العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية

ملخص

نقدم تقنيات لعزل خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) التي تم الحصول عليها من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية، وزراعة وتميزها، وتميزها. ويمكن استخدام hMPCs التي تم الحصول عليها وتتميز من خلال هذه الأساليب لمعالجة الأسئلة البحثية المتعلقة بعضلة عضلية الإنسان وتجديد العضلات الهيكلية.

الملخص

استخدام الأنسجة البشرية الأولية والخلايا مثالية للتحقيق في العمليات البيولوجية والفسيولوجية مثل عملية تجديد العضلات الهيكلية. هناك تحديات معترف بها للعمل مع الخلايا الجذعية البشرية الأولية الكبار، وخاصة خلايا ذرية العضلات البشرية (hMPCs) المستمدة من الخزعات العضلات الهيكلية، بما في ذلك انخفاض غلة الخلايا من الأنسجة التي تم جمعها ودرجة كبيرة من عدم تجانس المانحين من النمو وبارامترات الموت بين الثقافات. في حين أن دمج التباين في التصميم التجريبي يتطلب حجم عينة أكبر للكشف عن آثار كبيرة، فإنه يسمح لنا أيضا لتحديد الآليات التي تكمن وراء التباين في قدرة التوسع hMPC، وبالتالي يسمح لنا لفهم أفضل عدم التجانس في تجديد العضلات الهيكلية. الآليات الجديدة التي تميز القدرة على التوسع من الثقافات لديها القدرة على أن تؤدي إلى تطوير العلاجات لتحسين تجديد العضلات الهيكلية.

المقدمة

العضلات الهيكلية هي أكبر جهاز في جسم الإنسان، تمثل 30-40٪ من كتلة الجسم كله¹. بالإضافة إلى دورها المعترف بها جيدا في الحركة، العضلات الهيكلية تحافظ على درجة حرارة الجسم والموقف، ويلعب دورا مركزيا في التوازن المغذية لكامل الجسم كله. البحوث التي تشمل المشاركين من البشر، والحيوانات، ونماذج ثقافة الخلايا كلها قيمة لمعالجة المسائل المتعلقة بيولوجيا العضلات الهيكلية وتجديد. العزلة والثقافة من خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) يوفر نموذجا قويا يسمح لتقنيات زراعة الخلايا والتلاعب ليتم تطبيقها على العينات البشرية. ميزة استخدام hMPCs هو أنها تحتفظ النمط الظاهري الوراثي والأيضي من كل مانح^2،3. صيانة النمط الظاهري المانح يسمح للباحثين لدراسة التباين بين الأفراد في عملية myogenic. على سبيل المثال، لقد استخدمنا طريقة توصيف HMPC لتحديد الاختلافات المتعلقةبالعمر والجنس في قدرة التوسع السكاني HMPC 4.

الغرض من هذا البروتوكول هو تفصيل تقنيات لعزل وثقافة وتوصيف وتمييز hMPCs من أنسجة خزعة العضلات والهيكل العظمي. واستناداً إلى الأعمال السابقة التي وصفت مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية وصانعات سطح الخلية المحتملة لعزل HMPC⁵و6، فإن هذا البروتوكول يسد فجوة حرجة في المعرفة من خلال ربط العزلة بتوصيف مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. وعلاوة على ذلك، فإن التعليمات التفصيلية التدريجية الواردة في هذا البروتوكول تجعل عزل وتوصيف اللجنة في متناول جمهور علمي واسع، بما في ذلك أولئك الذين لديهم خبرة سابقة محدودة مع مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. بروتوكولنا هو من بين أول من وصف استخدام مقياس الخلايا التصويرية لتعقب مجموعات الخلايا. أجهزة قياس الخلايا التصويرية المصممة حديثًا هي أحدث التقنيات، وعالية الإنتاجية، وقائمة على الصفائح الدقيقة، مما يتيح تصوير الخلايا الحية، وفرز الخلايا، وتحليل الفلورة متعدد القنوات لجميع الخلايا في كل بئر من الأوعية الثقافية في غضون دقائق. ويسمح هذا النظام بالتحديد الكمي السريع للتغيرات الدينامية في انتشار وبقاء مجموعة كاملة من الخلايا مع الحد الأدنى من التعطيل للثقافة. على سبيل المثال، نحن قادرون على تنفيذ مقاييس موضوعية للالتقاء في الأيام المتعاقبة في المختبر لتحديد حركية النمو لكل ثقافة مشتقة من مختلف المانحين. العديد من البروتوكولات في المؤلفات، ولا سيما تلك التي تنطوي على التمييز بين الـ MPCs، تتطلب الخلايا للوصول إلى مستوى محدد من التقاء قبل الشروع في التمايز أو العلاج⁷. تسمح طريقتنا بتحديد موضوعي للتقاء كل بئر في وعاء ثقافي يسمح للباحثين ببدء العلاج بطريقة غير متحيزة وغير ذاتية.

في الماضي، كان أحد القيود الرئيسية لاستخدام hMPCs الأولية انخفاض الغلة التي تحد من عدد الخلايا المتاحة للتجارب. لقد أظهرنا نحن وآخرون غلة الـ MPCs من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية 1-15 MPCs لكل مليغرام من الأنسجة (الشكل 1)⁸. لأن بروتوكولنا يسمح لأربعة ممرات من الخلايا قبل تنقية مع فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، لدينا عوائد hMPC المحفوظة بالتبريد، المستمدة من كميات صغيرة من أنسجة خزعة (50-100 ملغ)، كافية لمعالجة أهداف البحوث حيث هناك حاجة إلى تجارب متعددة. لدينا بروتوكول FACS تنتج ~ 80٪ نقية (Pax7 إيجابية) MPC السكان، وبالتالي يتم تحسين بروتوكولنا لكل من العائد والنقاء.

