لينتيفيروسي تسكت الجينات بوساطة في الزائفة البشرية أعدت في لوحات مرفق منخفضة

Siming Liu; Mikako Harata; Joseph  A. Promes; Anthony  J. Burand; James  A. Ankrum; Yumi Imai

doi:10.3791/59578

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

لينتيفيروسي تسكت الجينات بوساطة في الزائفة البشرية أعدت في لوحات مرفق منخفضة

5.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59578

⸱

مايو 14, 2019

Siming Liu¹^,² , Mikako Harata¹^,² , Joseph A. Promes¹^,² , Anthony J. Burand²^,³ , James A. Ankrum²^,³ , Yumi Imai¹^,²

¹Department of Internal Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, ²Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center, University of Iowa, ³Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول لإنشاء البوادى البشرية المعدلة الجينات من خلايا جزيرة الإنسان المشتتة التي يتم نقلها بواسطة فيروس لينتي تحمل RNA دبوس الشعر القصير (shRNA). ويستخدم هذا البروتوكول الأنزيمات وأوعية الثقافة المتاحة بسهولة، ويمكن القيام به بسهولة، وينتج الزائفة البشرية المعدلة وراثيا مناسبة للدراسات الوظيفية والمورفولوجية.

الملخص

تتوفر أدوات وراثية مختلفة لتعديل الجينات في جزر البنكرياس من القوارض لتشريح وظيفة جينات الجزر لبحوث مرض السكري. ومع ذلك، فإن البيانات التي يتم الحصول عليها من جزر القوارض غالبا ما لا تستنسخ بالكامل في الجزر البشرية أو تنطبق عليها بسبب الاختلافات المعروفة في هيكل الجزر ووظيفتها بين الأنواع. وفي الوقت الراهن، فإن التقنيات المتاحة للتلاعب بالتعبير الجيني للجزر البشرية محدودة جدا. إدخال الجينات في الجزر سليمة عن طريق الفيروس الغدي، بلازميد، وoligonucleotides غالبا ما يعاني من انخفاض الكفاءة والسمية العالية. انخفاض الكفاءة هو إشكالية خاصة في الدراسات الجينات أسفل التنظيم في الجزر سليمة، والتي تتطلب كفاءة عالية. ومن المعروف أن خلايا جزيرة المشتتة الأنزيمية إعادة تجميع في الثقافة تشكيل spheroids تسمى الزائفة. إعادة تصنيف الخلايا الصغيرة التي يتم التحكم فيها بالحجم تخلق البساط التي تحافظ على إفراز الأنسولين الديناميكي في المرحلة الأولى بعد الزراعة المطولة وتوفر نافذة لإدخال الحمض النووي الريبي القصير اللين (shRNA) بكفاءة مع سمية منخفضة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل لإنشاء الزائفة البشرية بعد الانشّاط الفيروسي باستخدام اثنين من لوحات multiwell المتاحة تجاريا. ويمكن تنفيذ البروتوكول بسهولة ويسمح بكفاءة خفض تنظيم الجينات وتقييم دينامية إفراز الأنسولين باستخدام خلايا الislet البشرية. وهكذا، فإن الزائفة البشرية مع تعديل الجينات بوساطة لينتيفيروسي توفر نموذجا قويا وتنوعا لتقييم وظيفة الجينات داخل خلايا جزيرة الإنسان.

المقدمة

فقدان كتلة خلية بيتا الوظيفية هو علم الأمراض المركزية لكل من النوع 1 والنوع 2 مرض السكري¹. في حين أن خلايا بيتا هي منتجة الأنسولين في جزر البنكرياس، فإن التواصل بين خلايا بيتا والخلايا غير بيتا يلعب دورا حاسما في تنظيم إفراز الأنسولين². وبالإضافة إلى ذلك، فإن خلل تنظيم إفراز الجلوكاجون يساهم في ارتفاع السكر في الدم في مرض السكري³. وهكذا، هناك اهتمام قوي لتعديل التعبير الجيني للخلايا داخل جزر البنكرياس لمعالجة الآلية وراء تطور خلل في مرض السكري في جزيرة. تتوفر مجموعة متنوعة من النهج بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا لتعديل التعبير الجيني من جزر الماوس. ومع ذلك، تظهر الجزر البشرية والماوس تتداخلي مت....