
      1. أطفئ المضخة نقل أنبوب مدخول المضخة إلى حاوية PFA. أعد تشغيل المضخة. استمر في دمج PFA حتى يكون الحيوان جامدًا بما فيه الكفاية أو حتى يتم ضخ حجم 20 مل من خلال.
      2. أطفئ المضخة إزالة إبرة تدفق من القلب. نقل أنبوب تناول من PFA إلى PBS، وطرد تماما PFA من الأنابيب.
2. إزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق تشريح دقيق. وضع الدماغ في حاوية صغيرة مليئة 4٪ بارافورمالدهايد، والسماح للدماغ لإصلاح ما بعد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
3. في اليوم التالي بعد التثبيت، استبدال P مع PBS و 0.1٪ أزيد الصوديوم. تخزين العقول في هذا الحل حتى التحضير للقسم الأنسجة.
4. جمع 40-50 درجة مئوية أقسام من أنسجة الدماغ الفورمالديهايد ثابتة عن طريق microtome تجميد أو درجة حرارة الغرفة تهتز.
5. الأنسجة تراجع في بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ في الماء لتعطيل بيروكسيداسيس الذاتية، والتي يمكن أن تنتج تلطيخ غير محدد.
6. إجراء استرداد مستضد باستخدام حمض الستريك العازلة (10 MM سيترات الصوديوم، 0.05٪ بوليسوربات-20، درجة الحموضة 6.0) في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
7. إجراء وضع العلامات على الأجسام المضادة بالطرق القياسية.  الرجوع إلى لوندل وآخرون. s التقرير²² من هذا المختبر لمزيد من التفاصيل.
   1. استخدم مجموعة إبطال IgG للماوس (راجع جدولالمواد) لتقليل التفاعل المتبادل مع الأجسام المضادة الذاتية. احتضان الأنسجة في المخزن المؤقت تحييد IgG لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT)، باتباع توجيهات الشركة المصنعة.
   2. استخدام الأجسام المضادة للمستضد النووي المضادة للإنسان (hNA؛ 1:500 تخفيف) عند زرع الخلايا المشتقة من iPSC الإنسان لتحديد موقع الخلايا المزروعة. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة باستخدام التحريض لطيف.
   3. بعد الإنزلاق بعيدا ً عن محلول الأجسام المضادة الأولي، احتضن الأنسجة مع الأجسام المضادة للماوس المضادة للماوس المترافقة بـ HRP في 1:250 تخفيف لمدة 2 ساعة في RT.
   4. أداء تفاعل كروموجين DAB بالطرق القياسية للكشف عن وضع العلامات المناعية. السماح رد فعل DAB لتطوير لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT.
8. قم بإرفاق الأنسجة الملونة بالشرائح وتطبيق قسائم الغطاء باستخدام الأساليب القياسية.
9. قياس أعداد الخلايا المسماة باستخدام الاستريولوجية غير المتحيزة كما هو موضح سابقا^23،24. إجراء تحليل باستخدام 20 ميكرومتر المقاطع البصرية والفاصل الزمني بين القسم من ثلاثة.

تسهل جراحة استئصال الجمجمة إصابة الدماغ التجريبية وزرع الخلايا العلاجية: يتطلب نموذج التأثير القشري الخاضع للرقابة لإصابة الدماغ والعلاج اللاحق لزراعة الخلايا إزالة دقيقة للجمجمة المنضوية. يمكن إجراء استئصال الجمجمة على أي سطح الظهر من الجمجمة للسماح بالتلاعب إلى منطقة الدماغ ذات الاهتمام. يصور الرسم التخطيطي في الشكل 1 مخطط استئصال الجمجمة قطره 5 مم للكشف عن القشريات الحسية الجسدية والحركية الأولية (الشكل1ألف). في 24 ح بعد استئصال الجمجمة، أجريت عملية جراحية ثانية لحقن تعليق الخلايا العصبية المستمدة من iPSC الإنسان في طبقات عميقة من القشرة (الشكل1ب). بعض الوذمة الدماغية طبيعية في اليوم الأول بعد استئصال الجمجمة، وخاصة بعد CCI. ومع ذلك، الأوعية الدموية الدماغية تجنيب خلال جميع مراحل هذا الإجراء أمر بالغ الأهمية لبقاء القشرة. يوضح الشكل 2 إجراء زرع الخلايا في الماوس مع الحد الأدنى من الفتق الدماغي، والحد الأدنى من النزيف، والأوعية الدموية القشرية واسعة النطاق. هذه الميزات هي مؤشرات التكهن جيدة لعملية جراحية ناجحة.