البروتوكول

وقد وافق مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة كورنيل على هذا البروتوكول. وتم فحص جميع المشاركين للاطلاع على الظروف الصحية الأساسية وأعطوا الموافقة المستنيرة.

1. الحصول على أنسجة العضلات البشرية عن طريق خزعة العضلات الهيكلية

1. تحديد العضلات الجانبية الشاسعة عن طريق الجس، والمعالم التشريحية، والانكماش النشط في العضلات.
2. Palpate الجانبية vastus عن طريق وجود المشارك تشديد عضلاتهم quadriceps والعثور على بطن العضلات، حوالي 1/3 من الطريق من الرضفة إلى الورك، والبطين فقط إلى عظم الفخذ.
3. استخدم شريط قياس ورقي لوضع علامة على منطقة تحتوي على علامة جراحية على بعد حوالي 4-6 بوصات من الجزء العلوي من الرضفة التي تمثل بطن العضلات.
4. حلاقة أي شعر بالقرب من المنطقة ملحوظ ومن ثم تطهير مع مطهر الصف الجراحية التي تستخدم قبل الإجراءات الطبية (على سبيل المثال: 2٪ كلورهيكسيدين غلوكونات (CHG)/ 70٪ كحول ايزوبروبيل (IPA)).
5. التخدير في موقع خزعة مع 1٪ ليدوكائين.
   ملاحظة: تجنب حقن ليدوكائين في العضلات الهيكلية.
6. قم بإجراء شق شق 4-5 مم في الموقع المميز.
7. بعد التخدير في المنطقة، ادفع إبرة بيرغستروم مع التروكار عبر اللفافة إلى بطن العضلات (حوالي 2-3 سم).
8. ارسم أنسجة العضلات في إبرة Bergstrom عن طريق سحب التروكار القطع2−3 سم في حين يطبق المساعد الشفط عن طريق سحب مغطس حقنة 60 مل مرفق.
9. أغلق غرفة القطع.
10. تدوير قاعدة إبرة خزعة بدوره ربع وكرر تسلسل فتح الإبرة، وتطبيق شفط، وإغلاق الإبرة.
    ملاحظة: في كل مرة يتم إغلاق الإبرة ، يجب الحصول على قطع من أنسجة العضلات داخل إبرة بيرغستروم. خلال جمع العينة، ستبقى الإبرة في الفخذ في نفس الوضع الرأسي بينما يتم تدويرها طوليا من خلال 360 درجة للحصول على كل عينة. يمكن تكرار هذا التسلسل 3-4 مرات.
11. طرد أنسجة الخزعة التي تم جمعها من الإبرة إلى وسادة خلع الملابس غير المعقمة غير الملتصقة.
12. فحص الأنسجة وإزالة أي الأنسجة الدهنية والليفية مرئية باستخدام شفرات مشرط معقمة أو ملاقط.
13. ضع جزءًا (50-100 ملغ) من الأنسجة في أنبوب معقم يحتوي على_ثانيأكسيد الكربون- وسط مغذي مستقل (مثل السبات A).
    ملاحظة: يتم تحديد وزن الأنسجة على النحو التالي. أولا ً قم بإزالة الأنبوب المتوج الذي يحتوي على المغذيات المتوسطة على مقياس وساري. ثم ضع الأنسجة في الأنبوب، قم بتلخيص الأنبوب، ثم وزن الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة في وسط المغذيات.
14. تخزين الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة والمغذيات المتوسطة في 4 درجة مئوية حتى المعالجة.
    ملاحظة: يجب معالجة أنسجة الخزعة في غضون 48 ساعة من الجمع.

