في هذه الطريقة، نقوم بتحديد التقارب الملزم للبروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs) إلى مواقع ربط الكُونات وغير الكونيات باستخدام اختبار مراسل بسيط ومباشر في الخلايا البكتيرية. ويستند هذا القول على قمع جين مراسل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اختبار لتحديد كمية البروتين-RNA الربط في البكتيريا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في خطوة بدء ترجمة البروتين، يرتبط الريبوسم بمنطقة بدء mRNA. يمكن حظر بدء الترجمة عن طريق ربط بروتين ملزم الحمض النووي الريبي (RBP) إلى منطقة بدء mRNA، الذي يتداخل مع ربط ريبوسم. في الطريقة المعروضة، نستخدم هذه الظاهرة حجب لتحديد مدى التقارب ملزمة من RBPs إلى مواقعها ملزمة cognate وغير cognate. للقيام بذلك، نقوم بإدراج موقع ربط اختبار في منطقة بدء mRNA مراسل والحث على التعبير عن RBP الاختبار. وفي حالة ربط RBP-RNA، لاحظنا قمعاً السينياً للتعبير الصحفي كدالة لتركيز الممارسات التجارية التقييدية. وفي حالة عدم وجود تقارب أو تقارب منخفض جداً بين الموقع الملزم والممارسات التجارية التقييدية، لم يلاحظ أي قمع كبير. يتم تنفيذ هذه الطريقة في الخلايا البكتيرية الحية، ولا تتطلب آلات مكلفة أو متطورة. ومن المفيد تحديد الخصائص والمقارنة بين أوجه التقارب الملزمة لمختلف الممارسات التجارية التقييدية التي تعمل في البكتيريا إلى مجموعة من مواقع الربط المصممة. قد يكون هذا الأسلوب غير مناسب للمواقع الملزمة ذات التعقيد الهيكلي العالي. ويرجع ذلك إلى إمكانية قمع بدء ريبوسومال من قبل هيكل MRNA معقدة في غياب RBP، مما يؤدي إلى التعبير الجيني مراسل القاعدية أقل، وبالتالي قمع مراسل أقل ملاحظة على ربط RBP.
المقدمة
وقد تمت دراسة اللوائح القائمة على البروتين الملزم للRNA (RBP) بعد النسخ، وعلى وجه التحديد توصيف التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية والحمض النووي الريبي، على نطاق واسع في العقود الأخيرة. هناك أمثلة متعددة من التنظيم أسفل الترجمة في البكتيريا الناشئة من RBPs تثبيط،أو تتنافس مباشرة مع، الريبوسم ملزمة 1،2،3. في مجال البيولوجيا التركيبية، تظهر تفاعلات RBP-RNA كأداة هامة لتصميم الدوائر الوراثية المستندة إلى النسخ4و5. ولذلك، هناك زيادة في الطلب على توصيف هذه التفاعلات بين الممارسات التجارية التقييدية والحمض النووي الري....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد النظام
- تصميم بلازميدات الموقع الملزم
- تصميم شريط كاسيت موقع الربط كما هو موضح في الشكل 1. كل المينيجين يحتوي على الأجزاء التالية (5' إلى 3'): Eagl موقع تقييد، و40 قواعد من 5 ' نهاية كانامايسين (كان) الجينات المقاومة، pLac-Ara المروج، موقع ربط ريبوسم (RBS)، AUG من الجين mCherry، فاصل (δ)، موقع ربط RBP، 80 قواعد من نهاية 5 ' من الجين mCherry، وموقع تقييد ApaLI.
ملاحظة: لزيادة معدل نجاح الاختبار، قم بتصميم ثلاثة أشرطة فيديو موقع ربط لكل موقع ربط، مع فواصل تتكون من قاعدة واحدة واثنين وثلاث قواعد على الأقل. راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على مزيد من المبادئ التوجيهية.
- تصميم شريط كاسيت موقع الربط كما هو موضح في الشكل 1. كل المينيجين يحتوي على الأجزاء التالية (5' إلى 3'): Eagl موقع تقييد، و40 قواعد من 5 ' نهاية كانامايسين (كان) الجينات المقاومة، pLac-Ara المروج، موقع ربط ريبوسم (RBS)، AUG من الجين mCherry، فاصل (δ)، موقع ربط RBP، 80 قواعد من نهاية 5 ' من الجين mCherry، وموقع تقييد ApaLI.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تستخدم الطريقة المعروضة المنافسة بين RBP والريبوسوم لربط جزيءmRNA (الشكل 1). وتنعكس هذه المنافسة من خلال انخفاض مستويات mCherry كدالة لزيادة إنتاج RBP-mCerulean، وذلك بسبب زيادة تركيزات المحفز. في حالة زيادة الفلورة mCerulean، مع عدم وجود تغييرات كبيرة في mCherry، يتم استنتاج عدم وجود ربط RBP. ويبين الشكل 2النتائج التمثيلية لكل من السلالة الإيجابية والسلبية. في الشكل 2A، يتم تقديم OD، mCherry، وmCeru.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الموصوفة في هذه المقالة يسهل القياس الكمي في الجسم الحي من تقارب ربط RBP-RNA في خلايا القولونية E. والبروتوكول سهل نسبيا ويمكن إجراؤه دون استخدام آلية متطورة، وتحليل البيانات واضح. وعلاوة على ذلك، تُنتج النتائج على الفور، دون وقت الانتظار الطويل نسبيا المرتبط بنتائج الجيل التالي من التسلسل.
أحد القيود على هذه الطريقة هو أنه يعمل فقط في الخلايا البكتيرية. ومع ذلك، أظهرت دراسة سابقة12 تأثير القمع باستخدام نهج مماثل للRBP L7AE في خلايا الثدييات. وهناك قيود.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تلقى هذا المشروع تمويلا ً من برنامج I-CORE التابع للجنة التخطيط والميزنة ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 152/11)، والمنحة رقم ماري كوري لإعادة الإدماج. PCIG11-GA- 2012-321675، ومن برنامج أبحاث وابتكار أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 664918 - MRG-Grammar.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ملح أمبيسلين الصوديوم | SIGMA | A9518 | |
| كبريتات المغنيسيوم (MgSO4< / sub>) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 لوحة | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane لوحات | Axygen | RESMW8I | |
| 96 بئرا | ألواح Axygen | P-DW-20-C | |
| 96 بئر لقارئ الألواح | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| تسلسلات موقع الربط | Gen9 Inc. و Twist Bioscience | انظر الجدول 1 | |
| E. القولوني< / em> خلايا TOP10 | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| حاضنة | TECAN | liconic | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| نظام آلي لمعالجة السوائل | TECAN | EVO 100 ، MCA 96 | |
| قناة برنامج تحليل Matlab | Mathworks | ||
| متعدد الماصات 8 حارات | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4< / sub>-HSL) | كايمان | K40982552 019 | |
| PBS عازلة | للصناعات البيولوجية | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | انظر الجدول 2 |
| كلوريد الصوديوم (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| جل ونظام تنظيف PCR | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
المراجع
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