اختبار إزالة شريط لاصق يكشف عن العجز في النقوى الحركي بعد إصابة الدماغ من جانب واحد: المعلمات من نموذج إصابة الدماغ المذكورة أعلاه كان من المتوقع أن تؤثر على وظيفة الحسية والحركية الأمامية. تم اختيار اختبار إزالة الشريط اللاصق لتقييم شدة العجز الوظيفي للأطراف السفلية، والفوائد العلاجية المحتملة لزراعة الخلايا. تم تدريب الفئران على إجراء الاختبار لمدة 5 أيام، ثم سمح لها بالراحة لمدة يومين قبل اختبار سلوك خط الأساس. وأجريت العمليات الجراحية في اليوم التالي لاختبار خط الأساس. أجريت اختبارات السلوك في هذه الدراسة في الأيام 1 و 3 و 5 و 7 و 10 و 14 و 21 و 28 و 35 و 42. ويبين الشكل 3 نتائج تجربة تجريبية تمت فيها مقارنة وظيفة الأطراف الرطية في الفئران التي تاستئصال الجمجمة وحدها (الشام) ومع إصابة CCI بوظيفة الأطراف النقالة في الفئران الساذجة (n = 11 ساذجاً، 12 شاماً، 11 CCI). الفئران التي خضعت لعملية جراحية أظهرت عابرة زيادة تأخر لاحظت المحفزات لاصقة لمدة 1-3 أيام مباشرة بعد الجراحة (الشكل3A، B).  وأظهرت الفئران العجز العابر بعد العملية الجراحية في إزالة لاصقة من الصدارة ipsilateral كذلك (الشكل3C). ومع ذلك، أظهرت الفئران التي خضعت لCCI عجزا كبيرا في أداء المحرك في الصدارة ضد الإصابة بالمقارنة مع الفئران السذاجة إلى اليوم 28 بعد الجراحة (الشكل3D). كما تصف هذه البيانات الشدة غير المتوقعة لفقدان المحركات الحسية في الفئران القحفية دون CCI، مما يشير إلى أن استئصال الجمجمة الجراحي في هذه المنطقة يؤدي أيضا إلى العجز الوظيفي العصبي المرتبط بـ TBI.

الكشف المناعي للخلايا الجذعية المتعددة القوى المستحثة من قبل الإنسان (iPSC) المستمدة من الطعوم الخلية في أقسام الدماغ الماوس: أجريت تجارب لتحديد ما إذا كانت الخلايا العصبية المستمدة من iPSC الإنسان البقاء على قيد الحياة زرع على المدى الطويل في الدماغ الماوس. تم تمييز الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSCs) المستمدة من iPSCs إلى إما الخلايا العصبية غير الناضجة أو الخلايا النجمية في المختبر باستخدام الأساليب المعمول بها17. تم اختبار عمليات زرع كل من الأنماط الظاهرية الثلاثة للخلايا العصبية في نموذج CCI الخاص بنا لإصابات الدماغ الصادمة باستخدام الإجراء الموضح أعلاه والموضح في الشكل 2. تم قتل الفئران لتحليل الأنسجة في 7 أيام بعد زرع. كانت أقسام الدماغ الماوس ملطخة بالمناعة للمستضد النووي البشري (hNA). يمكن تمييز الطعوم الخلية البشرية بوضوح من الأنسجة المضيفة في جراحة الشام وعقول CCI (الشكل4). وأظهرت الطعوم Astrocyte (ن = 3 الشام، 2 CCI) ضعف البقاء على قيد الحياة بالمقارنة مع NSCs (ن = 12 الشام، 15 CCI) والخلايا العصبية (ن = 11 الشام، 10 CCI)، ولم ينظر في التجارب المستقبلية.