2. عزل خلايا ذرية العضلات البشرية من أنسجة خزعة

1. أنسجة خزعة المنمة.
   1. نقل أنسجة العضلات من وسط المغذيات إلى طبق بيتري معقمة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو مكان عمل معقم مماثل.
   2. استخدام شفرات مشرط معقمة إلى الأنسجة mince في ~ 1 مم³ قطع.
2. غسل أنسجة خزعة مفرومة لإزالة الحطام المتبقي.
   1. نقل أنسجة العضلات في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) والسماح للأنسجة لتسوية عن طريق الجاذبية.
   2. يستنشق المتناعن من الحرص على عدم إزعاج أنسجة العضلات.
   3. إضافة 10 مل من PBS إلى الأنسجة المغسولة والسماح للأنسجة العضلية لإعادة التوطين عن طريق الجاذبية.
   4. يستنشق المتناعن من الحرص على عدم إزعاج أنسجة العضلات.
   5. إضافة 10 مل من انخفاض الجلوكوز Dulbecco تعديل النسر المتوسطة (DMEM) والسماح للأنسجة لإعادة التوطين عن طريق الجاذبية.
   6. يستنشق المتناعن من الحرص على عدم إزعاج أنسجة العضلات.
3. احتضان الأنسجة في وسائل الإعلام هضم.
   1. إعادة تعليق أنسجة العضلات في 3 مل من وسائل الإعلام هضم (2 ملغ / مل كولاجيناز د في انخفاض الجلوكوز DMEM).
      ملاحظة: يمكن إعداد حلول الأسهم كولاجيناز D في 20 ملغ / مل في DMEM الجلوكوز منخفضة وتخزينها في -80 درجة مئوية، ثم المخففة 1:10 في DMEM الجلوكوز منخفضة في وقت الاستخدام.
   2. احتضان الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة العضلات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   3. Triturate تعليق أنسجة العضلات كل 10 دقيقة باستخدام ماصة المصلية 10 مل أو ماصة تتحمل واسعة.
   4. إضافة 83 ميكرولتر من وسائل الإعلام هضم إضافية و 24 ميكرولتر من محلول ديسباسي (0.76 مليون متر خلات الكالسيوم، 1.39 مليون متر خلات الصوديوم، 13.91 ملغ / مل ديسباس الثاني في DMEM الجلوكوز منخفضة). العودة التعليق إلى حمام المياه 37 درجة مئوية.
   5. قم بإقتيال أنسجة العضلات كل 5-10 دقائق مع طرف مُحمل واسع.
   6. استمر في التثاقل حتى يتم تحقيق الطين موحدة، ولمدة لا تزيد عن 1.5 ساعة لمنع أكثر من الهضم.
      ملاحظة: يمكن أن يؤثر الفرم الكافي للأنسجة والنشاط الأنزيمي للكولاجيناز وديسباس على هضم العينة. يجب أن يكون الطين موحدة قادرة على تمرير من خلال طرف ماصة العادي مع الحد الأدنى من انسداد بعد 1.5 ساعة. إذا لم يتم تحقيق الطين موحدة بعد 1.5 ساعة، والتحقق المزدوج من أن الفرم الأنسجة كافية، ويتم فرم الأنسجة إلى الحجم المناسب (الخطوة 2.1.2). بالإضافة إلى ذلك، يجب اختبار نشاط الإنزيمات كما الكثير إلى الكثير الاختلاف في النشاط الأنزيمي لا يحدث.
4. خلايا بيليه وتجميد في وسائل الإعلام الانتعاش.
   1. إضافة 6 مل من وسائل الإعلام النمو (جنرال موتورز؛ 79٪ لحم الخنزير F12، 20٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقديات، 5 نانوغرام / مل عامل نمو الليفي الأساسية [bFGF]، درجة الحموضة 7.4، مرت من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر) إلى الطين العضلات.
   2. ماصة التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل. شطف مصفاة مع 4 مل إضافية من جنرال موتورز.
      ملاحظة: يمكن نقل عينة مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي 15 مل لسهولة تصور بيليه. يمكن استخدام حجم غسيل أكبر إذا كانت إنتاجية الخلايا اللاحقة منخفضة.
   3. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   4. يستنشق الخارق ة على يقين من عدم تعطيل بيليه. نفض الغبار أنبوب لإعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام المتبقية. إذا كانت الخلايا لن يتم المستتزرعة على الفور المضي قدما إلى الخطوة 2.4.5 للحصول على تعليمات بشأن التخزين على المدى الطويل، وإلا انتقل إلى الخطوة 3.1.6.
      ملاحظة: إذا كانت الثقافة الفورية مرغوبة، يجب أن يتم احتضان جنرال موتورز في لوحات زراعة الخلايا مسبقًا (الخطوتان 3-1-1 و3.1.2) قبل بدء معالجة الخزعة.
   5. إضافة 1.5 مل من الانتعاش خليةالثقافة تجميد وسائل الإعلام (جدول المواد) إلى بيليه المستردة.
   6. نقل الطين في التبريد. ضع الفيلة المعفية في مبرد معدل تسيطر عليه ايزوبروبانول بين عشية وضحاها عند -80 درجة مئوية. تخزين التبريد في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للثقافة.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالفيوايات التي تحتوي على الطين في النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل (أكثر من شهر واحد). باستخدام المبرد معدل التي تسيطر عليها isopropanol يسمح الخلايا أن تكون مجمدة reproducibly بمعدل 1 درجة مئوية / دقيقة مما أدى إلى معدلات استرداد الخلايا المثلى كما يتضح من الجدوى بعد التجميد وزيادة احتمال التعلق بسفن زراعة الخلايا⁹. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام كوب يحتوي على إيزوبروبانول RT، يوضع في فريزر -80 درجة مئوية.

3. زراعة خلايا العضلات البشرية السلف

1. إذابة الطين العضلات.
   1. قبل ذوبان وبذر hMPCs، لوحات ثقافة الخلايا قبل equilibrate في جنرال موتورز. ملء الآبار المتبقية مع 500 درجة مئوية من وسائل الإعلام الأساسية المعقمة (أي F12) لمنع التبخر خلال الثقافة على المدى الطويل.
      ملاحظة: بالنسبة للخزعات بين 50 غرام و 100 غرام، أربعة آبار من لوحة 24 جيدا هي مناسبة. إذا كان نسيج الخزعة أقل من 50 غرام، قد يكون بئران أكثر ملاءمة. الحطام المتبقي وانخفاض عدد الخلايا يمنع استخدام تقنية عد الخلايا في هذه الخطوة; لذلك، لا يتم تحديد كثافة البذر الدقيق ويختلف قليلا من خزعة إلى خزعة.
   2. احتضان سفن زراعة الخلايا مع جنرال موتورز في 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ لمدة ساعة واحدة قبل البذر.
   3. إزالة الفيافيال من -80 درجة مئوية الفريزر ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. يجب أن يكون السائل في الأنبوب مغمورة تماما في الماء.
   4. عندما ذوبان كاملة تقريبا (~ 5 دقيقة)، نقل الفيلة الجليدية إلى غطاء محرك السيارة تدفق laminar معقمة. نقل الطين العضلات من أنبوب التبريد وإضافة إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 6 مل من جنرال موتورز قبل تسخينها بمعدل 1 مل / دقيقة.
   5. الطرد المركزي الطين العضلات في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يمكن للطارد ة الطرد المركزي دلو يتأرجح تجعل من الأسهل لتصور الكريات الصغيرة في هذه الخطوة ولكن ليس من الضروري.
   6. يستنشق الخارق ة على يقين من عدم تعطيل بيليه. نفض الغبار أنبوب لإعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام المتبقية وإعادة تعليق في 1 مل من جنرال موتورز.
   7. نقل 250 درجة مئوية من بيليه علقت (تعتبر الآن تعليق hMPC) إلى كل من الآبار 4 من لوحة ثقافة الخلية 24 جيدا precubated.
2. ثقافة وممر [همبك].
   1. الحفاظ على ثقافات hMPC في جنرال موتورز عند37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
      ملاحظة: يتم إعداد مخزونات من جنرال موتورز دون bFGF (أي F12، والمضادات الحيوية، FBS) على دفعات ويتم الاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. يتم إضافة bFGF إلى جنرال موتورز في يوم الاستخدام. يمكن تخزين الوسائط التي تحتوي على bFGF لمدة 48 ساعة عند 4 درجة مئوية.
   2. بعد 24 ساعة من العزلة، يستنشق الآلية العالمية، ويغسل بلطف وعاء الثقافة 2X مع جنرال موتورز الدافئة مسبقا، وإضافة جنرال موتورز جديدة.
      ملاحظة: ينبغي أن يوفر 24 ساعة للمراكز hMPCs الوقت الكافي لإرفاقه؛ لا ينبغي إزالة hMPCs بعد الغسيل. وستقوم هذه الخطوة أيضا بإزالة الحطام المتبقي الذي تم توليده أثناء حصاد الخلايا، مما يجعل السفينة أكثر قابلية لمسح التقاء دقيق باستخدام مقياس السيتومتر التصويري (القسم 5 أدناه). بعد هذا التغيير الأولي في وسائل الإعلام، يتم تغيير جنرال موتورز كل 48 ساعة.
   3. مرور hMPCs عندما يتم تحقيق التقاء 70٪ أو عندما ظلت على طبق الثقافة نفسه لمدة 10 أيام، أيهما يحدث أولا.
      ملاحظة: التقاء 70٪ هو ما يقرب من 55،000 خلية / سم².
   4. للمرور، أضف 250 ميكرولتر من التربسين المُدفأ مسبقاً إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلايا 24 بئراً وحضانة لمدة 5 دقائق تقريبًا.
   5. اضغط على وعاء ثقافة الخلية على سطح ثابت لفصل hMPCs. يمكن استخدام المجهر الخفيف للتحقق من أن hMPCs قد انفصلت.
   6. نقل تعليق التربسين / hMPC إلى 5 مل من جنرال موتورز في أنبوب مخروطي 15 مل.
   7. الطرد المركزي تعليق hMPC في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
   8. إزالة تعليق hMPC من الطرد المركزي ووضعها على الجليد في غطاء محرك السيارة تدفق laminar العقيمة.
      ملاحظة: الحفاظ على hMPCs على الجليد أثناء تمرير النتائج في أقل تجميع الخلايا.
   9. يستنشق من hMPCs وبلطف إعادة تعليق بيليه في 1 مل من جنرال موتورز.
   10. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومات أو عداد الخلية الآلي.
       ملاحظة: تمال تعليق الخلية إلى المخزن المؤقت لعد الخلايا 1:5 بشكل عام.
   11. بذور hMPCs على أطباق الثقافة المغلفة بالكولاجين التي تحتوي على جنرال موتورز الدافئة مسبقافي كثافة 3500 خلية لكل سم 2. مزيج من لوحات 10 سم ولوحات 24 جيدا مثالية. يمكن مسح اللوحات ذات الـ 24 بئرًا يوميًا على مقياس تصوير لمراقبة النمو.
   12. اتبع نفس الإجراء (بدءاً من الخطوة 3.2.4.) للمقاطع اللاحقة.
       ملاحظة: يمكن رصد صحة الخلية ونقاءها عبر الممرات باستخدام علامة من الحساسية الخلوية (على سبيل المثال، β-galactosidase) وتلطيخ المناعة لPax7.
3. حفظ الـ hMPCs بالتبريد.
   1. حفظ الخلايا الزائدة بالتبريد لاستخدامها في وقت لاحق لجعل حجم الثقافة أكثر سهولة.
   2. للحفظ بالتبريد، اتبع إجراء التربسينية الموضح في الخطوات 3.2.4.-3.2.9.
   3. وفي الوقت الذي يجري فيه الطرد المركزي لتعليق الخلية، قم بإعداد خليط من 20 في المائة (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر) من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) و80 في المائة (على سبيل المثال، 800 ميكرولتر). يُترك المزيج للراحة على الجليد.
   4. استناداً إلى عدد الخلايا، تمييع تعليق hMPC إلى 2 × 10⁶/mL في جنرال موتورز.
   5. الجمع بين تعليق hMPC و20٪ معقمة DMSO / 80٪ GM خليط 50/50. وسائل الحفظ بالتبريد النهائية هي مزيج من DMSO (10٪) وجنرال موتورز (90 في المائة) تحتوي على 1 × 10⁶ hMPCs / مل.
   6. وضع 1 مل من تعليق hMPC أعدت في الخطوة 3.3.5 في العديد من الفيالات الجليدية كما يسمح العد الأولي للخلايا. ثم ضع hMPCs aliquoted في المبرد معدل ISOpropanol التي تسيطر عليها في -80 درجة مئوية الفريزر بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم الحصول عادة على ما بين 5 و 15 مليون خلية، يتم تحديد 30-60٪ منها على أنها hMPCs من قبل FACS.