الشكل 1 تنسيق معايير التلاعب الجراحي. صور الكرتون من مناطق الدماغ الماوس من الفائدة. تشير الدوائر الحمراء إلى استئصال الجمجمة بقطر 5 مم تقريبًا. يشير الصليب الأحمر إلى نقطة استئصال الجمجمة المركزية 2 مم الجانبي إلى بريجما. (أ) تتأثر المنطقة المظللة من القشرة الدماغية في الرسم التخطيطي العلوي بـ CCI خفيفة عند إجراء استئصال الجمجمة كما هو موضح في الرسم التخطيطي السفلي. (ب) يشير السهم الأزرق في الرسم التخطيطي العلوي إلى الموقع التقريبي لحقن الخلايا على عمق 1.4 مم من سطح القشرية. الصليب الأزرق في الرسم البياني السفلي يشير إلى وضع حقن الخلية 2 مم الجانبي و 1 مم الخلفي إلى بريغا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 مراقبة أثناء الجراحة لحقن تعليق الخلايا. صورة التقطت من خلال مجهر مسافة العمل الطويلة أثناء حقن الخلايا intraparenchymal. يتم شرح الميزات التشريحية للوضوح. تحجب فروة الرأس جزئيًا موقع الجراحة لتقليل الجفاف أثناء العملية. قد يحدث نزيف طفيف أثناء اختراق الإبرة كما هو مبين، وهو أمر لا يدعو للقلق إذا ظلت الأوعية القشرية الكبيرة سليمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 التقييم السلوكي للتكامل الحسي الحركي بعد إصابة الدماغ. تمت مقارنة الفئران التي خضعت لاستئصال الجمجمة وCCI مع الضوابط السذاجة والفئران التي خضعت لجراحة صورية فقط (n = 11 ساذجة، 12 شام، 11 CCI). يتم تقديم البيانات على أنها مجموعة يعني latencies، مع أشرطة خطأ تشير SEM.(A) الفئران التي خضعت CCI أظهرت زيادة الكمون للتعرف على المحفزات اللاصقة المطبقة على الصدارة ipsilateral في اليوم الأول بعد العملية الجراحية. (ب) أظهرت الفئران التي خضعت لاستئصال الجمجمة أو CCI زيادة كبيرة في الكمون لإشعار المحفزات اللاصقة المطبقة على الصدارة الكونترالية في اليومين 1 و 3 بعد العملية الجراحية. (C) الفئران التي خضعت لاستئصال الجمجمة أو CCI أظهرت زيادة كبيرة في الكمون لإزالة المحفزات اللاصقة من الصدارة ipsilateral في أيام ما بعد الجراحة 1 و 3. (د) أظهرت الفئران التي خضعت لاستئصال الجمجمة أو CCI زيادة كبيرة في زمن الوصول لإزالة المحفزات اللاصقة من الصدارة المضادة في أيام ما بعد الجراحة 1-5. استمر العجز الحركي في الفئران مع CCI بقوة لمدة 28 يوما بعد الإصابة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 كيمياء المناعة DAB لطعوم الخلايا البشرية في أدمغة الماوس. تم تمييز iPSCs البشرية في الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، الخلايا العصبية، أو الخلايا النجمية في المختبر. تم زرع الثقافات الخلية في عقول الفئران مع أو بدون CCI. تم قتل الفئران لتحليل الأنسجة بعد سبعة أيام من زرع الخلايا. تصور الصور الدقيقة النتائج التمثيلية للمستضد النووي البشري. تصور الإنستات السوداء علامات القياس التجسمي لأرقام الخلايا (سماوي) وحجم الكسب غير المشروع (الأحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.