4. عزل Pax7⁺ خلايا العضلات البشرية السلف عن طريق قياس التدفق

1. لإعداد hMPCs من الثقافات الحية (الخطوة 3.2.11)، جرب ما يكفي من الأوعية الثقافية ل1 × 10⁶-2 × 10⁶ مجموع الخلايا. إعداد تعليق الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3-2-4 إلى 3-2-9.
2. إعداد مركبات hMPCs من الثقافات المحفوظة بالتبريد (الخطوة 2-4-6 أو 3-3-6).
   1. حدد 1-2 أنابيب تحتوي على حوالي 1 × 10⁶ مرور أربعة hMPCs لكل مانح.
      ملاحظة: باستخدام مرور أربعة hMPCs يسمح لغلة الخلية كافية مع الحفاظ على القدرة على التكاثر حتى مرور ستة (الشكل2).
   2. خلايا ذوبان بسرعة عن طريق إزالتها من -80 درجة مئوية الفريزر ووضعها في حمام المياه 37 درجة مئوية مع السائل في أنبوب مغمورة تماما.
   3. عندما ذوبان كاملة تقريبا (~ 5 دقيقة)، نقل hMPCs إلى غطاء محرك السيارة تدفق laminar معقمة ونقل محتويات تعليق الخلية في 6 مل من جنرال موتورز قبل تسخينها في أنبوب مخروطي 15 مل بمعدل 1 مل / دقيقة.
   4. إعداد تعليق الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3-2-7 إلى 3-2-9.
   5. إعادة تعليق كل بيليه في 3 مل من المخزن المؤقت FACS (500 مل PBS، 12.5 مل مصل الماعز العادي، 2 مل 0.5 M EDTA، درجة الحموضة 7.4، مرت من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر).
   6. طرد مركزي تعليق الخلية في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
   7. يستنشق supernatant من hMPCs وبلطف إعادة تعليق بيليه في 250 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS؛ مكان على الجليد.
   8. وضع 100 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.7 مل وترك على الجليد لاستخدامها كضوابط حية / ميتة (الخطوة 4.5.1).
      ملاحظة: يمكن أن يأتي 100 ul من الخلايا التي سيتم استخدامها للتحكم الحي/الميت من أخذ حجم صغير (~ 20 ul) من الخلايا المعاد تعليقها من كل متبرع ليتم فرزها أو من الخلايا البنكية.
      ملاحظة: من المهم عدم أخذ أكثر من 20 ul من الخلايا المعاد تعليقها من متبرع واحد. جلب حجم يصل إلى 100 ul مع المخزن المؤقت FACS إذا < 100 ul من الخلايا هو متاح.
3. وصمة عار hMPCs لعلامات سطح الخلية.
   1. إعداد كوكتيل الأجسام المضادة التالية (المبالغ المعروضة هي لكل ثقافة، وتوسيع نطاق مناسب): 5 ميكرول CD56 (جزيء التصاق الخلايا العصبية [NCAM]؛ PE-Cy7-المترافق) و 5 ميكرول CD29 (β1-integrin; AlexFluor488-المترافق). تخفيف الأجسام المضادة النهائي هو 1:50.
   2. أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة إلى كل تعليق hMPC وحضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
   3. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لـ FACS إلى كل خليط كوكتيل معلق/مضاد.
   4. الطرد المركزي كل أنبوب في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
   5. إعادة تعليق بيليه في 300 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS ونقل إلى أنبوب البوليستيرين أسفل جولة 5 مل.
   6. الحفاظ على تعليق على الجليد ومحمية من الضوء.
4. إعداد الخرز التعويض.
   ملاحظة: يجب إعداد عناصر تحكم إيجابية لكل جسم مضاد ومراقبة سلبية (الخرز غير الملون) باستخدام حبات التعويض. يجب تشغيل ضوابط حبة التعويض على مقياس السيتومتر التدفق قبل العينات التي سيتم فرزها. وتسمح هذه الضوابط بتحديد مقدار الفلوروكروم من كل جسم مضاد الذي يمكن اكتشافه في قناة الجسم الآخر بحيث يمكن تطبيق التعويض.
   1. دوامة الخرز التعويض.
   2. في ثلاثة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل، إضافة قطرة واحدة (50 درجة مئوية) من الخرز التعويض.
   3. إضافة 1 μL من كل جسم مضاد إلى الأنبوب المناسب، أو لا شيء إلى السيطرة السلبية.
   4. حضانة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
   5. إضافة 1.5 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب ودوامة.
   6. الطرد المركزي كل أنبوب في 300 × ز في جهاز طرد مركزي على سطح البدلة لمدة 5 دقائق في RT.
   7. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه في 200 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS.
      ملاحظة: بيليه قد يكون من الصعب جدا تصور; وينبغي توخي الحذر عندما aspirating supernatant.
   8. وضع التعليق في أنبوب البوليستيرين السفلي جولة 5 مل ثم الحفاظ على أنبوب على الجليد ومحمية من الضوء.
5. إعداد الضوابط الحية والميتة.
   1. تقسيم 100 درجة مئوية من hMPCs من الخطوة 4.2.8 إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.7 مل (واحد للتحكم الحي وواحد للتحكم الميت).
   2. ضع أنبوب التحكم الميت في كتلة التدفئة التي تم تسخينها مسبقًا إلى 70 درجة مئوية لـ > 10 دقائق. خلال هذا الوقت، والحفاظ على السيطرة الحية على الجليد.
   3. الطرد المركزي كل أنبوب في 300 × ز في جهاز طرد مركزي على سطح البدلة لمدة 5 دقائق في RT.
   4. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه في 150 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS.
   5. الجمع بين الضوابط الحية / الميتة في واحد 5 مل جولة أسفل أنبوب البوليسترين.
6. أداء تلطيخ الصلاحية.
   1. إضافة 1 ميكرولتر من 7-أمينواكتينومايسين D (7-AAD) إلى جميع الأنابيب التي تحتوي على خلايا ليتم فرزها والسيطرة الحية / الميتة.
   2. إضافة جنرال موتورز إلى الكولاجين المغلفة 24 جيدا (250 درجة مئوية / جيدا) و 10 سم (8 مل / جيدا) لوحات والسماح لequilibrate في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية في 5٪ CO_2.
7. فرز hMPCs عن طريق قياس التدفق.
   1. فرز hMPCs على مقياس السيتومتر تدفق مع فوهة 100 ميكرومتر في ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة. تحديد hMPCS الحية على أساس الجانب وإلى الأمام مبعثر وكذلك السلبية 7-AAD (يمكن رؤية معلمات الفرز وفرز تمثيلي في الشكل3).
   2. الخلايا الإيجابية لPE-Cy7 (780/60 نانومتر) وAlexFluor488 (530/30 نانومتر) تمثل CD56⁺/CD29⁺ الخلايا وبالتالي هي الخلايا الإيجابية Pax7 (hMPCs). فرز الخلايا الإيجابية المزدوجة في أنابيب جمع تحتوي على وسادة 300 μL من المخزن المؤقت FACS.
      ملاحظة: ويمكن تحديد نقاء الثقافات التي تم فرزها عن طريق تلطيخ المناعة لPax7 تليها تحليل قياس تدفق المصب (الشكل4).
   3. تجاهل كافة الخلايا الأخرى.
   4. نقل الخلايا التي تم فرزها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
   5. تدور تعليق hMPC في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
   6. يستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق في 1 مل من جنرال موتورز.
   7. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومات أو عداد الخلية الآلي.
      ملاحظة: في حين يمكن استنتاج عدد الخلايا على أنه عدد الأحداث التي تم فرزها بشكل إيجابي، فقد وجد أن هذا العدد يبالغ في تقدير عدد الخلايا بنسبة 10-40% مقارنة بالأساليب التقليدية لحساب الخلايا.
   8. بذور hMPCs كما هو موضح في الخطوة 3.2.11.
      ملاحظة: ويمكن تحديد التحقق من نقاء السكان hMPC عن طريق تلطيخ المناعة لPax7 والتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.

5. توصيف خلايا العضلات البشرية (hMPC) الثقافات باستخدام مقياس الخلايا التصويرية

1. استخدم مقياس السيتومتر التصويري (جدول المواد) لإجراء عمليات مسح التقاء.
   1. حدد إنشاء فحص جديد ثم أدخل/حدد فئة اللوحةوملف تعريف اللوحة ومعرف اللوحة. يمكن أن يستوعب مقياس السيتومتر التصويري 96 و24 و6 لوحات جيدة.
   2. ضمن التطبيق، حدد التقاء > التقاء 1.
   3. حدد بئرًا لعرضها باستخدام الملاح على يمين الشاشة.
   4. العثور على مستوى من التركيز حيث تظهر الخلايا البيضاء مقارنة بالخلفية وحدد دليل التسجيل أو السماح للتصوير cytometer لتحديد مستوى التركيز عن طريق تحديد تسجيل السيارات.
      ملاحظة: وبالنسبة للوحات الآبار الـ 96 المقترحة في جدولالمواد، فإن الموضع التقريبي هو 4.3 وحدات.
   5. استخدام الماوس لتسليط الضوء على جميع الآبار التي تحتاج إلى مسحها ضوئيا. سيتم مسح منطقة البئر بأكملها تلقائيًا. حدد بدء المسح الضوئي.
   6. حدد إعدادات التحليل المثلى لنوع اللوحة والخلية.
      ملاحظة: بالنسبة للمركبات الكمية المتوسطة، تكون الإعدادات التالية هي الأمثل: الكثافة = 6، الكثافة المشبعة = 0، القطر = 8، الحد الأدنى للسمك = 3، الحد الأدنى لحجم الكتلة = 500، والدقة = عالية.
   7. حدد تحليل البدء.
      ملاحظة: فحص الصور بصريا للتأكد من أن المستخدم والتصوير cytometer توافق فيما يتعلق محيط الخلايا. في حالة وجود تباين كبير، قم بإعادة فحص اللوحة باستخدام مستوى مختلف من التركيز أو إعدادات تحليل مختلفة. يمكن استخدام المسح الضوئي للتقاء لمقارنة النمو بين الثقافات، والوقت الذي يتم فيه إدارة العلاج، أو لمراقبة الخلايا وتحديد متى تبدأ التمايز. وإذا كان التمايز مرغوبا فيه، ترد التفاصيل في الفرع 6.
2. استخدم مقياس الخلايا التصويري لحساب الخلايا.
   1. إعداد محلول تلطيخ يحتوي على 12 مل من F12 لحم الخنزير، 6 ميكرولتر من Hoechst 33342 و 24 ميكرولتر من يوديد البربيديوم.
   2. يستنشق وسائل الإعلام واستبدال مع حل تلطيخ، وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   3. يستنشق حل تلطيخ واستبدال مع F12 لحم الخنزير.
      ملاحظة: من المهم استخدام وسائل الإعلام مع مستويات منخفضة من الفينول الأحمر للحصول على صور واضحة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام PBS.
   4. تحميل لوحة على مقياس الخلايا التصوير وتحت التطبيق، حدد الخلية Viability > لايف + الميت +المجموع. القناة الحية ستكون صورة ميدانية مشرقة، والقناة الميتة ستكون يوديد بروبيديوم، والقناة الإجمالية ستكون Hoechst 33342.
   5. تعيين القناة المباشرة إلى حقل مشرق وانقر فوق تسجيل تلقائي ضمن إعداد التركيز.
   6. ضمن قناة الإجمالي، قم بتعيين القناة إلى اللون الأزرق. استخدم Find focus لجعل النوى في بؤرة التركيز أو استخدم الأسهم لأعلى ولأسفل لتعيين التركيز يدويًا. انقر فوق تعيين إزاحة لتحديد التركيز.
   7. تحت القناة الميتة، قم بتعيين القناة إلى اللون الأحمر. استخدم Find focus لجعل الخلايا الميتة في بؤرة التركيز أو استخدم الأسهم لأعلى ولأسفل لتعيين التركيز يدويًا. انقر فوق تعيين إزاحة لتحديد التركيز.
   8. حدد بدء الفحص لبدء الفحص.
   9. حدد معلمات التحليل المناسبة لنوع اللوحة والخلية. حدد بدء التحليل لبدء التحليل. بعد اكتمال التحليل، تحقق بصريا من أن التحليل هو تحليل الخلايا بشكل مناسب (على سبيل المثال، للتحقق من مجموع القناة أن يتم التعرف على كل نواة كنواة وأن مقياس الخلايا التصويرية لا يعد أي بقع في الخلفية كما النوى). إذا كان المسح الضوئي والتحليل مرضية، والعودة لوحة إلى الحاضنة، وإلا إعادة تفحص أو تعديل معلمات التحليل.

6. التمييز بين خلايا العضلات البشرية السلف (hMPCs) إلى الأنابيب العضلية

1. تحديد التقاء hMPC باستخدام البروتوكول في القسم 5.1. للتمييز بين hMPCs في الأنابيب المتوسطة، من المثالي أن تكون الخلايا 80-85٪ متانة كما تحددها وظيفة الالتقاء على مقياس الخلايا التصويري (انظر القسم 5). إذا تم استخدام hMPCs من أكثر من جهة مانحة فريدة من نوعها، فإن مسح التقاء يسمح للخلايا من مختلف الجهات المانحة بالبدء في التمايز في الوقت الذي تصل فيه إلى التقاء.
   ملاحظة: في التقاء 80٪ ، وهناك ما يقرب من 66،000 خلية / سم².
2. غسل الخلايا 2X مع وسائل الإعلام التمايز (97٪ لحم الخنزير F12، 2٪ مصل الخيول، 1٪ البنسلين / العقديات، درجة الحموضة 7.4، مرت من خلال مرشح 0.22 درجة مئوية).
3. الحفاظ على الخلايا في وسائط التمايز طالما أن التجربة تملي أثناء تبديل الوسائط يوميًا.
4. يقيّم مباشرة تكوين الثيوتوب عن طريق التلطيخ المناعي للسلسلة الثقيلة من الموسين الجنيني، والتي عادة ما تكون قابلة للكشف بعد 7-10 أيام من التمايز.
   ملاحظة: قد يختلف الوقت اللازم لتشكيل الأنابيب الأنبوبية قليلاً تبعاً للمتبرع وعدد الخلايا عند بدء التمايز؛ ولذلك، يوصى برصد الثقافات من كل جهة مانحة على حدة.

النتائج

يمكن الاطلاع على نتائج قياس التدفق التمثيلي لعزل hMPC عن أنسجة العضلات البشرية في الشكل 1. ويمكن تحديد hMPCs من خلال الأحداث التغرير الأولى على أساس التشتت الجانبي والتشتت إلى الأمام للقضاء على الخلايا الميتة أو الحطام، تليها اختيار الخلايا السلبية فقط ل7-AAD وبالتالي قابلة للحياة. يمثل تحديد الخلايا الإيجابية لكل من علامات سطح الخلية CD56 و CD29 مجموعة hMPC. توفر خزعة 60 ملغ فقط حوالي 75-250 hMPCs.

المناقشة

HMPCs الأولية هي نموذج بحثي مهم يستخدم لفهم بيولوجيا العضلات الهيكلية وعملية التجديد. بالإضافة إلى ذلك، hMPCs لديها القدرة على استخدامها للعلاج. ومع ذلك، هناك تحديات معترف بها في استخدام hMPCs الأولية لكل من البحث والعلاج، بما في ذلك الفهم المحدود للخلايا المشتقة من البشر¹⁰. وهناك أيضاً قدر كبير من التباين في القدرة على التوسع فيما بين ثقافات المانحين، مما يحد من إمكانية استخدام مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية ويمكن أن يؤثر على نتائج البحوث¹¹. على سبيل المثال، فقد ثبت م...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.25٪ تريبسين ، 2.21 ملي مولار EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin يستخدم لإزالة h< / em>MPCs الملتصقة من أوعية زراعة الخلايا
زراعة الخلايا 10 سم	VWR	664160	لوحات تستخدم لزراعة h< / em>MPCs
15 مل أنبوب فالكون		فالكون 352196	15 مل أنابيب مخروطية تستخدم في جميع أنحاء بروتوكولات عزل واستزراع h< / em>MPC
24 لوحة ثقافة خلية البئر	Grenier Bio-One	662 160	لوحة تستخدم لزراعة h< / em>MPCs
7-AAD حل تلطيخ الجدوى	eBioscience	00-6993-50	بقعة الجدوى لتحديد الخلايا الحية أثناء فرز FACS
Alexa Fluor 488 CD29 المضاد للإنسان ، استنساخ: TS2 / 16	BioLegend	303016	الجسم المضاد المترافق ل FACS & nbsp ؛
لوحة زراعة الخلايا السوداء المكونة من 96 بئرا	Grenier Bio-One	655079 لوحة	زراعة الخلايا ذات 96 بئرا مثالية للتصوير الفلوري باستخدام مقياس الخلايا Celigo S Celigo
S	Nexcelcom Bioscience		Imaging المستخدم لتتبع h< / em>MPC
Cell Strainer	VWR	352350	مصفاة الخلايا للتخلص من القطع الكبيرة من الحطام أثناء معالجة خزعة العضلات
الكولاجين من النوع الأول (الفئران الذيل)	كورنينج	354236	الكولاجين لطلاء ألواح ثقافة الخلايا   ؛
كولاجيناز دي	روش	11 088 882 001	يستخدم لتحلل الكولاجين والأنسجة الضامة الأخرى في أنسجة خزعة العضلات الهيكلية
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	VWR	WN182	يستخدم للحفظ بالتبريد ل h< / em>MPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	بروتياز يستخدم للهضم الأنزيمي لأنسجة
خزعة العضلات الهيكليةمسحوق النسر المعدل المتوسط منخفض الجلوكوز	من Dulbecco	31600-034	منخفض الجلوكوز DMEM لمعالجة خزعة العضلات
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS لمعالجة خزعة
العضلات EDTA ملح ثنائي الصوديوم ثنائي الهيدرات	JT Baker	4040-01 & nbsp ؛	مطلوب للمخزن المؤقت FACS
مصل الأبقار الجنيني	VWR	89510-186	مصل الأبقار الجنيني المستخدم في وسائط نمو h< / em>MPC
F12	Gibco	21700-026	الوسائط الأساسية ل h< / em>MPCs
مصل الخيول المعطل بالحرارة	جيبكو	26-050-070	مصل الحصان المستخدم في صنع h< / em>MPC وسائط
التمايز مقياس الدم	iNCyto	DHC-N0105	يستخدم لحساب الخلايا
السبات A	Gibco	A1247501	Media للحفاظ على خزعة العضلات الهيكلية صبغة الحمض النووي للأنسجة
Hoechst 33342 ، ثلاثي هيدروكلوريد ، ثلاثي هيدرات	Life Technologies	H21492	لتحديد جميع الخلايا باستخدام Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	يستخدم لمعدل التجميد المتحكم فيه ل h< / em>MPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer لعداد الخلايا الآلي
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	كاسيستس لعداد الخلايا الآلي
Moxi z Mini Automated Cell	Orflo		عداد الخلايا الآلي
Mr. Frosty Frozen Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	حاوية تجميد الخلايا ذات المعدل الخاضع للرقابة المتوفرة
تجاريا مصل الماعز العادي (10٪)	الماعز Thermo Fisher Scientific	50062Z	المستخدم في FACS Buffer
PE-Cy7 ماوس مضاد للإنسان CD56 ، استنساخ: B159	BD Pharmingen	557747	جسم مضاد مترافق ل FACS & nbsp ؛
البنسلين / الستربتومايسين 100x محلول	Corning	30-002-CI	المضادات الحيوية المضافة إلى وسائط
الثقافة صبغة الحمض النووي بروبيديوم يوديد	Thermo Fisher Scientific	P3566	لتحديد الخلايا الميتة باستخدام عامل
نمو الخلايا الليفية البشرية المؤتلف	Promega	G5071	في h< em> MPC لمنع التمايز
التلقائيوسط تجميد ثقافة الخلية الاستردادية	Gibco	12648-010	الوسائط المستخدمة في تبريد ملاط خزعة العضلات
بيكربونات الصوديوم	فيشر Scientific	S233-3	تمت إضافته إلى أنابيب Ham's F12
المستديرة المعقمة 5 مل	VWR	60818-565	الأنابيب المستخدمة ل FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	حبات التعويض معايرة تدفق إعدادات FACS